Itr同向排列的aav載體構建及其應用的製作方法

2023-04-25 10:09:46

專利名稱：Itr同向排列的aav載體構建及其應用的製作方法
ITR同向排列的AAV載體構建及其應用本發明屬於生物技術發明領域。本發明具體涉及一種ITR同向排列的AAV載體PSDAV2，該表達載體主要由兩個同向排列的AAV2的ITR、篩選基因表達框和外源基因表達框組成，其中外源基因表達框中含有多克隆位點MCS，用於表達外源基因的插入。將報告基因插入PSDAV2載體，篩選獲得細胞株，利用「一個細胞株/ 一株輔助病毒」策略包裝重組AAV病毒，發現ITR同向排列不僅能夠明顯提高包裝獲得重組AAV病毒中雙鏈AAV病毒的比例，還能增強包裝攜帶基因的體內外表達效率。總之，本發明提出並構建了一種ITR同向排列的AAV載體，為重組AAV病毒的包裝特別是重組雙鏈AAV病毒的包裝提供了新的選擇。背景腺相關病毒(Adeno-associatedvirus, AAV)屬於微小病毒科(Parvovirus),其基因組為一條單鏈DNA分子。AAV是依賴性病毒,需要其它病毒如腺病毒或單純皰疫病毒，或輔助因素提供輔助功能才能複製。在沒有輔助病毒存在時，AAV感染細胞後其基因組將 整合到細胞染色體中成為潛伏狀態,而不產生子代病毒。目前已發現多種AAV病毒，從基因組組成和血清學上可以分為不同的亞型(WuZJ, Asokan A, Samulski RJ. Adenoassociated virus serotypes vector toolkit forhuman gene therapy. Mol Ther, 2006,14 (3) :316-327.)。雖然不同的基因組亞型之間，核苷酸序列存在一定的差異，但不同亞型之間的基因組大小和結構是相似的。以AAV2為例，其基因組大小為4675nt,分為反向末端重複序列(Inverted terminal repeat, ITR)區、rep基因區和cap基因區。ITR區為基因組5』和3』末端兩個長度為145nt的反向末端重複序列，包含AAV2基因組的複製起點，與AAV2複製、整合或包裝等功能相關，為AAV2病毒基因組中的順式作用元件。rep基因區和cap基因區為兩個功能基因區，編碼AAV2生活周期中需要的各種調節蛋白和結構蛋白，為AAV2產毒性複製提供各種反式作用因子。rep基因區編碼AAV複製和病毒基因表達等所必需的調節蛋白，根據分子量大小的不同可分為R印78、R印68、R印52、R印40等4種形式。cap基因區編碼3種結構蛋白，VP1、VP2、VP3，共同組裝成AAV病毒的外殼。AAV是基因治療的理想載體之一。大量的高質量的重組AAV(Recombinant AAV,rAAV)病毒的製備是AAV載體用於基因治療的前提和基礎。rAAV病毒製備的過程中主要解決的3個問題是，AAV載體質粒的設計和構建，各種反式作用因子(即RP和cap基因編碼的各種蛋白)的反式提供和輔助病毒的選擇和提供。針對這3個問題，不同的研究者提出了不同的解決方案，形成了多種rAAV病毒的製備系統。目前國際上普遍採用的是Xiao (XiaoX,Li J,Samulski RJ. Production of high—titer recombinant adeno-associated virusvectors in the absence of helper adenovirus. J Virol, 1998, 72 (3) :2224-2232.)等提出的三質粒共轉染系統。這三個質粒分別為AAV載體質粒,rep-cap表達質粒和輔助質粒。三個質粒分別解決rAAV病毒製備過程中的3個問題。AAV載體質粒包含AAV2的兩個ITR序列，且在兩個ITR之間插入外源啟動子、多克隆位點和polyA加尾信號序列，用於外源表達基因的克隆。rep-cap表達質粒通過編碼和表達MV病毒產毒性複製的各種調節蛋白和結構蛋白，反式提供rAAV病毒包裝過程中所需的各種因子。輔助質粒攜帶了 5型腺病毒的E2A、E40RF6和VA RNA基因，可替代腺病毒，為rAAV病毒的產毒性複製提供輔助功能。在國內rAAV病毒製備應用較為廣泛的方法為兩個中國專利(專利號98120033.8,99119038. 6)組合報導的「一種病毒感染一個載體細胞株」法系統。專利(專利號98120033. 8)報導了一種攜帶rep-cap基因表達框的I型單純皰疫病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV1),這株病毒不僅具有輔助病毒的功能，還可以反式提供各種rAAV病毒產毒性複製所需的各種反式作用因子。專利(專利號99119038.6)則報導了一系列通用型腺相關病毒載體，應用這些載體可以構建穩定攜帶AAV載體的細胞株，將專利(專利號98120033.8)中的輔助病毒感染AAV載體細胞株，製備獲得大量的rAAV病毒。這些rAAV病毒製備系統的提出促進了 AAV載體在基因治療等領域中的應用。但由於AAV病毒本身基因組為單鏈DNA分子，因此AAV病毒進入細胞後，需要先合成其互補鏈才能開始攜帶的外源基因的表達，導致外源基因表達的延後和效率降低，限制了 rAAV載體的進一步應用。scrAAV(Self comp I ementary rAAV)載體製備系統的提出解決了這一問題。通過缺失AAV載體中一個ITR的TRS (Terminal resolution site)序列，導致Rep蛋白不能對缺失TRS的ITR進行切割，因此包裝獲得rAAV病毒攜帶兩個正常的ITR、缺失d序列的ITR和完全互補的外源基因表達框的兩條單鏈(在rAAV 5000nt包裝容量允許的範圍內)， 獲得自身基因組可互補的rAAV(scrAAV)載體。scrAAV載體進入細胞後其基因組可以自身互補配對形成雙鏈，不依賴於細胞合成其互補鏈，提高攜帶外源基因的表達速度和效率。雖然由於rAAV包裝容量(不大於5000nt)的限制，scrAAV可攜帶的外源基因的表達框的大小不能大於2500bp,限制了 scrAAV載體對某些較大外源基因表達框的攜帶,但是scrAAV可以顯著地提高外源基因的表達效率，降低其在基因治療中的用量，因此scrAAV載體在基因治療中，特別是以較小基因(如hFIX、siRNA、miRNA和核酶等)為導入基因的基因治療中仍具有廣泛的應用前景。而且，近年來一些較小高效的順式作用元件(如啟動子、加尾信號等)的出現，有效地降低了其在外源基因表達框中的所佔容量，擴大了 scrAAV載體可攜帶外源基因的長度。由於R印蛋白不能完全識別並切割ITR中的TRS序列，因此當rAAV載體攜帶的外源基因表達框小於2500bp時，包裝獲得的rAAV載體也存在一定比例的scrAAV，但比例小於50%。為了提高包裝獲得rAAV載體中scrAAV的比例，常採用的策略是降低包裝系統中的Rep蛋白表達量和對ITR中的TRS序列進行突變操作。在三質粒包裝系統中，常採用將Rep基因的起始密碼子由「ATG」突變為「ACG」和啟動子遠離R印基因的方法降低R印蛋白的表達水平。對ITR中TRS序列的突變操作則為對TRS序列中的D序列進行點突變和缺失突變，使R印蛋白不能識別。經過這些改造，利用三質粒包裝系統獲得scrAAV載體的比例可達90%以上。雖然降低Rep基因的表達水平可以提高包裝獲得載體中scrAAV載體的比例，但是在不影響外源基因表達的情況下，改變ITR的結構使R印蛋白不能識別，仍然是顯著提高包裝獲得scrAAV載體比例的重要策略之一。ITR是AAV病毒中重要的順式作用元件，在AAV病毒基因組的複製、AAV病毒顆粒的包裝等過程中都發揮作用。而且在天然狀態下，AAV病毒基因組的兩個ITR反向排列，這種排列方式保證了其基因組複製過程中的精確性和AAV病毒基因組整合入細胞基因組後的有效拯救。目前，常用的AAV載體都將兩個ITR反向排列，並在兩個ITR序列之間插入外源基因表達框。相反，在本發明中，我們提出了一種新的AAV載體即ITR同向排列的AAV載體，並在同向排列的兩個ITR之間插入外源基因表達框。我們的研究表明ITR同向排列的AAV載體不僅不會影響rAAV病毒載體的包裝和外源基因的體內外表達還可顯著提高包裝獲得rAAV病毒中scrAAV載體的比例，為scrAAV載體製備提供了一種新的選擇。同時，本發明提出的ITR同向排列的AAV載體，只是改變了原類型AAV載體中ITR的排列方向，並未對ITR的序列進行突變等操作，而是利用AAV病毒拯救複製過程中產生缺陷的ITR，使R印蛋白在包裝過程中不能切割，從而提高獲得rAAV病毒中scrAAV載體的比例。利用AAV病毒本身的拯救複製機制，減少了操作的複雜性，使scrAAV載體的構建過程變得更加簡單、方便。發明概述
