一種對腦膜炎奈瑟氏菌的its特異的核苷酸及其應用的製作方法
2023-04-25 15:07:26
專利名稱：一種對腦膜炎奈瑟氏菌的its特異的核苷酸及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種對腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA_23S rRNA基因間區(Internal transcribed spacer，以下簡稱ITS)特異的寡核苷酸及其應用。
背景技術：
人類是腦膜炎奈瑟氏菌的唯一宿主。腦膜炎奈瑟氏菌作為條件致病菌，常存在於患者或帶菌者的鼻咽腔黏膜中，約有5 10%的健康人鼻咽部帶有本菌，流行期高達20 70%，其排菌時間可達數周至2年。病原菌借飛沫直接由空氣傳播，大部分感染者臨床症狀不明顯，因此很多感染者成為無症狀的攜帶者。在非流行期，發病率在1/10 3/10萬左右， 而在流行期，發病可高達500/10萬，對6個月到2歲的嬰幼兒及青少年危害極大，即使在及時和適當的照顧下，該病的致死率也有10%到20%甚至超過50%。大約20%的人群在任何給定時間都有腦膜炎奈瑟氏菌寄生，無論是在發展中國家或是發達國家均可以引起較高的流腦發病率和死亡率。流行性腦脊髓膜炎是由腦膜炎奈瑟氏菌引起的急性化膿性腦膜炎，為急性呼吸道傳染病。我國流腦發病率有明顯上升的趨勢，暴發流行時有發生，對我國人民的生命健康構成極大威脅。主要臨床表現為發熱、頭痛、嘔吐、皮膚黏膜瘀點、瘀斑及腦膜刺激徵，重者可有敗血症性休克和腦膜腦炎，腦脊液可呈化膿性改變。流行性腦膜炎常見的併發症為關節炎、硬腦膜下積液或積膿。暴發性敗血症的致死率高於流行性腦脊髓膜炎。每年大約有一百萬人感染細菌性腦膜炎，並有20萬人因此死亡。54%的倖存者會留下殘疾，包括失聰， 智力遲鈍、失明、肢體癱瘓、智能及精神改變和腦積水。目前，對腦膜炎奈瑟氏菌傳統的診斷主要依靠對腦脊液的塗片鏡檢、病原體培養、 免疫學檢查抗原抗體以及從腦脊液、血液中分離培養出腦膜炎奈瑟氏菌。該法確診腦膜炎奈瑟氏菌感染至少需2 3天，其中血清學鑑定因其靈敏度不夠高，影響因素較多，有時難於作出可靠診斷，尤其在大規模流行病學調查時，常因工作量大，檢測者經驗不足、情緒波動等主觀因素而影響結果可信度。傳統方法特異性差、靈敏度低且費時。腦膜炎奈瑟菌對乾燥、寒冷、熱、陽光等非常敏感，在室溫中3小時就死亡，同時受抗生素使用及其他非特異性因素的影響，單獨採用細菌培養方法會導致腦膜炎奈瑟菌漏檢。近年來，越來越多的分子技術用於病原菌的鑑定、檢測及病害診斷中，包括轉錄間隔區(ITS)序列分析、隨機擴增長度多態性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態性(RFLP)分析等。和傳統檢測技術相比，這些基於多聚酶鏈式反應(PCR)的分子檢測技術， 不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強等優點。核糖體內轉錄間隔區(ITS)，是介於16S rRNA和23S rRNA之間的區域，在幾乎所有細菌的基因組中都以單拷貝或多拷貝的形式存在，相對較短(200bp-1000bp)。該區域進化速率較快，具有超變位點，它的變異速率相當於16S rRNA或者23S rRNA的十倍左右，在種內不同菌株間高度保守，而在細菌的種間存在著豐富的變化。因此具有很高的解析度，更易區分開進化關係很近的菌種，大大增強了檢測的特異性。可以為研究細菌的系統發育、分類鑑定和分子檢測提供豐富的遺傳信息。螢光定量PCR法的檢出率高於常規PCR法，並且具有靈敏度高、特異性強、重複性好、 自動化程度高等特點。它的技術更先進，操作更便捷，避免常規PCR反應後檢測的煩瑣步驟，並能達到實時監測、絕對定量的目的。無論是在陽性符合率和陰性符合率上都要優於分離培養法和直接塗片法，能檢測一些不能被培養或者很微量的樣品，對樣品運輸條件也比較寬鬆。螢光定量PCR法檢測腦膜炎奈瑟氏菌具有高靈敏性、高特異性和高精確定量等特點，可為流腦檢查提供一種快速、方便的病原學診斷手段，具有實用價值。該技術相對於傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離心及裂解製備細菌DNA模板，就可以在高特異性引物及探針介導下的螢光定量PCR過程中擴增目標序列，發出螢光信號，達到檢測樣品中是否含有待測的致病性微生物的目的。螢光定量PCR的擴增過程僅需1個小時。 這對檢驗檢疫部門和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。
發明內容
