一種甜葉菊酚類提取物及其在降血脂製品中的應用的製作方法

2023-04-25 19:25:34

本發明屬植物提取物
技術領域：
，涉及一種甜葉菊酚類提取物及其在降血脂製品中的應用。
背景技術：
：甜葉菊（Steviarebaudiana）屬菊科多年生草本植物，原產於南美巴拉圭和巴西，是目前已知甜度較高的糖料植物之一，已成為繼蔗糖、甜菜糖之後的第三種天然糖源。目前，中國是世界最大的甜菊糖苷生產及供應國，佔全球總量的80%以上。甜葉菊中除甜菊糖苷外還含有黃酮、綠原酸等多種成分，且這些成分具有重要的生物活性，如抗菌、降血壓、降血脂等，在其發源地作為甜茶、藥茶飲用已有一百多年的歷史。甜菊糖苷生產現多採用熱水浸提，提取液經絮凝、樹脂純化和乾燥製得。甜葉菊酚類物質在甜菊糖苷生產過程中作為雜質存在，需在後續工藝中將其去除，不僅造成資源的浪費，還對環境造成了極大的汙染。本專利中，申請人對甜葉菊黃酮和綠原酸等甜葉菊酚類提取物的降血脂活性進行了考察，發現其可顯著改善脂質代謝紊亂的效果，減少小鼠肝臟脂肪沉積，減輕和預防脂肪肝形成的功能，為其在製備降血脂製品中的應用提供科學依據，亦為甜葉菊綜合應用開發奠定了基礎。技術實現要素：為提高甜葉菊綜合利用價值，本發明提供了一種甜葉菊酚類提取物，本發明另一個目的在於提供甜葉菊酚類提取物的降血脂活性及其在製備降血脂製品中的應用。為實現上述發明目的，本發明採用以下技術方案予以實現：一種甜葉菊酚類提取物，所述提取物是以黃酮和綠原酸為主要成分的多酚類化合物。本發明所述甜葉菊酚類提取物中包括黃酮含量為5.0-85.0wt%，綠原酸含量為10.0-90.0wt%。本發明所述甜葉菊酚類提取物中黃酮成分為槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-O-[4'''-O-反式-咖啡醯基-α-L-鼠李糖-(1→6)-β-D-半乳糖苷]、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷中的任意一種或幾種，苷元為槲皮素、山奈酚、芹菜素和木犀草素中的任意一種或幾種。本發明該甜葉菊酚類提取物中綠原酸成分為咖啡酸、3-咖啡醯基奎尼酸、4-咖啡醯基奎尼酸、5-咖啡醯基奎尼酸、3,4-二咖啡醯基奎尼酸、3,5-二咖啡醯基奎尼酸、4,5-二咖啡醯基奎尼酸、5-阿魏醯基奎尼酸中的任意一種或幾種。本發明所述甜葉菊酚類提取物製備方法如下：（1）取甜菊葉原料，加水提取，提取液過陶瓷膜；提取用水量為原料的10-30倍，提取溫度為15-85℃，傳統間歇提取三次或採用三級連續逆流提取，陶瓷膜選用膜管為5-100nm膜管；（2）陶瓷膜透過液上大孔吸附樹脂1吸附，鹼洗，乙醇解析，解析液濃縮回收乙醇後分別過脫鹽、脫色、精脫樹脂，乾燥得甜菊糖苷產品；選用的吸附樹脂為P20、ADS-4、69M、T28、DM30、001×6、001×8、201-H、SQ338、330中的任意一種或幾種；鹼洗液為NaOH、KOH、氨水中的一種或任意組合，質量濃度為0.2-2%的或pH8.5-9.5，鹼洗液用量為1-3BV，速度為1-3BV/h；（3）下注水和調酸後鹼洗液混合，上吸附樹脂2，水洗，乙醇水溶液解析，濃縮回收溶劑，乾燥得甜葉菊酚類提取物；所用吸附樹脂2為LX-200B、LX-2007、SD-300、LSA-21、HZ841中的一種或任意組合；下注水和調酸後鹼洗液上柱流速1-3BV/h，調酸用鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸中的一種或幾種，酸性溶液為摩爾濃度為0.1-18mol/L，調pH至0.5-6.5；水洗用量1-3BV，水洗流速1-3BV/h，解析用乙醇濃度為10-85%，用量為1-5BV，洗脫流速為1-3BV/h；濃縮採用薄膜濃縮、減壓濃縮中的一種或組合；乾燥採用噴霧乾燥、脫味鍋真空乾燥、迴轉罐真空乾燥、烘箱乾燥中的一種或組合。本發明的另一目的在於提供上述的甜葉菊酚類提取物在製備降血脂的藥物或食品中的應用。本發明所述的一種甜葉菊酚類提取物在製備改善脂質代謝紊亂的藥物或食品中的應用。本發明所述的一種甜葉菊酚類提取物在製備減輕和預防脂肪肝形成的藥物或食品中的應用。本發明所述藥物或食品是以甜葉菊酚類提取物為活性成分製備而成的口服劑、注射劑或外用製劑。