本發明的第一個技術特徵是構建了一種兩個ITR同向排列的AAV載體pSDAV2，並在兩個同向排列的ITR之間插入外源基因的表達框，表達框內攜帶多克隆位點(Multiplecloning sites，MCS)，用於外源表達基因的插入。本發明的第二個技術特徵是該載體可用於rAAV病毒的包裝製備，且可顯著提高包裝獲得rAAV病毒載體的scrAAV載體的比例，ITR的同向排列並不影響包裝獲得rAAV病毒外源基因的體內外表達特徵。本發明的第三個特徵是該載體還攜帶neo基因表達框，可用於篩選獲得穩定表達外源基因的細胞株，獲得的細胞株不僅可用於rAAV病毒載體的包裝製備還可用作外源基因的蛋白表達生產細胞株。發明詳述ITR在AAV病毒的基因組複製和病毒包裝過程中均發揮了重要作用。在天然條件下，AAV病毒基因組中的兩個ITR序列反向排列，有利於AAV病毒基因組複製的精確性。rAAV病毒包裝系統中，AAV載體中的兩個ITR序列保持了其在AAV病毒基因組中的反向排列順序。相反，本發明提出並構建了一種ITR同向排列的AAV載體pSDAV2。在該載體中，兩個ITR序列同向排列，且在兩個ITR之間插入攜帶MCS位點的外源基因表達框，獲得一種可插入外源基因的通用型表達載體PSDAV2。同時，該載體還攜帶neo基因表達框，用於篩選獲得穩定表達外源基因的細胞株，該細胞株可進一步應用於rAAV病毒的製備和外源基因的表達產物的大量製備。在本發明中，我們主要研究了 ITR同向排列對rAAV病毒包裝的影響，包括三個方面的內容1、ITR同向排列是否會影響rAAV病毒的包裝過程；2、ITR同向排列的AAV載體pSDAV包裝獲得rAAV病毒中scrAAV病毒載體的所佔比例；3、ITR同向排列對包裝所獲得rAAV病毒中外源基因的體內外表達特徵的影響。為此，我們首先合成了 AAV2的ITR序列，並在其兩端引入合適的酶切位點。然後，用合成的ITR序列替換本公司原有pAAV2neo載體中的一個ITR序列，使兩個ITR序列同向排列，同時刪除了 pAAV2neo載體中的部分冗餘序列，獲得pSDAV2。此後，我們將增強型綠色突光蛋白(Enhanced green flurocent protein, EGFP)克隆入 pSDAV2 載體,獲得PSDAV2-EGFP。將pSDAV2_EGFP轉染BHK21細胞，篩選獲得EGFP穩定表達細胞株，包裝獲得rAAV 病毒 rAAV2-EGFP』。隨後，我們用 Sourthern Blot 方法分析了 rAAV2_EGFP』中 scrAAV所佔比例，並比較分析了 rAAV2-EGFP』和rAAV2_EGFP(由原pAAV2neo載體為基本骨架，插入EGFP基因包裝獲得的病毒，參見專利申請號200910009059. 6，發明名稱AAV病毒反向感染技術及AAV病毒陣列，該申請的附圖1)的體內外表達特徵。這些結果表明ITR的同向排列不僅可以rAAV病毒的包裝和包裝獲得rAAV病毒中報告基因EGFP的體內外表達效率，還可提高包裝獲得rAAV病毒中scrAAV病毒的比例。總之，本發明提出並構建的pSDAV2載體為scrAAV病毒載體的包裝提供了一種新的選擇。


圖lpAAV2neo質粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重複序列；CMVpromoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH poly (A)是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新黴素抗性基因；Amp是氨苄青黴素抗性基因。圖2pMD18T-R-1TR質粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重複序列！promoter是原核啟動子,用於pMD18T_R_ITR中相關基因的轉錄。
圖3pSDAV2_Pre質粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重複序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH poly (A)是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新黴素抗性基因；Amp是氨苄青黴素抗性基因。圖4pSDAV2質粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重複序列；CMVpromoter是人巨細胞病毒的啟動子；BGH poly (A)是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新黴素抗性基因；Amp是氨苄青黴素抗性基因。圖5pSDAV2-EGFP質粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重複序列；CMV promoter是人巨細胞病毒的啟動子；EGFP是增強型綠色螢光蛋白基因；BGH poly (A)是牛生長激素基因的加尾信號序列；neo是新黴素抗性基因；Amp是氨苄青黴素抗性基因。圖6Southern blot 檢測包裝獲得 rAAV2_EGFP』中 scrAAV 的比例結果。Southernblot檢測包裝獲得rAAV2-EGFP』中scrAAV的比例，並與ITR反向排列的包裝獲得的rAAV2-EGFP比較。泳道I和3是rAAV2_EGFP提取基因組DNA分別上樣5 μ L和10 μ L，鹼性瓊脂糖凝膠電泳後，southern blot檢測結果；泳道2和4是rAAV2_EGFP』提取基因組DNA分別上樣5 μ L和10 μ L,鹼性瓊脂糖凝膠電泳後，southern blot檢測結果。圖7ITR同向排列AAV病毒拯救過程示意圖。本圖示意了 ITR同向排列的AAV載體整合入細胞染色體中的拯救過程。拯救過程分為9步，圖A至J中a、a』、b、b』、C、c』、d和d』分別表示ITR中的部分序列，其中a和a』、b和b』、c和c』、d和d』互補配對，使單鏈ITR能夠自我摺疊形成「T」字型結構。複製過程中，新合成的序列用粗線表示。具體的拯救過程為，首先ITR同向排列的AAV載體整合入細胞染色體，形成如圖A所示的結構；然後ITR序列被AAV病毒的Rep蛋白識別、結合併d序列中產生切口，形成如圖B所示的結構；在細胞內DNA損傷修復機制的作用下，切口發生移動，一端ITR完成複製，另一端ITR形成缺失部分d序列的單鏈(圖C);該單鏈中ITR序列自我摺疊，形成「T」字型結構(圖D);在此基礎上，進行自我複製，結構如圖E所示。完成複製後，在Rep蛋白的作用，在d序列處再次產生切口(圖F)，開始新一輪的複製過程。同樣，完成ITR的複製過程後(圖G)，新合成鏈(圖G中粗線表示)中ITR序列再次自我摺疊，形成「T」字型結構(圖H)，開始再次複製過程，完成複製過程後的結構示意圖如圖1所示。圖1中ITR序列進一步摺疊形成，形成「T」字型結構，兩個正常的ITR之間，包含一個缺失d序列的ITR，使包裝獲得的AAV病毒單鏈基因組中完全互補的序列，可互補配對形成雙鏈(圖J)。圖8rAAV2-EGFP 和 rAAV2_EGFP』分別感染 B16F10、3LL 和 NIH/3T3 細胞結果。圖 A和圖D分別表示rAAV2-EGFP』和rAAV2_EGFP感染B16F10細胞48h後，螢光顯微鏡拍照結果；圖B和圖E分別表示rAAV2-EGFP』和rAAV2_EGFP感染3LL細胞48h後，螢光顯微鏡拍照結果；圖C和圖F分別表示rAAV2-EGFP』和rAAV2_EGFP感染NIH/3T3細胞48h後，螢光顯微鏡拍照結果。圖9rAAV2-EGFP』 和 rAAV2_EGFP 體內表達特徵比較結果。rAAV2_EGFP』 和!■AAV2-EGFP分別注射C57BL/6小鼠右後肢脛前肌，不同時間處死小鼠取右後肢脛前肌，冰凍切片後，螢光顯微鏡觀察拍照，並在注射病毒6周後對小鼠右後肢脛前肌拍照。圖A至D表示的是rAAV2-EGFP』注射C57BL/6小鼠I周、2周、6周和6個月後，處死小鼠取右後肢脛前肌，冰凍切片後，螢光顯微鏡觀察拍照結果；圖E表示的rAAV2-EGFP』注射C57BL/6小鼠6周後，右後肢脛前肌拍照結果；圖F至H表示的是rAAV2-EGFP』注射C57BL/6小鼠I周、2周、6周和6個月後，處死小鼠取右後肢脛前肌，冰凍切片後，螢光顯微鏡觀察拍照結果；圖1表示的rAAV2-EGFP』注射C57BL/6小鼠6周後，右後肢脛前肌拍照結果。以下實施例對本發明的ITR同向排列的AAV構建及其應用作了詳細說明，但並不 意味著限制本發明的內容。實施例1ITR同向排列的通用型AAV載體pSDAV2的構建1、ITR序列的設計合成首先，我們對本公司原有的AAV載體pAAV2neo(圖1)進行了酶切位點分析，選擇pAAV2neo載體中離CMV啟動子較近的ITR為替換對象，並選擇了 HpaI和XhoI兩個酶切位點用於切除替換的ITR序列。