本發明的一個目的是提供了一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸；本發明的另一個目的是提供該特異核苷酸的應用，設計引物和探針，通過優化和設計，提供一種用於檢測腦膜炎奈瑟氏菌的螢光定量PCR試劑盒，並利用該螢光定量PCR試劑盒檢測腦膜炎奈瑟氏菌的存在。本發明的目的通過以下技術方案實現一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO) 1-3所示的核苷酸序列或者其互補DNA或RNA序列；b)不同於a)但編碼的胺基酸序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個或多個鹼基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟(1)基因組的提取；⑵通過PCR擴增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)構建ITS克隆；(4)對ITS克隆測序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異引物和探針的篩選。上述的核苷酸的應用，可將所述核苷酸作為引物和探針用於螢光定量PCR試劑盒或一般PCR試劑盒、作為探針用於雜交反應與螢光檢測，或者用於製造基因晶片或微陣列以檢測細菌。其中的SEQ ID NO :1(5，-ACAAATCAAAACGGAAGAATGGA-3，)是上遊引 物，SEQ ID NO :2(5，-TCAGCATTTTGTTCTTGGTCAAG-3，)是下遊弓丨物，SEQ ID NO: 3 (5，-CAGAATCCATTCAGGGCGACG (A) TCAC-3，，第 21 位為 G/A 簡併)是探針。上述上遊引物SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3均是根據腦膜炎奈瑟氏菌的tRNA-IA類型ITS設計合成的寡核苷酸，位於ITS序列上的287-359鹼基位置。該引物可在試管中由DNA聚合酶選擇性的複製合成介於兩引物之間的DNA區段(針對腦膜炎奈瑟氏菌為73bp靶DNA片段)，可以將極其微量的(lpg DNA)目的基因在較短的時間內(1 小時)擴增到螢光檢測可區分的水平。上述螢光定量PCR檢測試劑盒包括如下試劑25mM MgCl2 50 μ 1 ；IOmM dNTP10 μ 1 ；IOX酶特異性反應緩衝液50 μ 1 ；5υ/μ 1耐熱DNA聚合酶5μ 1 ；引物和探針各 10 μ 1 ；陽性對照品10 μ 1，陰性對照品10 μ 1 ；超純水1ml。本發明還涉及上述的螢光定量PCR試劑盒在檢測腦膜炎奈瑟氏菌中的應用。上述針對腦膜炎奈瑟氏菌的螢光定量PCR檢測試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理_擴增_觀察結果。引物、探針和螢光定量PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理後的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。使用上述的螢光定量PCR試劑盒檢測腦膜炎奈瑟氏菌的螢光定量PCR檢測方法包括以下步驟(1)提取待測臨床樣品模板； (2)在8聯PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2UOX酶特異性反應緩衝液、rTaq聚合酶、引物、探針、待測樣品模板和超純水，混勻；(3)將8聯薄壁PCR管中混勻的混合物在螢光定量PCR儀上擴增；(4)記錄結果，分析並進行結果判斷。上述步驟(1)中的臨床樣品模板為是臨床樣品中的腦脊液、血液或皮膚出血斑內容物或帶菌者的鼻咽拭子標本粗提液，或是腦膜炎奈瑟氏菌的純培養物的粗提液，或是純 DNA,或者是陽性對照品和陰性對照品。上述步驟(1)中的臨床樣品模板的提取方法為(1)取培養物1. 5ml，在12000rpm條件下常溫離心5分鐘，去掉上清液；(2)取500 μ 1的超純水重懸沉澱，在12000rpm條件下常溫離心5分鐘，去掉上清液，控幹；(3)取100 μ 1超純水重懸沉澱，在100°C沸水中水浴10分鐘；(4) 12000rpm條件下離心10分鐘；(5)取5 μ 1中層上清做為螢光定量PCR反應的模板。上述步驟(3)中的螢光定量PCR儀上的反應循環參數包括DNA的變性、復性、延伸的溫度和時間、循環次數，具體為前期為使變性能夠達到所需溫度而必需的前期處理過程的一個循環為95°C，2分鐘；變性溫度和時間為95 °C，15秒；復性和延伸溫度和時間為60°C，60秒；變性、復性、延伸的循環次數為40個循環。