一種鳥苷的生產方法
2023-04-25 10:03:51 3
一種鳥苷的生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種鳥苷的生產方法，包括以下步驟：（1）將種子液按照體積比例12%至18%接入發酵罐，流加氨水控制pH值在6.5至7.0之間；（2）發酵對數生長期，控制發酵溫度在36至38攝氏度之間，分批次添加氮源，維持其質量比例在0.15%至0.35%之間；（3）發酵穩定期，控制發酵溫度在34至36.5攝氏度之間，按照質量比例添加0.1%至0.3%核苷類似物和0.1%至0.3%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑；（4）發酵衰亡期，控制發酵溫度在36至38攝氏度之間；（5）發酵結束後，從發酵液中提取鳥苷。本發明提高了發酵法生產鳥苷的產量，縮短了發酵時間，從而大幅提高鳥苷產率，具有重要的工業應用價值。
【專利說明】一種鳥苷的生產方法【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程領域，更具體地，涉及一種鳥苷的生產方法。
【背景技術】
[0002]鳥苷又名9-β-D-呋喃核糖基鳥嘌呤，是嘌呤核苷類物質的一種，其用途十分廣泛，是食品和醫藥產品的重要中間體，可用於合成食品增鮮劑5』 -鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉，也是製造抗病毒藥物無環鳥苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鳥苷鈉(GTP)等的主要原料。
[0003]目前鳥苷的生產方法有化學合成法、酶水解RNA法、菌體自溶法和發酵法4種。發酵法因其產率高、周期短、易控制等優點，已經成為工業生產鳥苷的重要來源。進一步提高發酵法生產鳥苷的產量，縮短發酵時間，能大幅提高鳥苷生產效率，具有較大的工業應用價值。
【發明內容】
[0004]針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種鳥苷酸生產方法，其目的在於通過控制發酵法生產鳥苷酸過程中，各階段的溫度等參數，進一步提高發酵法生產鳥苷酸的產量。
[0005]為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種鳥苷的生產方法，包括以下步驟:
[0006](1)將種子液按照體積比例12%至18%接入裝有培養基的發酵罐，控制pH值在6.5至7.0之間；
[0007](2)發酵對數生長期，控制發酵溫度在36攝氏度至38攝氏度之間，分批次添加氮源，使氮源含量維持在質量比例0.15%至0.35%之間。
[0008](3)發酵穩定期，控制發酵溫度在34攝氏度至36.5攝氏度之間，按照質量比例添加0.1%至0.3%核苷類似物和0.1%至0.3%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑；
[0009](4)發酵衰亡期，控制發酵溫度在36攝氏度至38攝氏度之間。
[0010](5)發酵結束後，從發酵液中提取鳥苷。
[0011]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其種子液按照如下方法製備:
[0012](a) 一級種子培養:將活性枯草芽孢桿菌菌液按照體積比例0.8%至1.5%接種到一級種子培養基，控制培養溫度31攝氏度至33攝氏度之間，通氣量0.8VVM至1.2VVM,培養17小時至22小時，獲得一級種子液；所述一級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖1.5%至 2.5%,尿素 0.15% 至 0.25%,蛋白腖 0.5% 至 1%，NaCl0.1% 至 0.3%, (NH4) 2S040.2% 至 0.7%,酵母粉1%至3%，調pH在6.5至7.5之間；
[0013](b) 二級種子培養:將一級種子液按照體積比例1%至3.5%接種到二級種子培養基，控制培養溫度33至36攝氏度之間，通氣量IVVM至1.5VVM，培養8小時至12小時獲得所述種子液；所述二級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖3%至8%，酵母粉1%至3%，(NH4)2SO40.5% 至 1.5%，穀氨酸鈉 0.8% 至 1.5%，大豆蛋白腖 1% 至 2%，KH2PO40.1% 至 0.3%，MgSO4.7Η200.003% 至 0.015%, MnSO4.7Η200.0005% 至 0.0025%, FeSO4.7Η200.0005% 至
0.0025%,調 pH 在 6.6 至 6.8 之間。
[0014]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其步驟(1)所述的培養基，按照質量比例包括:葡萄糖 15% 至 25%,穀氨酸鈉 0.5% 至 2%, KH2PO40.1% 至 0.3%, MgSO4.7Η200.08% 至 0.2%,MnS04.7Η200.0005% 至 0.002%, FeS04.7Η200.0005% 至 0.002%,消泡劑 0.02% 至 0.1，調節ρΗ6.5至7.5之間。
[0015]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其步驟(2)所述的對數生長期為發酵開始後16小時以內。
[0016]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其步驟(2)所述的氮源為生物肽素或酵母粉。
[0017]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其步驟(2)分2到6次添加。
[0018]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其步驟(3)所述的生長期為發酵開始後16小時至40小時；所述核苷類似物為鳥苷、次黃嘌呤或核糖核酸。
[0019]優選地，所述的鳥 苷的生產方法，其步驟(3)的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑為檸檬酸鈉或可溶性鈣鹽。
[0020]優選地，所述的鳥苷的生產方法，其步驟(4)所述衰亡期為發酵開始後40小時至48小時。
[0021]總體而言，通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，由於根據各發酵階段菌體的生長特徵和產苷特點，對於發酵溫度做出精準調控，能夠取得縮短發酵時間，提高發酵產量的有益效果；另外通過配合發酵培養基配方、發酵各階段PH值控制和補充氮源、核苷類似物、激活劑等手段，進一步提高了鳥苷的生產效率。本方法，應用於工業大規模生產鳥苷具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是本發明提供的方法流程圖。
【具體實施方式】
[0023]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特徵只要彼此之間未構成衝突就可以相互組合。
[0024]在整個發酵法生產鳥苷過程來說，大體可以分為三個部分，第一部分是發酵前期，即菌體的對數生長期，此時期主要目標是提高生產菌株的濃度，時長約為O至16小時；第二部分是產苷期，即穩定期，此時期主要目標是積累鳥苷產量，時段約為16小時至40小時；第三部分是發酵末期，即衰亡期，此時期伴隨大量次級代謝產物及毒素的生成，時段約為40小時至50小時。理想的鳥苷發酵過程適當的延長穩定期並提高糖苷轉化率以積累鳥苷，發酵末期刺激放罐以減少非目的產物的積累。
[0025]在發酵對數生長期，適當提高溫度能縮短培養時間；在發酵穩定期，適當降低溫度能延長產苷時間；在發酵衰亡期，適當提高發酵溫度能刺激放罐結束。因此變溫培養對鳥苷整個發酵過程具有重要意義。
[0026]本發明提供的鳥苷的生產方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0027](I)將種子液按照體積比例12%至18%，優選15%，接入裝有培養基的發酵罐，流加氨水控制pH值在6.5至7.5，優選6.8之間。
[0028]所述培養基按照質量比例包括:葡萄糖15%至25%，優選20%，穀氨酸鈉0.5%至 2%,優選 1%，KH2PO40.1% 至 0.3%,優選 0.2%, MgSO4.7Η200.08% 至 0.2%,優選 0.14%,MnS04.7Η200.0005% 至 0.002%,優選 0.001%, FeS04.7Η200.0005% 至 0.002%,優選 0.001%,消泡劑0.02%至0.1%，優選0.05%,調節ρΗ6.5至7.5之間，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘，使其處於無菌狀態。
[0029]所述種子液按照發酵法生產鳥苷的一般種子液製備即可，優選地，按照如下方法製備:
[0030](a)—級種子培養:將活性枯草芽孢桿菌菌液按照體積比例0.8%至1.5%(優選1%)接種到一級種子培養基，控制培養溫度31攝氏度至33攝氏度之間，優選32攝氏度，通氣量0.8VVM (通氣比)至1.2VVM，培養17小時至22小時獲得一級種子液；所述一級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖1.5%至2.5%，優選2%，尿素0.15%至0.25%，優選0.2%，蛋白腖
0.5% 至 1%，優選 0.8%, NaCl0.1% 至 0.3%,優選 0.25%, (NH4) 2S040.2% 至 0.7%,優選 0.5%,酵母粉1%至3%，優選2.0%，調pH在6.5至7.5之間，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘，使其處於無菌狀態。
[0031](b) 二級種子培養:將一級種子液按照體積比例1%至3.5%，優選2%，接種到二級種子培養基，控制培養溫度33攝氏度至36攝氏度之間(優選35攝氏度)，通氣量IVVM至
`1.5VVM，培養8小時至12小時獲得所述種子液；所述二級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖3%至8%，優選5%，酵母粉1%至3%，優選2%，(NH4)2SO40.5%至1.5%，優選0.8%，穀氨酸鈉0.8%至1.5%，優選1.3%，大豆蛋白腖1%至2%，優選1.2%，KH2PO40.1%至0.3%，優選0.175%, MgSO4.7Η200.003% 至 0.015%，優選 0.008%, MnSO4.7Η200.0005% 至 0.0025%，優選0.0013%, FeSO4.7Η200.0005% 至 0.0025%,優選 0.0013%,調 pH 在 6.6 至 6.8 之間，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘，使其處於無菌狀態。
[0032](2)發酵對數生長期，一般是發酵開始後16小時以內，控制發酵溫度在36攝氏度至38攝氏度之間，優選37.5攝氏度，分批次添加氮源，使氮源含量維持在0.15%至0.35%。優選地，分2到6次，優選4次添加氮源。
[0033]所述的氮源為生物肽素，酵母粉等。優選的氮源為生物肽素，即蛋白質以肽的形式存在，具有小分子結構，以肽鏈相連接並且包含多種生物活性酶，富含多種生物活性成分、維生素和微量元素等，有利於菌種的快速生長繁殖。
[0034](3)發酵穩定期，一般是發酵開始後16小時至40小時，控制發酵溫度在34攝氏度至36.5攝氏度之間，優選35.5攝氏度，按照質量比例添加0.2%的核苷類似物和0.1%至0.3%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑。
[0035]所述核苷類似物為鳥苷、次黃嘌呤或核糖核酸，優選鳥苷。鳥苷在合成過程中，又分為從頭合成途徑和補救合成途徑，從頭合成途徑是利用磷酸核糖、胺基酸、一碳單位及二氧化碳為原料經過一系列的酶促反應，合成鳥苷；補救合成途徑是利用游離的嘌呤或嘌呤核苷經過簡單的反應，合成鳥苷。添加的核苷類似物中游離的嘌呤能啟動補救合成途徑，增大鳥苷的合成量。實驗表明，單獨添加鳥苷、次黃嘌呤和核糖核酸以鳥苷的效果最好。
[0036]所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑為檸檬酸鈉或可溶性鈣鹽。
[0037]在發酵穩定期，菌體主要是利用葡萄糖經過戊糖磷酸途徑及後續一系列反應合成鳥苷，其中第一步反應的關鍵酶是6-磷酸葡萄糖脫氫酶。實驗表明，檸檬酸鈉、鈣離子等6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑能定向的提高6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，增大HMP途徑通量，進而提高鳥苷的生成量。添加鳥苷能起到較次黃嘌呤更好的誘導菌株啟動補救合成途徑生產鳥苷的效果。
[0038]另外，實驗證明，加入的檸檬酸鈉和鳥苷能產生協同作用，大大的提高合成量。
[0039](4)發酵衰亡期，一般是發酵開始後40小時至48小時，控制發酵溫度在36攝氏度至38攝氏度之間，優選37.5攝氏度。
[0040](5)發酵結束後，從發酵液中提取鳥苷。
[0041]以下為實施例:
[0042]實施例1
[0043]一種鳥苷的生產方法，包括以下步驟:
[0044]( I)將種子液按照體積比例15%接入裝有培養基的發酵罐，流加氨水控制pH值至
6.5左右。
[0045]所述培養基按照質量比例包括:葡萄糖20%，穀氨酸鈉1%，KH2PO40.2%，MgSO4.7Η200.14%, MnS04.7Η200.001%, FeS04.7Η200.001%,消泡劑 0.05%,，調節 pH 至 7.0，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘,使其處於無菌狀態。
[0046]所述種子液按照如下方法製備:
[0047](a)—級種子培養:將超低溫保存的枯草芽孢桿菌凍菌液按照體積比例1%接種到一級種子培養基，控制培養溫度32攝氏度，通氣量0.8VVM，培養17小時獲得一級種子液；所述一級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖2%，尿素0.2%，蛋白腖0.8%，NaCl0.25%，(NH4)2SO40.5%，酵母粉2.0%，調pH至6.5，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘，使其處於無菌狀態。
[0048](b) 二級種子培養:將一級種子液按照體積比例2%接種到二級種子培養基，控制培養溫度35攝氏度，通氣量1VVM，培養8小時獲得所述種子液；所述二級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖5%，酵母粉2%，(NH4)2SO40.8%，穀氨酸鈉1.3%，大豆蛋白腖1.2%，KH2PO40.175%, MgSO4.7Η200.008%, MnSO4.7Η200.0013%, FeSO4.7Η200.0013%，調 pH 至 6.6，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘,使其處於無菌狀態。
[0049](2)發酵對數生長期，即發酵開始後16小時以內，控制發酵溫度在36攝氏度，分4次添加氮源，使氮源含量維持在0.15%至0.35%之間。所述的氮源為酵母粉。
[0050](3)發酵穩定期，即發酵開始後16小時至40小時，控制發酵溫度34攝氏度，按照質量比例添加0.2%的核苷類似物和0.1%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑。
