小分子rna作為結核病標記物的應用的製作方法
2023-05-14 01:23:46 2
小分子rna作為結核病標記物的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了小分子RNA作為結核病標記物的應用。本發明通過實驗得到結核病患者血清中miRNA表達譜,然後通過信息分析得到人群血清中miRNA表達量最高且與非結核病人群差異最大的10種miRNA。高表達量保證了以此靶標做為檢測方法的靈敏度,同時與非結核病人群差異最大保證了該方法的特異性。基於上述篩選得到的10種miRNA,本發明構建了一種以小分子RNA為標記物,通過逆轉錄、實時螢光定量PCR技術對結核病進行診斷的試劑盒。該試劑盒的檢測結果準確可靠,操作簡便,適於推廣應用。
【專利說明】小分子RNA作為結核病標記物的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子診斷領域,具體涉及小分子RNA作為結核病標記物的應用。
【背景技術】
[0002]結核分支桿菌引起感染和死亡。世界衛生組織估算全球1/ 3的人口受結核菌感染,其主要原因是多重耐藥結核菌(multidrug resistance tuberculosiscle bacillus,MDR-TB)的流行以及人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus , HIV)感染、器官移植、免疫抑制劑使用等所致免疫損害宿主(immuno-compromised host , ICH)增多和高齡人口中機體免疫力低下等因素,使結核分支桿菌感染難以控制。為了進一步提高結核病的診斷、治療和預防控制水平,現在迫切需要更為精確快速的診斷新技術用於臨床標本分離和鑑定結核分支桿菌。
[0003]目前臨床現有結核病診斷技術根據每種技術所針對的靶標不同可分為三大類。微生物學方法、血清學方法、分子生物學方法。
[0004]微生物學方法以塗片和各種培養方法為代表。其中的塗片法比較迅速,一般I個小時可以出結果,但是陽性率只有20%左右。羅氏培養法目前作為結核病診斷的金標準,所需要周期長,一般4-8周,而結核病強化期的治療是2個月。如果等培養結果出來在對患者進行幹預,將會延誤治療;但如果不等培養結果即進行治療,又可能因為誤診使患者承受抗結核藥物副作用所帶來的痛苦。
[0005]而關於血清學方法,WHO已經發表公開聲明,目前市場上所應用的血清學結核病診斷方法都不能取得滿意的結果。
[0006]分子生物學方法是近來發展比較迅速的一個領域,各種方法都是以結核分枝桿菌的RNA或者DNA為靶標。但是該類方法所面臨的問題是未能找到一個另人滿意的靶標。
【發明內容】
[0007]針對現有技術所存在的問題,本發明的目的在於提供一種以小分子RNA為標記物,通過逆轉錄、實時螢光定量PCR技術對結核病進行診斷的試劑盒。
[0008]本發明所採取的技術方案是:
一種結核病的診斷試劑盒,其包括檢測一種或多種小分子RNA的特異性PCR引物,所述小分子 RNA 包括 hsa_miR-92a、hsa-miR-122、hsa_let_7a、hsa-miR-486_5p、hsa_let_7b、hsa-miR-451、hsa_miR-320b、hsa_miR-320a、hsa-miR-192 和 hsa-miR-185。
[0009]其中,檢測hsa-miR_92a的引物為:
RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGC (SEQ ID NO:1)
realtime-F:GCGCGCTATTGCACTTGTCCCG (SEQ ID NO:2)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:3)
檢測hsa-miR-122的引物為:
【權利要求】
1.一種結核病的診斷試劑盒,其包括檢測一種或多種小分子RNA的特異性PCR引物,其特徵在於,所述小分子 RNA 包括 hsa-miR-92a、hsa-miR-122、hsa-let-7a、hsa-miR-486_5p、hsa_let_7b、hsa-miR-451、hsa_miR-320b、hsa_miR-320a、hsa-miR-192 和 hsa-miR-185。
2.根據權利要求1所述的診斷試劑盒,其特徵在於: 檢測hsa-miR_92a的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGC (SEQ ID NO:1)
realtime-F:GCGCGCTATTGCACTTGTCCCG (SEQ ID NO:2)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:3) 檢測hsa-miR-122的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAACA (SEQ ID NO:4)
realtime-F:GCGCGCTGGAGTGTGACAATGG (SEQ ID NO:5)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID N0:6) 檢測hsa-let_7a的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT (SEQ ID NO:7)
realtime-F:GCGCGCTGAGGTAGTAGGTTGT (SEQ ID N0:8)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID N0:9) 檢測hsa-miR-486-5p的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCGGG (SEQ ID NO:10)
realtime-F:GCGCTCCTGTACTGAGCTGC (SEQ ID NO:11)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:12) 檢測hsa-let-7b的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAC (SEQ ID NO:13)
realtime-F:GCGCGCTGAGGTAGTAGGTTGT (SEQ ID NO:14)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:15) 檢測hsa-miR-451的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA (SEQ ID NO:16)
realtime-F:GCGCGCGCAAACCGTTACCATTAC (SEQ ID NO:17)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:18) 檢測hsa-miR-320b的引物為: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTGCCC (SEQ ID NO:19)
realtime-F:GCGCGCAAAAGCTGGGTTGAGA (SEQ ID NO:20)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:21)
【文檔編號】C12Q1/68GK103882095SQ201210559345
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2012年12月20日
【發明者】鍾球, 周琳, 李海成, 陳濤 申請人:廣東省結核病控制中心