待反應結束後直接觀察反應示意圖即可得到檢測結果。本發明通過配製一種可檢測腦膜炎奈瑟氏菌的可產業化生產的螢光定量PCR試劑盒，將螢光定量PCR檢測方法需要使用的組分組合在一起，使用時，提取待測樣品，同時經過較為簡單的操作程序就可以進行快速、靈敏、簡便的檢測、試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗所得，用該試劑盒檢測腦膜炎奈瑟氏菌僅需一臺電腦和一臺螢光定量PCR儀， 操作簡單，檢測成本較低。使用陽性和陰性對照品的目的是用於質控整個操作過程，以便得出準確的判斷。 若含有腦膜炎奈瑟氏菌，則從結果中可以觀察到與陽性對照品一樣在35個循環以前起峰；若不含有腦膜炎奈瑟氏菌，則與陰性對照品一樣不起峰。本發明一次檢測試驗所使用的實際盒中的試劑量為引物探針各0.5 μ 1，IOmM dNTPO. 5μ Ι,ΙΟΧ酶特異性反應緩衝液2. 5μ 1，5υ/μ 1耐熱DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，餘下的體積在除去5 μ 1待測樣品的量後用超純水補足至25 μ 1。本發明中的耐熱DNA聚合酶為rTaq聚合酶。上述的陽性對照品為已確定是腦膜炎奈瑟氏菌的樣品，陰性對照品則為經實驗室確定不是腦膜炎奈瑟氏菌的樣品，如大腸桿菌。本螢光定量PCR試劑盒若用腦膜炎奈瑟氏菌的菌懸液進行螢光定量PCR反應，與經提取得到的DNA作為模板反應所得結果一致。敏感度和特異性無差別，這樣，可省去模板 DNA的提取步驟，使操作方法得以簡化。同時，相比常規微生物檢測方法而言，本方法所採用的待測樣品可以直接是臨床樣品培養液，或者對檢測樣品進行簡單分離培養就可進行檢測，因而節省了人力物力。本發明公開的對腦膜炎奈瑟氏菌(簡稱ITS)特異的寡核苷酸及其應用與現有技術相比，本發明具有如下優點(1)實用性強本發明所配製的螢光定量PCR試劑盒配製方法簡便，檢測周期短、速度快，可操作性強，易於產業化生產，而檢測成本卻相對較低，市場應用前景廣。(2)準確性高本發明通過對腦膜炎奈瑟氏菌及奈瑟氏菌屬內其他6個種的ITS克隆、測序並進行序列比對，找到腦膜炎奈瑟氏菌ITS的特異區，設計出引物及探針，能夠直接將腦膜炎奈瑟氏菌和其近源菌種分開。本發明者對15株腦膜炎奈瑟氏菌的標準菌株、20株奈瑟氏菌屬其他菌株以及6株近緣標準株進行了擴增，結果發現，本發明的檢測方法的準確率高達 100%。(3)靈敏度高本發明提供的腦膜炎奈瑟氏菌檢測試劑盒及其檢測方法具有相當高的敏感性，檢測精度高，可以檢測到Ipg/μ 1的DNA模板。
圖1為腦膜炎奈瑟氏菌種屬間特異性的檢測峰圖，其中起峰的樣品為腦膜炎奈瑟氏菌其中一株標準株，其他不起峰的樣品為表2中所列各其他非腦膜炎奈瑟氏菌的菌株。圖2為腦膜炎奈瑟氏菌種內保守性的檢測峰圖。其中不起峰者為陰性對照，其餘為腦膜炎奈瑟氏菌各標準株。圖3為螢光定量P CR試劑盒檢測結果峰圖，其中4條起峰帶為腦膜炎奈瑟氏菌，其餘兩條未起峰帶為非腦膜炎奈瑟氏菌的其他菌株。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的條件。實施例1 基因組的提取 使用血平板或巧克力平板37°C過夜培養腦膜炎奈瑟氏菌，收集細菌。用500ul 50mMTris-HCl (pH8. 0)和 1Oul 0. 4M EDTA 重懸細胞，37 °C 溫育 20 分鐘，然後加入 IOul 10mg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之後加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10% SDS, 50°C溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNaSe，65°C溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘餘的酚。上清液用2倍體積乙醇沉澱DNA，用玻璃絲卷出DNA 並用70%乙醇洗DNA，最後將DNA重懸於30ul TE中。基因組DNA通過0. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實施例2 通過PCR擴增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS以腦膜炎奈瑟氏菌的基因組為模板通過PCR擴增其ITS。