根據選定的用於切除ITR序列酶切位點，我們設計併合成攜帶ITR的序列R-1TR(委託Takara公司合成，大連，中國)，並將該序列克隆入pMD18Tsimple (委託Takara公司合成，大連，中國)，命名為pMD18T-R-1TR(圖2)。合成R-1TR序列具體如下5』 ctcRaRJctaga ttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatXhoI XbaIttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatct gctagc ttggccactccctNheIctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccggg
CggCCtcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct gttaac 3』Hpal在合成序列的兩端分別引入XhoI和HpaI酶切位點，但與ITR的相對方向和原來相反，使替換後兩個ITR同向排列。同時為了方便克隆操作，在ITR序列(即酶切位點NheI和HpaI之間的序列)的5』端引入長度為133bp的冗餘序列(即XbaI和NheI之間的序列)。用合成序列替換原ITR相關序列後，XbaI和NheI消化、連接去除冗餘序列。2、pSDAV2載體的構建為了構建ITR同向排列的AAV通用型載體pSDAV2，我們首先用HpaI和XhoI (NEB,美國)消化本公司原有的AAV載體pAAV2neo，切除ITR序列，瓊脂糖凝膠電泳後，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國)回收長度為6787bp的載體片段。同時用HpaI和XhoI (NEB，美國)消化pMD18T-R-1TR，瓊脂糖凝膠電泳後，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國)回收大小為296bp的片段。將該片段與回收的載體片段用T4DNA連接酶(NEB，美國)連接後，轉化E. coli JM109感受態細胞(Takara，大連，中國)，挑取克隆，酶切鑑定正確後，獲得pSDAV2-pre (圖3)。在此基礎上，用XbaI和NheI (NEB，美國)消化pSDAV2-pre,瓊脂糖凝膠電泳後,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen,北京，中國)回收大小為6948bp的載體片段。載體片段T4DNA連接酶連接後，轉化E. coli JM109感受態細胞(Takara，大連，中國)，挑取克隆，酶切鑑定正確後，獲得pSDAV2(圖4)。實施例2pSDAV2_EGFP載體的構建為了驗證ITR同向排列的通用型載體pSDAV2的功能，我們先用KpnI和EcoRI (NEB，美國)消化PSDAV2載體，瓊脂糖凝膠電泳後，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國)回收大小為6942bp的載體片段。同時，用KpnI和EcoRI (NEB，美國)消化pAAV2neo-EGFP (本公司構建並保存)，瓊脂糖凝膠電泳後，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國)回收大小為756bp的EGFP基因片段。將EGFP基因片段和載體片段用T4DNA連接酶(NEB，美國)連接後，轉化E. coli JM109感受態細胞(Takara，大連，中 國)，挑取克隆，提取質粒，酶切鑑定正確，獲得PSDAV2-EGFP (圖5)。實施例3rAAV2_EGFP』病毒的製備將質粒pSDAV2-EGFP 用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)轉染 BHK21 細胞，轉染過程參見Lipofectamine 2000說明書。具體的轉染過程如下轉染前ld，BHK21細胞接種於24孔細胞培養板(IxlO5個細胞/孔)；轉染前4h，培養BHK21細胞用10%FBS DMEM(Invitrogen，美國)換液(300 μ L/孔)。轉染時按如下過程配製轉染液，以每孔為例具體說明。取 50yL OPT1-MEM (Invitrogen，美國)加入 2μ L Lipofectamine 2000，同時，取 50 μ L OPT1-MEM(Invitrogen，美國)加入 O. 8 μ g 的 pSDAV2_EGFP 質粒，分別輕彈混勻，室溫放置5min。然後將兩種液體混合,輕彈混勻，室溫靜置20min,加入培養細胞中，並前後左右晃動混勻。轉染後細胞於5% CO2 37°C孵箱中培養過夜，第二天待細胞密度至90 %以上，將細胞消化轉移至6孔細胞培養板中，並用G418終濃度為800 μ g/ml的10% FBS DMEM培養基選擇培養15d，獲得穩定表達EGFP細胞株BHK21/EGFP，並挑取12個單細胞克隆，依次編號為C1-C12。利用伍志堅(Wu ZJ，Wu XB, Hou YD. Contruction ofa recombinant herpes simplex virus which can provide packaging function forrecombinant adeno-associated virus. Chin Sci Bull, 1999,44(8) :715-719.)等報導的方法包裝獲得 rAAV2-EGFP』 病毒，吳小兵(Wu XB, Dong XY, Wu ZJ, et al. A novel methodfor purification of recombinant adeno-associated virus vectors on a largescale. Chin Sci Bull, 2001,46 (6) :485-489.)等報導的方法濃縮純化病毒，斑點雜交法檢測包裝獲得rAAV2-EGFP』病毒滴度，結果表明單細胞克隆C6包裝效率最高，選用C6克隆用於rAAV2-EGFP』病毒的大量製備。實施例4Southern blot檢測包裝獲得rAAV2_EGFP』中scrAAV的比例為了檢測用pSDAV2-EGFP包裝獲得rAAV2_EGFP』中scrAAV的比例，我們對包裝獲得的rAAV2-EGFP』進行了 southern blot分析。首先，我們提取rAAV2_EGFP』病毒基因組，並同時提取pAAV2neo-EGFP包裝獲得rAAV2_EGFP病毒基因組作為對照。然後，提取的rAAV2-EGFP和rAAV2_EGFP』病毒基因組上樣，行鹼變性瓊脂糖電泳，虹吸法轉移至帶正電的尼龍膜上，地高辛標記的CMV探針雜交，鹼磷酶標記抗地高辛抗體孵育結合，BCIP/NBT檢測試劑盒顯色，結果如圖6所示。從圖的結果可知，雖然rAAV2-EGFP中也存在一定的雙鏈形式，但單鏈形式佔90%以上；相反，rAAV2-EGFP』則主要以雙鏈形式為主，佔60%以上。這表明ITR同向排列的AAV載體不僅不影響rAAV病毒的包裝，還可以顯著地提高包裝獲得rAAV病毒中雙鏈形式比例。這種提高rAAV病毒中雙鏈形式包裝比例的策略不同於直接改變AAV載體中的TRS序列，而是改變天然AAV病毒中兩個ITR序列的排列順序(反向排列)，使兩個ITR序列在AAV載體pSDAV2中正向排列。pSDAV2載體整合入染色體後，在rAAV病毒本身的天然拯救過程中，產生D序列缺失的ITR序列，包裝獲得雙鏈rAAV病毒。rAAV病毒的拯救過程如圖7所示。pSDAV2整合入細胞染色體後的結構如圖A所示，a、b、C、d和a』、b』、c』、d』分別表示ITR中的部分序列，其中a和a』，b和b』，c和c』，d和d』兩兩完全互補。Rep蛋白識別並結合ITR中的TRS序列(d序列)，並產生切口，在細胞內DNA修復相關酶的作用下，替換其中一個ITR序列，並刪除另一個ITR的d序列，在R印蛋白的作用下，摺疊形成如圖所示的ITR二級結構。然後，以其中一個ITR形成的二級結構為引物，開始DNA的複製過程。待DNA複製過程完成後，形成的雙鏈d序列，又被Rep蛋白 識別結合併產生切口，開始DNA的重新複製。複製完成後，在R印蛋白的作用下，ITR重新摺疊形成其二級結構，DNA進一步複製，如此反覆，形成正常ITR和d序列缺失ITR間隔依次排列的多個重複AAV病毒基因組。由於R印蛋白只能識別並切割正常ITR序列，因此在包裝過程中形成攜帶兩個正常ITR序列、缺失d序列ITR序列和完全互補兩條單鏈序列的自身互補的 AAV(Self complementary AAV, scAAV)病毒顆粒。實施例5rAAV2_EGFP』轉導細胞表達特點研究為了研究rAAV2-EGFP』轉導細胞的表達特點，我們將rAAV2_EGFP和rAAV2_EGFP』分別以 IxlO5Vg/細胞(viral genome, vg)轉導 B16F10、3LL 和 NIH/3T3 細胞。48h 後，螢光倒置顯微鏡(Nikon TE-300)觀察EGFP表達情況並拍照，如圖8所示。結果表明，在三種細胞中，轉導rAAV2-EGFP』均比轉導rAAV2_EGFP細胞的EGFP表達效率高，這說明scrAAV能夠有效地提高外源基因在細胞內的表達水平。而且，B16F10為肝癌來源細胞系，3LL為肺癌來源細胞系，NIH/3T3為成纖維細胞，在三種不同來源的細胞，均呈現相似的表達規律，這進一步說明scrAAV提高外源基因在細胞內表達水平的普遍性。實施例6rAAV2_EGFP』轉導小鼠肌肉表達特點研究為了研究rAAV2-EGFP 』的體內表達特點，rAAV2_EGFP和rAAV2_EGFP 』分別以IxlO10Vg/只注射於6-8周齡C57BL/6小鼠(中國醫學科學院實驗動物學研究所，北京，中國)右後肢脛前肌。注射rAAV2-EGFP』和rAAV2_EGFP不同時間(I周、2周、6周和6個月)後，分別取注射右後肢脛前肌，冰凍切片，螢光倒置顯微鏡(Nikon TE-300)觀察EGFP表達情況並拍照，如圖9A-D和圖9F-H所示。同時，對注射6周後的整個右後肢脛前肌拍照，如圖9E和圖91所示。結果表明體內的實驗結果與體外的一致，rAAV2-EGFP』轉導小鼠脛前肌的效率明顯比rAAV2-EGFP高，這再次證明scrAAV能夠有效提高外源基因在體內的表達效率。名詞及縮寫詞解釋1、AAV :adeno_associated virus,腺相關病毒。2、ITR :1nverted terminal repeat,倒轉末端重複。3、AAV2 病毒2 型 AAV 病毒(adeno-associated virus serotype 2)。
4、pAAV2neo質粒是一種攜帶了 AAV2病毒ITR的質粒DNA。所述的AAV載體質粒一般由AAV2ITR、啟動子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV2 ITR以及E. coli質粒骨架組成。質粒骨架上攜帶了 neo基因的表達單位。5、CMV promoter :人巨細胞病毒的啟動子。6、BGH poly⑷牛生長激素基因的加尾信號序列。7、Neo :氨基糖轉移酶基因。 8、Amp :氨苄青黴素抗性基因。
權利要求
1.1TR同向排列的AAV載體，其技術特徵在於兩個AAV2 ITR同向排列且ITR間包含一個外源基因表達框，用於外源基因的插入。
2.如權利要求1所述，該載體可用於重組AAV病毒的製備，且明顯提高重組AAV病毒中scrAAV(Self complementary rAAV)的比例，scrAAV 比例達到 60% 以上。
3.如權利要求2所述，包裝獲得rAAV病毒可明顯提高外源基因在體內外的表達強度。
4.如權利要求1所述，外源基因表達框中的啟動子可以是CMV、CAG、TTR、SV40等多種啟動子，並根據不同的需要進行選擇。
5.如權利要求1所述，外源基因可以是蛋白編碼基因、shRNA、siRNA、miRNA等多種基因。
6.如權利要求1所述，該載體整合入細胞染色體後，病毒包裝拯救過程中可產生d序列缺失的ITR。
7.如權利要求1所述，該載體可應用於以HSVl為輔助病毒的rAAV載體包裝系統。
8.如權利要求1所述，該載體包含neo基因表達框，可用於篩選獲得外源基因的穩定表達細胞株。
全文摘要
本發明具體涉及一種ITR同向排列的AAV載體pSDAV2，該表達載體主要由兩個同向排列的AAV2的ITR、篩選基因表達框和外源基因表達框組成，其中外源基因表達框中含有多克隆位點MCS，用於表達外源基因的插入。將報告基因插入pSDAV2載體，篩選獲得細胞株，利用「一個細胞株/一株輔助病毒」策略包裝重組AAV病毒，發現ITR同向排列不僅能夠明顯提高包裝獲得重組AAV病毒中雙鏈AAV病毒的比例，還能增強包裝攜帶基因的體內外表達效率。總之，本發明提出並構建了一種ITR同向排列的AAV載體，為重組AAV病毒的包裝特別是重組雙鏈AAV病毒的包裝提供了新的選擇。
文檔編號C12N15/864GK103014064SQ20111028314
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者董小巖, 田文洪, 吳小兵, 董哲嶽 申請人:北京五加和分子醫學研究所有限公司