[0051]所述核苷類似物為次黃嘌呤。
[0052]所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑為檸檬酸鈉。
[0053](4)發酵衰亡期，即發酵開始後40小時至48小時，控制發酵溫度36攝氏度。
[0054](5)發酵結束後,從發酵液中提取鳥苷。鳥苷產量達到60.5g/L,發酵時間為47小時，如表1所示。[0055]實施例2
[0056]一種鳥苷的生產方法，包括以下步驟:
[0057](I)將種子液按照體積比例18%接入裝有培養基的發酵罐，流加氨水控制pH值至
7.5左右。
[0058]所述培養基按照質量比例包括:葡萄糖25%，穀氨酸鈉0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4.7Η200.08%, MnS04.7Η200.002%, FeS04.7Η200.002%,消泡劑 0.02%,，調節 pH 至 7.5，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘,使其處於無菌狀態。
[0059]所述種子液按照如下方法製備:
[0060](a)—級種子培養:將超低溫保存的枯草芽孢桿菌凍菌液按照體積比例1.5%接種到一級種子培養基，控制培養溫度33攝氏度，通氣量1.0VVM,培養20小時獲得一級種子液；所述一級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖2.5%，尿素0.25%，蛋白腖0.5%, NaCl0.3%，(NH4) 2S040.7%，酵母粉3.0%，調pH在7.5，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘，使其處於無菌狀態。
[0061](b) 二級種子培養:將一級種子液按照體積比例3.5%接種到二級種子培養基，控制培養溫度36攝氏度，通氣量1.2VVM，培養10小時獲得所述種子液；所述二級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖8%，酵母粉3%，(NH4)2SO4L 5%，穀氨酸鈉1.5%，大豆蛋白腖1%，KH2PO40.1%，MgSO4.7Η200.015%, MnSO4.7Η200.0025%, FeSO4.7Η200.0025%,調 pH 至 6.8，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘,使其處於無菌狀態。
[0062](2 )發酵對數生長期，即發酵開始後16小時以內，控制發酵溫度在37.5攝氏度，分6次添加氮源，使氮源含量維持在0.15%至0.35%。分4次添加氮源。所述的氮源為生物肽素。
[0063](3)發酵穩定期，即發酵開始後16小時至40小時，控制發酵溫度35.5攝氏度，按照質量比例添加0.1%的核苷類似物和0.3%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑。
[0064]所述核苷類似物為鳥苷。
[0065]所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑為氯化鈣。
[0066](4)發酵衰亡期，即發酵開始後40小時至48小時，控制發酵溫度37.5攝氏度。
[0067](5)發酵結束後,從發酵液中提取鳥苷。鳥苷產量達到62.8g/L,發酵時間為46小時，如表1所示。
[0068]實施例3
[0069]一種鳥苷的生產方法，包括以下步驟:
[0070]( 1)將種子液按照體積比例12%接入裝有培養基的發酵罐，流加氨水控制pH值至
6.8左右。
[0071 ] 所述培養基按照質量比例包括:葡萄糖15%，穀氨酸鈉2%，KH2PO40.1%，MgSO4.7Η200.2%, MnS04.7Η200.0005%, FeS04.7Η200.0005%,消泡劑 0.1%，，調節 pH 至 6.5，
0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘,使其處於無菌狀態。
[0072]所述種子液按照如下方法製備:
[0073](a)—級種子培養:將超低溫保存的枯草芽孢桿菌凍菌液按照體積比例0.8%接種到一級種子培養基，控制培養溫度31攝氏度，通氣量1.2VVM,培養22小時獲得一級種子液；所述一級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖1.5%，尿素0.15%，蛋白腖1%，NaCl0.1%，(NH4)2SO40.2%，酵母粉1.0%，調pH至7.0，0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘，使其處於無菌狀態。
[0074](b) 二級種子培養:將一級種子液按照體積比例1%接種到二級種子培養基，控制培養溫度33攝氏度，通氣量1.5VVM,培養12小時獲得所述種子液；所述二級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖3%，酵母粉1%，(NH4)2SO40.5%，穀氨酸鈉0.8%，大豆蛋白腖2%，KH2PO40.3%, MgSO4.7Η200.003%, MnSO4.7Η200.0005%, FeSO4.7Η200.0005%,調 pH 至 6.7，
0.1lMpa至0.12Mpa滅菌30分鐘,使其處於無菌狀態。
[0075](2)發酵對數生長期，即發酵開始後16小時以內，控制發酵溫度在38攝氏度，分2次添加氮源，使氮源含量維持在0.15%至0.35%。所述的氮源為生物肽素。
[0076](3)發酵穩定期，即發酵開始後16小時至40小時，控制發酵溫度36.5攝氏度，按照質量比例添加0.3%的核苷類似物和0.2%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑。
[0077]所述核苷類似物為核糖核酸。
[0078]所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑為乙酸鈣。
[0079](4)發酵衰亡期，即發酵開始後40小時至48小時，控制發酵溫度38攝氏度。
[0080](5)發酵結束後,從發酵液中提取鳥苷。鳥苷產量達到59.6g/L,發酵時間為45小時，如表1所示。
[0081]表1:
[0082]
【權利要求】
1.一種鳥苷的生產方法，其特徵在於，包括以下步驟: (I)將種子液按照體積比例12%至18%接入裝有培養基的發酵罐，控制pH值在6.5至7.0之間； (2 )發酵對數生長期，控制發酵溫度在36攝氏度至38攝氏度之間，分批次添加氮源，使氮源含量維持在質量比例0.15%至0.35%之間； (3)發酵穩定期，控制發酵溫度在34攝氏度至36.5攝氏度之間，按照質量比例添加0.1%至0.3%核苷類似物和0.1%至0.3%的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑； (4)發酵衰亡期，控制發酵溫度在36攝氏度至38攝氏度之間； (5)發酵結束後，從發酵液中提取鳥苷。
2.如權利要求1所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，所述種子液按照如下方法製備: Ca) 一級種子培養:將活性枯草芽孢桿菌菌液按照體積比例0.8%至1.5%接種到一級種子培養基，控制培養溫度31攝氏度至33攝氏度之間，通氣量0.8VVM至1.2VVM，培養17小時至22小時，獲得一級種子液；所述一級種子培養基按照質量比例包括:葡萄糖1.5%至2.5%,尿素 0.15% 至 0.25%,蛋白腖 0.5% 至 1%，NaCl0.1% 至 0.3%, (NH4) 2S040.2% 至 0.7%,酵母粉1%至3%，調pH在6.5至7.5之間； (b) 二級種子培養:將一級種子液按照體積比例1%至3.5%接種到二級種子培養基，控制培養溫度33至36攝氏度之間，通氣量IVVM至1.5VVM，培養8小時至12小時獲得所述種子液；所述二級種子培 養基按照質量比例包括:葡萄糖3%至8%，酵母粉1%至3%，(NH4)2SO40.5% 至 1.5%，穀氨酸鈉 0.8% 至 1.5%，大豆蛋白腖 1% 至 2%，KH2PO40.1% 至 0.3%，MgSO4.7Η200.003% 至 0.015%, MnSO4.7Η200.0005% 至 0.0025%, FeSO4.7Η200.0005% 至0.0025%,調 pH 在 6.6 至 6.8 之間。
3.如權利要求1所述的鳥苷生產方法，其特徵在於，步驟(1)所述的培養基，按照質量比例包括:葡萄糖 15% 至 25%，穀氨酸鈉 0.5% 至 2%，KH2PO40.1% 至 0.3%，MgSO4.7Η200.08%至 0.2%, MnS04.7Η200.0005% 至 0.002%, FeS04.7Η200.0005% 至 0.002%,消泡劑 0.02% 至0.1，調節ρΗ6.5至7.5之間。
4.如權利要求1所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，步驟(2)所述的對數生長期為發酵開始後16小時以內。
5.如權利要求4所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，步驟(2)所述的氮源為生物肽素或酵母粉。
6.如權利要求4所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，步驟(2)分2到6次添加。
7.如權利要求1所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，步驟(3)所述的生長期為發酵開始後16小時至40小時；所述核苷類似物為鳥苷、次黃嘌呤或核糖核酸。
8.如權利要求1所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，步驟(3)的6-磷酸葡萄糖脫氫酶激活劑為檸檬酸鈉或可溶性鈣鹽。
9.如權利要求1所述的鳥苷的生產方法，其特徵在於，步驟(4)所述衰亡期為發酵開始後40小時至48小時。
【文檔編號】C12P19/40GK103882078SQ201410141404
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】何峰, 何謐, 劉守德, 田洪敏, 李 和, 項磊, 劉幸 申請人:湖北普信工業微生物應用技術開發有限公司