首先根據ITS—端的 16SrRNA基因的保守區設計上遊引物(5，-TGT ACA CAC CGC CCG TC-3，見序列表1)，再根據23S rRNA基因的保守區設計下遊引物(5』_GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3』見序列表 1)。PCR反應程序如下在94°C預變性5分鐘；然後94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C 延伸1分鐘，這樣進行30個循環；最後，在72°C繼續延伸5分鐘，得到PCR產物，用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性。合併3管PCR產物，並用上海生工生物工程技術公司的UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產物條帶；實施例3 構建ITS克隆首先是連接產物的獲得將PCR純化產物與Promega公司的3 X 1O"3的pGEM-T-Easy載體於16°C連接24小時，總體積為IOy 1，其中有1μ 1的IOXbuffer和0. 5單位的T4DNA連接酶，得到連接產物。其次是感受態細胞的製備參照Bio-Rad公司提供的方法製備大腸桿菌DH5 α感受態細胞。取一環大腸桿菌DH5 α單菌落於5ml的LB培養基中，180rpm培養10小時後，取2ml培養物轉接到200ml 的LB培養基中，37°C 250rpm劇烈振蕩培養到0D6000. 5左右，然後冰浴冷卻20分鐘，於 40C 4000rpm離心15分鐘。傾盡上清液，用冷的冰預冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，於 40C 4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預冷的去離子滅菌水IOOml吹散菌體，於4°C 4000rpm 離心15分鐘。用冷的冰預冷的10%的甘油懸浮細胞，4°C 6000rpm離心10分鐘，棄上清液， 最後沉澱用Iml冰預冷的10%的甘油懸浮細胞，即為感受態細胞。將製得的感受態細胞分裝為60ul —管，-70°C保存。最後是電轉化感受態細胞取2_3ul連接產物與60ul感受態大腸桿菌DH5 α混合後，轉到Bio-Rad公司的 0. 2cm的電擊杯中電擊，電壓為2. 5千伏，時間為5. O毫秒-6. O毫秒。電擊後立即在杯中加入Iml的SOC培養基使菌復甦。然後立即將菌塗在含有氨苄青黴素、X-Gal和IPTG的LB 固體培養基上37°C倒置過夜培養，次日得到藍白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨苄青黴素的LB液體培養基上培養，同時從每個克隆中提取質粒並用EcoRI酶切鑑定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群即為腦膜炎奈瑟氏菌的ITS克隆。
實施例4 對ITS克隆測序挑選有插入片段8個克隆由用ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段雙向進行測序，從而獲得含tRNA-IA基因的ITS的序列。實施例5 特異引物及探針的篩選針對腦膜炎奈瑟氏菌ITS的特異區設計引物及探針；在特異區設計上下遊引物及探針(上遊引物是5，-ACAAATCAAAACGGAAGAATGGA-3，，見序列SEQ ID NO 1 ；下遊引物是 5，-TCAGCATTTTGTTCTTGGTCAAG-3，，見序列 SEQ ID NO :2，探針是 5，-CAGAATCCATTCAGGGCGACG(A)TCAC-3，，見序列 SEQ ID NO :3)。我們收集了 15 株腦膜炎奈瑟氏菌的標準菌株、20株奈瑟氏菌屬其他菌株以及6株近緣標準株驗證引物的特異性， 菌株編號和來源見表2。以這41個菌株的基因組為模板進行螢光定量PCR，體系為IOuM引物及探針 0. 5ul、25mM MgCl22. 5ul UO X buffer 2. 5ul、10mM dNTP 0. 5ul、5U/ulrTaq 聚合酶0. 3ul及5ul的待測樣品模板到0. 2ml的8聯薄壁PCR管中，最後用超純水補足至25ul。 引物及探針在腦膜炎奈瑟氏菌標準株中得到陽性結果，其他菌株沒有起峰，所以該寡核苷酸對腦膜炎奈瑟 氏菌及其ITS都是高度特異的，實驗結果見圖1及圖2。所用引物序列見表 1，所用菌株見表2。表 權利要求
