紅樹植物根際促生固氮菌(dzy-n56)及其應用的製作方法

2023-04-25 23:25:41 1

專利名稱：紅樹植物根際促生固氮菌(dzy-n56)及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及一種對紅樹林植物具有良好促生效果紅樹林根際固氮菌及 其製備生物固氮菌肥的應用。
背景技術：
紅樹林為自然分布於熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，覆蓋大約60-75%熱帶和亞熱帶 海岸，對維護海灣河口的生態平衡起重要作用，是海洋生產力的重要組成部分(Holguineta1.,2001)， 被認為是具有較高生產力的生態系統。該生態系統具有較高的有機質水平(全球每年凋落物為100Tg C)，為毗連的沿岸水域和相關的生物群落生境提供有機物(Holguin et al., 2001; Lugomela and Bergman, 2002)。然而紅樹林生態系統的無機營養較貧乏，尤其是無機氮水平較低(Holguin et al.， 1992; Vazquez etal.,2000)，固氮生物的生物固氮被證明是紅樹林生態系統無機氮的主要來源(Hicks and Sylvester, 1985; Kyaruzi etal 2003)。生物固氮作為紅樹林生態系統和生源元素生物地球化學循環的重要環節， 對紅樹林生態系統及生態環境產生極大的影響。由於人類的過度開發、圍海造地和都市化等行為，使全球的紅樹林正以驚人的速度減少，據聯合 國糧農組織保守的數據估算，紅樹林正以每年平均減少1-2%的速度消失，其速度甚至超過了珊瑚礁 和熱帶森林的消失速度。在發展中國家中，消失的速度更快，而紅樹林的90%以上位於發展中國家。 美國紅樹林行動項目組負責人Aheredo (1999)認為，熱帶亞熱帶國家曾在3/4的海岸線上分布有紅 樹林，現在僅剩下不到一半，而且大部分紅樹林為嚴重退化的生態系統。科學家預言，如果任其發展， 在未來的近100年內，人類將徹底失去紅樹林(Duke， 2007)。近年來，紅樹林生態系統的維護和紅樹林植株的保育等研究成為熱門研究領域，也有多個國際組 織和團體發起的旨在保護紅樹林的國際會議。《中國21世紀議程》(1994)優先項目計劃中把紅樹 林恢復與重建技術納入了議事日程。ITTO組織，2002-2006年的計劃目標亦把紅樹林生態系統恢復列 為首要資助目標之一 (廖寶文，2005)。可見紅樹林溼地生態系統的恢復工作亟需我們大力開展，但 無論理論的研究還是實際恢復工作的開展都面臨較大困難。紅樹林的恢復建設工作一直比較緩慢，這主要是由於紅樹林造林成活率極低(廖寶文，1999)。 墨西哥和印度等國家的科學家利用植物生長促生菌(PGPB, plant growth-promoting bacteria)對紅樹 林進行促生，取得了一定階段性進展，但發現的適合紅樹林促生的菌種仍為少數，此類菌種依舊缺少 且多數被保密收藏。目前中國林業科學研究院熱帶林業研究所正與墨西哥西北生物研究中心合作，引進相關菌種對我 國主要紅樹植物進行接種測試和相關菌劑研究，以期解決我國灘涂地段紅樹林造林成活率極低的棘手 問題。然而，引進菌種在我們國家紅樹林中的成活率小，並且也存在外種入侵所會產生的各種隱患。

發明內容
本發明的目的是提出一株從中國熱帶紅樹林中篩選分離，具有較高的生物固氮活性的紅樹植物根 際促生固氮菌新種。本發明的另一目的是提出所述的紅樹植物根際促生固氮菌在製備生物固氮菌肥的應用。 本發明所提出的紅樹植物根際促生固氮菌，是從海南省三亞市的熱帶紅樹林區採集紅樹植物根際 沉積物樣品中分離出來的固氮菌新種。其分類命名為鞘氨醇單胞菌屬(印/H"go附oMos sp.) DZY-N56。 該菌於2007年7月28日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC，地址中國武漢市武漢大學)， 保藏編號CCTCCNO: M207120。本發明所述菌種的菌學特性描述如下革蘭氏陰性，杆狀，不產生孢子，0.2-0.4x1.6-2.5nm，細胞單個，也有較少成對(圖l-3)。氧化 酶反應陰性，接觸酶陽性，好氧或兼性厭氧。在Ashby、 LB以及BUG培養基上生長良好。耐鹽性較 好，可以在鹽分為5%的培養液中正常生長。在Ashby培養基上經過10d左右培養可以長為直徑l-2cm 左右，胡蘿蔔色、圓形、邊緣整齊表面較為乾燥的凸起菌落。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用 N2作為氮源，具有較高的生物固氮活性，純培養條件下，其固氮活性20-74umolC2H2h"mg"鮮重。從菌株(印/H'"go"w"os sp.) DZY-N56的純培養物提取基因組DNA，運用固氮基因特定的引物 PolF/PolR (參考Poly et al., 2001)進行PCR擴增，擴增到較理想的目的條帶，證明該菌株具有生物 固氮基因(圖4)，其序列如SEQ2所示。運用細菌16S rDNA全序列通用引物16SF/16SR (參考 Weisenburgetal.， 1998)進行PCR擴增，通過測序分析得到16S rDNA序列，該菌株的16SrDNA的 全序列如SEQ1所示。通過GenBank中的BLAST軟體將16S rDNA序列與GenBank資料庫中的序列 進行比對，在資料庫中沒有找到完全相似的序列，表明為首次發現的新基因序列。向基因庫成功遞交 新基因序列得到登錄號為EF202991。在GenBank資料庫中選取了部分與測定的16S rDNA序列相似性較高的代表性基因序列，通過 ClustalW軟體和Mega軟體以Neibor-joining方法構建系統進化樹(圖5)，進行系統發育分析。從系 統發育樹(圖5)可以看出與(5^/"gowo"ossp.) DZY-N56的16SrDNA序列與鞘氨醇單胞菌 S/^/"gowo"aspa朋/(AJ575818,2)同源性最相近，為97% (Query coverage為96%)。生理生化、BIOLOG 等結果進一步顯示這兩種菌有明顯區別(如表l)。這表明菌株(5^ >zgomo"a$sp.) DZY-N56為一株 新的固氮菌種。表1 5^/w力gowowoy/ a朋/禾口 S^/z/wgo附owoy sp. strain DZY-N56兩禾中細菌指標比較(+ :表示陽性反應；-:表示陰性反應)TestDZY陽N56Pigmentation Growth at 37 °CHydrolysis of bis-pNP phosphateN-Acetyl-D-glucosamineL-rhamnoseD-fructoseSucroseD陽cellobioseL-alanineYellow ++Yellow++ + + +4L畫Arabinose—+D-Galactose—+D-Maltose(+)+L-proline(+)+D-Mamiose(+)+D-trehalose(+)+L-Histidine——注S^/u"gcwo""j ; a/7"〖(AJ575818.2)的菌種性質參考Hans-Jiirgen Busse，2005文章Description of two novel species, iS/ /2/"gyww7"j "6a"' sp.nov.and *Sp/ '"go/woW(iy戸朋/ sp.nov. DZY-N56數據為BIOLOG細菌自動分析儀數據。用iS^W"gowowos sp, DZY-N56處理兩種紅樹，木欖(5n/gw/eragy附"oWz/2a)和紅海欖(及/^op/rora j(y/ora)，結果如表2所示。表2 >S^ >;go/noMav sp. DZY-N56對木欖和紅海欖肝處理45天後的影響主根長度(cm)根生物量(g)葉面(cm2)地上(g)chl-achl-b總葉綠素類胡蘿蔔素木欖11,930.6419.012.281.250.6118.490.51對照8.010.357.521.780.820.319.680.18紅海欖11.260.3145.531.371.390.7220.930.4對照10.30.5431.461.990.880.2919.10.32注表中值均為10組平行樣平均值。生物量中重量指溼重；剩下重量均指乾重。從表2中我們可以看出該菌對於木欖和紅海欖有著良好的促生作用。和對照組相比，木欖的葉面 積有著明顯的增大，提高幅度為152%;類胡蘿蔔素的含量也顯著增加，為對照組的3.5倍。光合色素含量也有所增加，葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素分別增長了 52%、 96%、和91%。對於紅海欖效 果則不如木欖明顯，葉面積增加了44%，光合色素中葉綠素增加了 148%。對該菌株進行生物安全性實驗，土壤接種法結果表明，在室溫條件下(28'C左右)，溼度60%—75% 條件下，該菌發酵液對海欖、紅海欖、木欖等均無致病能力，對紅樹植物的生長安全無害。同時通過 用平板分離法檢測供試菌株檢出率、土壤原位固氮酶活性變化等指標，結果顯示該菌接種後可以繼續 存活，可以顯著促進土壤固氮酶活性增加。實驗證明，用含有該菌的菌劑接種海欖、紅海欖和木欖等 紅樹植物可以明顯促進植株生長，因此，該菌可以作為製備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應 用。本發明將在以下方面產生有益效果該菌對於紅樹林植物的促生效果較好，可用於自然紅樹林生 態系統菌肥的生產工程菌，提高紅樹林生態系統的生產力，有望用於紅樹林恢復、造林的艱巨任務中。


圖1、圖2、圖3是5^/"gomo"as sp. DZY-N56菌落、掃描、透射電鏡照片；圖4是印W"go/nowas sp. DZY-N56的基因組DNA以及擴增到的16S rDNA和固氮基因w;/ /的電泳照 片；圖5是印WwgomoM^ sp. DZY-N56在16S rDNA系統發育樹中位置。
具體實施方式
一、材料與方法1、 材料1.1 土樣採集樣品採自海南省三亞市紅沙河沿岸紅樹林區木欖(份wg^ragv柳oA^)根際沉積物，樣品採集 後裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實驗室低溫保存。 1.2培養基Ashby液體培養基甘露醇10.0g，KH2PO4'H2O0.2g , MgS04'7H20 0.2g， NaCl 0.2g， CaS04 O.lg, CaCO35,0g，去離子水1000mL， pH7.0。Ashby固體培養基Ashby液體培養基+2.2%瓊脂。改良DC)bereiner無氮液體培養基蔗糖10g,蘋果酸5.0g, K2HP04-H20 O.lg， KH2P04'H20 0.4g， MgS04.7H20 0,2g， NaClO.lg， Na2M。04'H20 0.002g, FeC13 O.Olg，去離子水lOOOml， pH7.0。LB培養基酵母提取物5g，胰蛋白腖10g， NaC110g，瓊脂1-2%，去離子水lOOOml, pH7.0。2、 方法2.1菌種分離將樣品混勻後取約lg於200ml Ashby、D6bereiner或者Ashby+D6bereiner無氮液體培養基(Ashby 培養基與DObereiner培養基以1: 1比例混合)中，30'C恆溫48h進行加富培養。然後將菌液分別稀 釋至10—4、 10-5、 10-6三個稀釋度,各稀釋度的菌懸液以塗布法接種於Ashby固體培養基上，30°C 48h 培養後選擇典型的單一菌落進一步純化。 2.2菌種純化將分離出的菌落，用接種針挑取典型的單一菌落，經塗片染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態，如所 分離的菌落不純，應做系列稀釋後再次用平板塗布法分離，直至獲得純種。將純化後的菌株接種於無 氮Ashby固體培養基和LB全培養基甘油保存。 2.3液體培養中固氮酶活力測定採用乙炔還原法測定固氮活性(參考Capone 1993),將斜面保存的純菌株接種於10 ml液體改 良DObereiner培養基內，於30'C搖床振蕩培養72 h，分別取1 ml於滅菌的5 ml小瓶中，蓋上橡皮塞。 用注射器從容器中抽走5%空氣，然後加入相同體積的乙炔氣體。每個樣品設3個重複，1個空白對 照，對照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品於3(TC孵育12 h，用SQ-204氣相色譜檢測乙烯的生成量。 乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養條件下平 均固氮活性為20-74umolC2H2h—1 mg"鮮重。 2.4 DNA的提取與純化方法參考東秀珠《常見細菌系統鑑定手冊》P409。2.5A^ /基因的擴增採用固氮細菌的niffl基因通用引物PolF/PolR (參考Poly et al., 2001)進行PCR擴增PolF: 5'-TGCGA (C/T) CC (G/C) AA (A/G) GC (C/G/T) GACTC-3'， PolR: 5'-AT (G/C) GCCATCAT(C/T) TC (A/G) CCGGA-3'。 經過多次實驗後建立的適宜的反應體系和反應條件如下 PCR反應體系包括 PCR反應程序是提取的模板(未稀釋)1 pl預變性95 °C 5 min上、下遊引物(1 mM)各1^1變性95 °C 30 s10xPCR緩衝液5^1退火55°C 30 sMgCl2 (25 mM)4^1延伸72 °C 40 sdNTP混合液(各10mM)1H1後延伸72°C 10 min牛血清白蛋白(5mgml-l)1^1Ex-Taq酶(5Upl-l)0.4 pi無菌水34總討.50 pi30個循環取2pl PCR反應產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩餘的PCR產物直接交與Invitrogen生物技 術有限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系統測序。得到332 bp的nifH序列。將序列直接遞交 Genbank資料庫，序列號為EU707338。 2.6 16SrDNA全序列的擴增DNA提取與純化見方法見東秀珠《常見細菌系統鑑定手冊》P409。採用細菌16SrDNA全序列通 用引物16SF/16SR (Weisenburg et al., 1998), 16SF: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，， 16SR: 5 '-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ，，進行PCR擴增。經過多次實驗後建立的適宜的反應體系和反應條件如下 PCR反應體系包括 PCR反應程序是提取的模板(未稀釋)1 pi預變性95 °C 5 min上、下遊引物(ImM)各1^1變性95 °C 30 slOxPCR緩衝液5 nl退火55 °C 30 sMgC12 (25 mM)4^1延伸72 °C 1 mindNTP混合液(各10mM)1 pi後延伸72°C 10 min牛血清白蛋白(5mgml-l)1 piEx-Taq酶(5Upl-l)0.4 pi無菌水34 pi總計50 pi30個循環取2pl PCR反應產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩餘的PCR產物直接交與Invitrogen生物 技術有限公司用ABI Prism 3730 XL DNA分析系統測序。得到的16S rDNA序列。將序列直接遞交 Genbank資料庫，序列號為EU707337。利用DNAMAN軟體對測序結果進行同源性比較，利用BLAST軟體將測定得到的基因序列與GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)資料庫進行序列比對分析，獲取相近 典型菌株的16S rDNA基因序列，然後利用BIOEDIT中的ClustalW對序列進行排列，利用Mega中 的鄰接法(Neighbor-Joining)建立16S rDNA基因的系統發育樹，進行系統發育分析，其中的遺傳距 離用Tamura-Nei公式計算，枝長代表了分歧程度，各枝上的數字是1000次bootstrap重抽樣分析的支 持百分比。2.7菌株製劑有效性試驗將該菌(5^/H力gowowajsp. DZY-N56)接種到無氮Ashby液體培養基中，直至濃度為108cell/ml，待用。採用2種紅樹植物一木欖和紅海欖進行盆栽實驗。每種紅樹10個平行樣。外加對照。塑料盆放 在露天條件下，用已準備好的菌液浸泡紅樹根部3-4h後栽種入塑料盆。45天後測量各個指標。對比 實驗指標為植物根、葉面積、植株重量、光合色素等。實驗結果如表2所示。序列表中國科學院南海海洋研究所紅樹植物根際促生固氮菌(DZY-N56)及其應用211412DNA鞘氨醇單胞菌屬(5^H'"gomowassp.) DZY-N56 1TCGCCCTCGTCGTCATAGGTGGGATCACTCATGTCAAGTCGAACGAAGCCTTCGGGCTTA60GTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTTGGTTCGGAATAACAGTTGGAA120ACGACTGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCAGAGGATGAGCCC180GCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTC240TGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC300AGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAA360GGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAG420CCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAA■TTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTTAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTT540AACTCCAGAACTGCCTTTAAGACTGCATCGCTTGAATCCGGGAGAGGTGAGTGGAATTCC600GAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACT660GGACCGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGG720TAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGGACTTGGTCTTTGGGTGGCGCA780GCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAAT840TGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACC900TTACCAGCGTTTGACATGTCCGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACT960GGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC1020GCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTAGTTGGGTACTCTAAAGGAACC1080GCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCT1140GGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTA1200ATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTTTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAA1260TCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACC1320GCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACCCGAAGGCGTTGCGCCAACCCGCAAGGGAGC1380AGGCGAACCTTTTGTGTTTTTACTTGATATCT14122338 DNA
鞘氨醇單胞菌屬(5^/H'"gomo"assp.) DZY-N56

CDS
2
TTGCGATCGA TCCCAAAGCG GACTCGACCC GCCTGATCTT GCACGCGAAG GCTCAGGACA 60 CCATCTTGTC GCTGGCCGCT GAAGCTGGTT CGGTGGAGGA CCTCGAACTG GAAGACGTGA 120 TGAAGGTCGG GTACCGCGAC ATCCGTTGCG TGGAATCCGG TGGCCCTGAG CCTGGGGTGG 180 GCTGCGCCGG CCGCGGCGTG ATCACTTCGA TCAACTTCCT GGAAGAAAAC GGCGCCTACG 240 AAGGCGTGGA CTATGTGTCC TACGACGTGC TGGGCGACGT GGTGTGCGGT GGCTTTGCCA 300 TGCCCATCCG TAGAACAAGC ACATGCATCT GCCCGCCC 338
權利要求
1、一種紅樹植物根際促生固氮菌，該菌是從熱帶紅樹林區的紅樹植物根際沉積物樣品中篩選分離出來的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)DZY-N56，含有如SEQ1所示的16Sr DNA序列和固氮基因nifH，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM207120。
2、 根據權利要求1所述的紅樹植物根際促生固氮菌，其特徵在於該菌所含的固氮基因wy /含有如SEQ2所示序列。
3、 權利要求1所述的紅樹植物根際促生固氮菌在製備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應用。
全文摘要
本發明提供一種紅樹植物根際促生固氮菌(DZY-N56)及其應用，該菌是從熱帶紅樹林區紅樹植物根際沉積物樣品中篩選分離出來的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)DZY-N56，含有固氮基因nifH和如SEQ1所示的16S rDNA，該菌保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM207120。該菌種具有較高的生物固氮活性，用含有該菌的菌劑接種海欖、紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進植株生長，因此可以作為製備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應用。
文檔編號C12R1/01GK101319198SQ20081002895
公開日2008年12月10日 申請日期2008年6月23日 優先權日2008年6月23日
發明者娟 凌, 張燕英, 斌 楊, 楊志浩, 田新鵬, 董俊德 申請人:中國科學院南海海洋研究所