本發明的設計思路是：本發明從甜葉菊中提取得到的甜葉菊酚類提取物在製備降血脂製品中的應用，該甜葉菊酚類提取物包括黃酮含量為5.0-85.0wt%，綠原酸含量為10.0-90.0wt%。本發明證實，該甜葉菊酚類提取物能夠顯著降低小鼠血液中的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量，改善脂質代謝紊亂，並可顯著減少小鼠乾燥脂肪沉積，減輕和預防脂肪肝的形成，具有良好的降血脂功效。本發明甜葉菊酚類提取物中黃酮和綠原酸的檢測方法參考專利201510339325.7中提供的黃酮和綠原酸的檢測方法。採用上述技術方案所產生的有益效果是：本發明提供的甜葉菊酚類提取物具有原料來源豐富、易於產業化、無毒副作用等優點，作為降血脂製品開發前景廣闊。附圖說明圖1為實施例2中NC組小鼠肝組織油紅"O"染色片；圖2為實施例2中MC組小鼠肝組織油紅"O"染色片；圖3為實施例2中甜葉菊多酚提取物高劑量組小鼠肝組織油紅"O"染色片。註：NC，正常對照組；MC，模型對照組。具體實施方式實施例1本實施例採用高脂飲食建立小鼠高血脂模型。經甜葉菊分類提取物飼餵小鼠10周後，小鼠血脂指的影響。實驗方案1）常規飼料成分碳水化合物：59%，蛋白質：21.1%，纖維：4.9%，脂肪：4.2%，灰分：8%，磷：1%，鈣：1.8%。）高脂飼料成分碳水化合物48%，蛋白質21.1%，脂肪4.2%，纖維4.7%，灰分8%，磷1%，鈣1.8%，豬油10%，膽酸鹽0.2%，膽固醇1%。）動物分組及造模方法先將ICR小鼠飼養一周，餵飼正常飼料，自由採水、採食。1周後按體重隨機分成7組，即正常對照組，模型對照組，陽性對照組，甜葉菊多酚提取物低、高劑量組，茶多酚組、銀杏黃酮組。除正常對照組餵飼普通飼料外，其餘各組均餵飼高脂飼料，各組動物自由採水、採食。試驗周期為10周。低、高劑量的灌胃量依次為：5g/kgb.w.和20g/kgb.w.，茶多酚和銀杏黃酮的灌胃劑量為：20g/kgb.w.。）降脂試驗動物實驗開始後，按上述說明的劑量進行灌胃，正常對照組和模型對照組採用蒸餾水進行灌胃。連續10周，試驗期間隨體重調整給藥量。第5，10周，各組小鼠禁食不禁水12h，測定血清中血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、直接低密度脂蛋白（LDL-C）和直接高密度脂蛋白（HDL-C）含量；在實驗結束時，動物給藥後禁食12-14h，不限飲水，摘眼球採血，解剖小鼠，取其肝、脾、腎，稱其重量後，其中一部分肝進行組織切片觀察5）血清血脂的測定小鼠禁食（不禁水）12h，於眼球後靜脈叢採血，於3500rpm離心20min，分離血清，TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。以上指標採用日本東芝醫療系統株式會社TBA-40全自動生化分析儀測定，具體操作按試劑盒說明進行。）甜葉菊酚類提取物的製備稱取100kg甜菊葉，加1.5m3水，65℃提取，重複提取三次，合併提取液，過5nm陶瓷膜。透過液上201-H吸附樹脂，1BV水洗，水洗流速1BV/h，1.5BV0.4%NaOH水溶液洗，流速1BV/h，乙醇解析，解析液濃縮回收乙醇後分別過脫鹽、脫色、精脫樹脂，乾燥得甜菊糖苷產品。鹼洗液用1mol/L的鹽酸水溶液調pH至3.5，和下注水混合，上吸附樹脂SD-300，上柱流速1.5BV/h。2BV水洗，水洗流速1.5BV/h。2BV50%乙醇水溶液解析，解析流速1BV/h。減壓濃縮，回收乙醇溶劑，脫味鍋真空乾燥得甜葉菊多酚提取物2.0kg。檢測甜葉菊酚類提取物總黃酮和總綠原酸含量分別為20%和75%，黃酮類成分為槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-O-β-D-阿拉伯糖苷、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；綠原酸成分為咖啡酸、3-咖啡醯基奎尼酸、4-咖啡醯基奎尼酸、5-咖啡醯基奎尼酸、3,4-二咖啡醯基奎尼酸、3,5-二咖啡醯基奎尼酸、4,5-二咖啡醯基奎尼酸、5-阿魏醯基奎尼酸。）統計分析每個實驗至少重複3次，其中細胞實驗重複6次，結果用平均值±SD表示。