1.一種對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO :1_3所示的核苷酸序列或者其互補DNA或RNA序列；b)不同於a)但編碼的胺基酸序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個或多個鹼基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
2.—種權利要求1所述的對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異核苷酸的分離方法包括下述步驟(1)基因組的提取；(2)通過PCR擴增腦膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)構建ITS 克隆；(4)對ITS克隆測序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特異引物和探針的篩選。
3.權利要求1所述的對腦膜炎奈瑟氏菌的ITS特異的核苷酸作為引物和探針用於螢光定量PCR試劑盒或一般PCR試劑盒或作為探針用於雜交反應與螢光檢測或用於製造基因晶片或微陣列以檢測細菌方面的應用。
4.權利要求3所述的應用，其中的螢光定量PCR試劑盒，包括引物、探針、dNTP、緩衝液和DNA聚合酶；所述的螢光定量PCR引物和探針包括1)SEQID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列；2)不同於1)但編碼的胺基酸序列與1)所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；3)上述幻或幻中缺失、替換或插入一個或多個鹼基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
5.權利要求3所述的應用，其中的螢光定量PCR檢測試劑盒包括如下試劑25mM MgCl250 μ 1 ；IOmM dNTP 10 μ 1 ；IOX酶特異性反應緩衝液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐熱DNA聚合酶 5 μ 1 ；引物和探針各10 μ 1 ；陽性對照品10 μ 1，陰性對照品10 μ 1 ；超純水lml。
6.一種含有對腦膜炎奈瑟氏菌ITS特異的核苷酸的螢光定量PCR試劑盒在檢測腦膜炎奈瑟氏菌中的應用。
7.—種檢測腦膜炎奈瑟氏菌的螢光定量PCR檢測方法包括以下步驟(1)提取待測臨床樣品模板；(2)在8聯PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、10X酶特異性反應緩衝液、rTaq聚合酶、引物、探針、待測樣品模板和超純水，混勻；(3)將8聯薄壁PCR管中混勻的混合物在螢光定量PCR儀上擴增；(4)記錄結果，分析並進行結果判斷；其中上述步驟(1)中的臨床樣品模板為是臨床樣品中的腦脊液、血液或皮膚出血斑內容物或帶菌者的鼻咽拭子標本粗提液或是腦膜炎奈瑟氏菌的純培養物的粗提液或是純 DNA，或者是陽性對照品和陰性對照品；上述步驟(3)中的螢光定量PCR儀上的反應循環參數包括DNA的變性、復性、延伸的溫度和時間、循環次數，具體為前期為使變性能夠達到所需溫度而必需的前期處理過程的一個循環為95°C，2分鐘；變性溫度和時間為95°C，15秒；復性和延伸溫度和時間為60°C，60秒；變性、復性、延伸的循環次數為40個循環；待反應結束後直接觀察反應示意圖即可得到檢測結果。
全文摘要
本發明涉及一種對腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA-23S rRNA基因間區(Internal transcribed spacer，簡稱ITS)特異的寡核苷酸SEQ ID NO1-SEQ ID NO3及其應用，並提供了一種用本發明的寡核苷酸為引物及探針的螢光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，利用該螢光定量PCR試劑盒對人體及環境中的腦膜炎奈瑟氏菌進行檢測，簡便快速、特異性好、靈敏度高，可用於食品和臨床樣品的監督和檢測、食物中病原菌檢測、細菌學分類及流行病學調查等領域，具有深遠的社會效益和較大的經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK102154466SQ20111000482
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月11日 優先權日2011年1月11日
發明者何欣, 孫亞民, 曹勃陽, 王敏, 王磊 申請人:天津生物晶片技術有限責任公司