數據統計用SPSS13.0統計軟體進行處理，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。）實驗結果採用高脂飲食建立小鼠高血脂模型。經甜葉菊多酚提取物飼餵小鼠10周後，小鼠血脂指標見表1。模型對照組飲食誘導10周後，小鼠血清LDL-C、TC、TG水平高於正常對照組且有極顯著差異。甜葉菊多酚提取物各劑量、茶多酚高劑量、銀杏黃酮高劑量均能夠顯著降低模型組小鼠血液中的LDL-C、TC和TG含量，小鼠血清血脂四項指標與模型對照組比較具有顯著差異。這說明甜葉菊多酚提取物、茶多酚、銀杏黃酮均具有改善脂質代謝紊亂的效果。其中，甜葉菊多酚提取物的降血脂效果最為顯著，與模型組相比，LDL-C、TC和TG含量分別降低了37.0%、27.8%、23.2%。甜葉菊多酚提取物的降血脂效果明顯優於茶多酚，並與銀杏黃酮相當。表1.幹預10周後小鼠的血脂譜LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）NC0.39±0.05**3.57±0.47**3.78±0.53**1.08±0.12*MC0.73±0.125.27±0.365.82±0.311.38±0.25甜葉菊多酚提取物H0.46±0.04**3.86±0.34**4.20±0.39**1.06±0.19**甜葉菊多酚提取物L0.55±0.07**4.60±0.37**4.95±0.36**1.08±0.21**茶多酚H0.44±0.06**3.84±0.47**4.00±0.49**1.00±0.26**銀杏黃酮H0.46±0.06**4.37±0.55**4.65±0.56**0.94±0.16**註：NC，正常對照組；MC，模型對照組；H，高劑量；L，低劑量。與MC比較，*P<0.05，**P<0.01。實施例2本實施例提供了甜葉菊酚類提取物對高血脂小鼠肝組織病理形態學的影響。實驗方案小鼠的飼餵及造模方法同實施例1。1）小鼠肝臟組織學觀察小鼠殺死後取其右肝前頁於10%中性福馬林溶液中固定，冷凍液包埋，冷凍切片，油紅「O」染色，光學顯微鏡下觀察組織形態變化，以確定脂肪在肝組織中堆積程度。2）甜葉菊酚類提取物的製備稱取100kg甜菊葉，加3.0m3水，60℃三級連續逆流提取，提取液過50nm陶瓷膜。透過液上T28吸附樹脂，1.5BV水洗，水洗流速1BV/h，1.5BVpH=9.0的氨水溶液洗，流速1BV/h，乙醇解析，解析液濃縮回收乙醇後分別過脫鹽、脫色、精脫樹脂，乾燥得甜菊糖苷產品。鹼洗液用18mol/L的硫酸溶液調pH至5.0，和下注水混合，上吸附樹脂HZ841，上柱流速1.0BV/h。3BV水洗，水洗流速2.0BV/h。2BV65%乙醇水溶液解析，解析流速1.5BV/h。減壓濃縮，回收乙醇溶劑，噴霧乾燥得甜葉菊多酚提取物3.0kg。檢測甜葉菊酚類提取物總黃酮和總綠原酸含量分別為15%和60%，黃酮類成分為槲皮素、槲皮苷、芹菜素、芹菜素-4'-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素和山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷；綠原酸成分為咖啡酸、3-咖啡醯基奎尼酸、4-咖啡醯基奎尼酸、5-咖啡醯基奎尼酸、3,4-二咖啡醯基奎尼酸、3,5-二咖啡醯基奎尼酸、4,5-二咖啡醯基奎尼酸、5-阿魏醯基奎尼酸。3）統計分析每個實驗至少重複3次，其中細胞實驗重複6次，結果用平均值±SD表示。數據統計用SPSS13.0統計軟體進行處理，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。4）實驗結果經過10周試驗，製備小鼠肝臟切片進行油紅O染色，觀察肝組織脂肪沉積情況（圖1）。正常對照組肝細胞內僅可見個別大小不一的脂肪空泡，呈陰性。模型對照組小鼠肝細胞內可見瀰漫性小的紅染脂肪空泡，說明在肝組織中脂肪沉積程度嚴重，重度脂肪肝。甜葉菊多酚提取物高劑量組小鼠肝細胞紅染脂肪空泡明顯減少，輕度脂肪肝。該研究結果表明甜葉菊多酚提取物具有顯著減少小鼠肝臟脂肪沉積，減輕和預防脂肪肝形成的功能。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp