先兆子癇的篩選的製作方法

2023-04-25 13:10:16 2

專利名稱：：先兆子癇的篩選的製作方法
技術領域：
：本發明涉及對先兆子癇(pre-eclampsia)和宮內發育遲緩(intrauterinegrowthrestriction，IUGR)易感性的診斷及其發生的預防。
背景技術：
：在英國，先兆子癇是一種常見的疾病，它影響3-5％的人類妊娠並造成40％的醫源性分娩(iatrogenicdeliveries)。它是還包括子癇、潛伏的慢性原發性高血壓、腎病和暫時性妊娠高血壓在內的高血壓疾病的一種。該疾病通常被定義為原本血壓正常的婦女在妊娠20周之後發生的伴有異常蛋白尿的急性高血壓(DaveyDAetal.AmJObstetGynecol1988158892-8)。通常它還伴有肺水腫、紫紺、肝功能損害、視覺或大腦障礙、上腹部區域或右上象限疼痛、血小板計數降低、宮內發育遲緩(IUGR)或者少尿症。目前，對先兆子癇的發病機理還知之甚少，因此限制了對可靠的預測性檢驗和有效的預防方法的開發。
發明內容非對稱二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶(NOS)的內源性抑制劑，ADMA與一氧化氮合酶的天然底物L-精氨酸的結合相競爭。它通過蛋白甲基轉移酶(PRMT)由蛋白中的甲基化精氨酸殘基產生，並且通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)代謝。ADMA在含有大量DDAHII的胎兒胎盤單位中生成。本發明人首次指出了ADMA水平在那些隨後發生先兆子癇並且其孩子發生IUGR的婦女體內升高。因此，本發明提供了鑑別孕婦是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生宮內發育遲緩(IUGR)的風險的方法。所述方法包括檢測孕婦的ADMA並由此確定該婦女是否有發生先兆子癇的風險，或者確定其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險。本發明進一步提供-ADMA抗體在製造用於確定婦女是否有發生先兆子癇的風險，或者確定其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險的裝置中的用途；-抑制或預防孕婦發生先兆子癇或者抑制或預防其所懷胎兒發生IUGR的方法，所述方法包括給予孕婦有效量的ADMA活性的拮抗劑；-ADMA活性的拮抗劑在製造用於抑制或預防先兆子癇或者抑制或預防IUGR的藥物中的用途；-非人類懷孕雌性動物，通過給予ADMA在所述動物中已引起先兆子癇；-非人類懷孕雌性動物，通過給予ADMA在其所懷胎兒中已引起IUGR；-非人類胎兒，通過對懷有該胎兒的非人類雌性動物給予ADMA在該胎兒中已引起IUGR；-在非人類懷孕雌性動物中引起先兆子癇或者在其所懷胎兒中引起IUGR的方法，所述方法包括給予該動物足以導致先兆子癇或IUGR劑量的ADMA；-鑑別預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR的物質的方法，所述方法包括對已經被引起先兆子癇或IUGR的動物給予候選物質並且評估該候選物質是否能夠預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR；-鑑別預防或治療先兆子癇或者治療或預防IUGR的物質的方法，所述方法包括對DDAH缺陷的懷孕動物給予候選物質並且評估該候選物質是否能夠預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR；以及-通過本發明的方法所鑑定的物質在製造用於預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR的藥物中的用途。圖1顯示根據是否出現雙側切跡(bilateralnotches)以及懷孕結局而分成不同組的婦女，在妊娠23-25周時，肱動脈的血流介導的擴張(FMD)。水平線表示每組的平均FMD。圖2顯示兩組孕婦(在子宮動脈都卜勒檢查中出現或不出現雙側切跡)中的血漿ADMA水平。水平線表示每組中ADMA水平的中值。圖3是在妊娠23-25周時具有子宮動脈雙側切跡並最終發生先兆子癇的孕婦組中，說明血流介導的擴張和血漿ADMA水平間關係的散點圖。發現二者呈顯著負相關(r＝-0.8，p＝0.005)。圖4顯示ADMA通過蛋白甲基轉移酶(PRMT)由蛋白中的甲基化精氨酸殘基合成，以及ADMA通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶I和II(DDAHI和II)的作用代謝為瓜氨酸。具體實施例方式診斷本發明涉及鑑別孕婦是否有發生先兆子癇的風險或者其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險的方法。因此本發明涉及診斷孕婦對先兆子癇的易感性，以及診斷胎兒對IUGR的易感性。所述孕婦為人類。所述胎兒為人類胎兒。被診斷的婦女或胎兒可以處於妊娠前三個月、妊娠中三個月或者妊娠末三個月。通常婦女或胎兒處於妊娠4-25周的孕期階段。婦女或胎兒可以處於妊娠23-25周的孕期階段。優選婦女或胎兒處於妊娠10-25周的孕期階段，更優選妊娠的15-25周。通常，所述婦女未患有先兆子癇或者未表現出先兆子癇的症狀。但是，本發明的方法也可以在患有先兆子癇但並未為此檢測過的婦女中實施。因此所述方法可以在表現先兆子癇早期症狀的婦女中實施。通常，所述胎兒未患有IUGR或者未表現出IUGR的症狀。但是，本發明的方法也可以在其所懷胎兒患有IUGR但並未為此檢測過的婦女中實施。因此所述方法可以在其所懷胎兒表現出IUGR早期症狀的婦女中實施。本發明包括測定婦女的ADMA。通常測定ADMA的水平或濃度。根據本發明，與正常的孕期水平相比，ADMA的水平升高表明婦女易患先兆子癇或有發生先兆子癇的風險，或者其所懷胎兒易患IUGR或有發生IUGR的風險。正常的孕期水平通常為在整個懷孕過程中，始終未表現出先兆子癇症狀或其所懷胎兒始終未表現出IUGR症狀的婦女中的ADMA水平。所述正常的孕期水平通常指在相應孕期階段的正常水平。在正常的未懷孕人群中，血漿ADMA的平均濃度通常為大約0.82μmol/L。一般而言，在正常孕婦中，血漿ADMA的平均濃度低於正常的未懷孕個體，並且在懷孕過程中始終保持相對穩定。對於懷孕4、10、15和25周的孕婦來說，正常孕期水平通常為大約0.3-0.6μmol/L，例如在血漿中為0.52μmol/L。在本發明中，與先兆子癇的易感性和發生風險增加相關聯，或者與IUGR的易感性和發生風險增加相關聯的升高的血漿ADMA水平通常大於約1.45μmol/L，大於約1.5μmol/L，或者大於約2.0μmol/L。根據本發明，ADMA在所述婦女中的水平/濃度優選與正常的孕期水平相比至少增加3倍而且通常至少增加4倍。所述ADMA水平/濃度與正常的孕期水平相比通常增加3-7倍。根據本發明，超出正常孕期水平95％置信區間的ADMA水平或濃度通常與先兆子癇或IUGR的發生風險增加相關聯。對稱二甲基精氨酸(SDMA)是ADMA無生物學活性的立體異構體。SDMA不通過DDAH代謝，而是經腎臟排洩。L-精氨酸/ADMA的比值通常用作NOS抑制的指標。ADMA/SDMA的比值通常反映DDAH的活性。本發明還可以包括評估ADMA/SDMA的比值從而確定發生先兆子癇的風險。根據本發明，與正常的孕期比值相比，升高的ADMA/SDMA比值表明該婦女易患先兆子癇或有發生先兆子癇的風險，或者其所懷胎兒易患IUGR或有發生IUGR的風險。正常的孕期比值是指在整個懷孕過程中，始終未表現出先兆子癇症狀或者其所懷胎兒始終未表現出IUGR症狀的婦女中的ADMA/SDMA比值。正常的ADMA/SDMA比值通常指在相應孕期階段的正常比值。對於懷孕4、10、15和25周的孕婦來說，正常的孕期比值通常在大約1∶1至1.3∶1，例如在血漿中為1.3∶1。在本發明中，與在23-25周時先兆子癇和IUGR的易感性和發生風險增加相關聯的升高的血漿ADMA/SDMA比值通常約為6.8∶1。根據本發明，ADMA/SDMA在所述婦女中的比值優選與正常的孕期水平(例如在懷孕的相同階段)相比至少增加5倍，並且更優選至少增加6倍。所述ADMA/SDMA比值與正常的孕期水平相比通常增加5至8倍。根據本發明，超出正常孕期比值95％置信區間的ADMA/SDMA比值與先兆子癇或IUGR的發生風險增加相關聯。本發明通常在體外對獲自所述婦女的樣本實施。所述樣本通常包括該婦女的體液，優選是血液、血漿、血清或尿液樣本，但也可以是羊水。所述樣本通常在檢測之前處理過，例如通過離心分離。所述樣本還通常在檢測之前保存，優選在-70℃以下。可以使用本領域已知的標準方法來檢測ADMA水平。這些方法通常包括將樣本與能夠結合ADMA的抗體相接觸。這類方法包括浸染棒測定法(dipstickassays)和酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。通常浸染棒包括一種或多種特異性結合ADMA的抗體或蛋白。如果出現一種以上的抗體，則所述抗體優選具有不同的未重疊決定簇以使它們能夠同時結合ADMA。ELISA是需要將試劑分離的異質、固相分析。ELISA通常採用夾心法或競爭法實施。夾心法需要兩種抗體。第一種抗體特異性結合ADMA並結合到固相支持物上。第二種抗體與通常為酶綴合物的標記物結合。所述酶的底物用於對ADMA-抗體複合物定量，從而對樣本中的ADMA定量。抗原競爭性抑制分析通常也需要與支持物結合的ADMA特異性抗體。將ADMA-酶綴合物加入樣本(含有ADMA)中以備分析。ADMA-酶綴合物和未標記的ADMA之間的競爭性抑制作用使得能夠對樣本中ADMA的含量進行定量。用於ELISA反應的固相支持物優選有孔的。本發明還可以採用不包括抗體的方法測定ADMA。優選使用高效液相色譜(HPLC)分離和螢光檢測作為確定ADMA水平的方法。可以使用如上所述的HPLC設備和方法(TsikasDetal.JChromatogrBBiomedSciAppl1998；705174-6)。HPLC過程中的分離通常以大小或電荷為基礎進行。在進行HPLC之前，通常將內源胺基酸和內標L-高精氨酸加入待測樣本中，然後使用CBA固相萃取管(CBAcartridge，Varian，HarborCity，CA)進行相萃取。樣本中的胺基酸優選用鄰苯二醛(OPA)衍生。對所有胺基酸而言，分析的準確性和精密度優選在質量對照樣本中確定。本發明可以用於在已經被懷疑有發生先兆子癇的風險或者因為有發生先兆子癇的傾向而被選出的婦女中確定易感性。本發明還可以用於在已經被懷疑有發生IUGR的風險或者因為有發生IUGR的傾向而被選出的胎兒中確定易感性。增加發生先兆子癇或IUGR的易感性的風險因素通常包括加勒比黑人家系、未經產或與配偶的第一次懷孕、多胎妊娠、高血壓、糖尿病、先兆子癇或子癇的遺傳傾向或家族史、肥胖、高膽固醇血症以及吸菸。本發明可以用於在吸菸者中確定發生先兆子癇的易感性。本發明還可以用於確定吸菸者所懷的胎兒發生IUGR的易感性。本發明的一些實施方案包括另外的診斷試驗，從而確定對先兆子癇和IUGR的易感性。優選採用肱動脈的血流介導的擴張和/或子宮動脈的都卜勒波形分析。這些診斷試驗通常在測定孕婦的ADMA水平之前、同時或之後進行。肱動脈的血流介導的擴張(FMD)是一種已經建立的、評估內皮依賴性血管舒張的非侵入性方法。它通常包括使用高分辨超聲波測量為適應血流增加而產生的肱動脈直徑變化。可以使用上述的超聲波設備和方法(SavvidouMDetal.UltrasoundObstetGynecol2000；15502-7；DorupIetal.AmJPhysiol1999；276H821-5)。所述設備通常包括線陣式換能器(lineararraytransducer)。舒張末期的動脈圖像可以以數字格式儲存。動脈直徑通常採用半自動邊緣檢測算法(semi-automatededgedetectionalgorithm)來確定。通常按記錄第一分鐘內所有測量值的均數計算基礎血管直徑。肱動脈的FMD定義如下將橡皮箍袖帶末端充氣，直至記錄的位置指示到300mmHg，並保持5分鐘，隨後迅速放氣，在由於上述充氣而誘發的反應性充血的過程中血管直徑增加的百分率。血流變化(反應性充血)即血流刺激物擴張作用的指標，通常按[(橡皮箍袖帶放氣15秒後的血流-基礎血流)/基礎血流]×100％計算。由舌下給予硝酸甘油(GTN)產生的內皮非依賴性擴張可以用作對照。在正常的孕婦中，肱動脈的FMD通常為8.59±2.76％(n＝43)。根據本發明，除了AMDA水平升高之外，FMD的顯著下降也可預示先兆子癇的易感性和發生風險。優選肱動脈的FMD下降兩倍或者更優選至少下降兩倍。都卜勒分析是用來評估子宮動脈波形的常規方法。該方法通常用於鑑別動脈波形中是否出現舒張早期切跡。這些切跡可以是單側或雙側的。根據本發明，除了AMDA水平升高之外，單側或雙側切跡的出現也可預示先兆子癇或IUGR的易感性。本發明的診斷方法可以與其它的檢測或遺傳試驗聯合進行，從而使風險預測更精準。本發明進一步提供了診斷試劑盒，所述試劑盒包括測定婦女的ADMA水平並從而確定該婦女是否有發生先兆子癇的風險或者其所懷胎兒是否易患IUGR的裝置。所述試劑盒通常包括一種或多種特異性結合ADMA的抗體。例如，所述試劑盒可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體或人源化抗體。所述抗體可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，例如Fab、F(ab』)2或Fv片段。如果出現一種以上的抗體，則所述抗體優選具有不同的未重疊決定簇以使它們能夠同時結合ADMA。所述試劑盒可以另外包括一種或多種其它的試劑或裝置，從而使上述方法的任何實施方案都能夠實施。所述試劑或裝置包括以下一種或多種合適的緩衝液(水溶液)、從樣本中分離ADMA的裝置、從婦女中獲取樣本的裝置(例如導管或包括針頭的裝置)或者能在其上進行定量反應的有孔支持物。所述試劑盒可選地包括使試劑盒能夠用於本發明的方法的說明書或者關於該方法可以在哪些婦女中實施的詳細說明。所述試劑盒可選地包括ADMA活性的拮抗劑。所述拮抗劑優選L-精氨酸。治療本發明還涉及先兆子癇和IUGR的抑制或預防。本發明人已指出ADMA的水平在隨後發生先兆子癇的婦女中升高，以及ADMA通過減弱內皮依賴性舒張從而在孕婦高血壓(maternalhypertension)的發生中發揮關鍵作用。本發明人還已指出在其所懷胎兒隨後發生IUGR的孕婦中，ADMA的水平升高。因此，先兆子癇或IUGR的發生可以通過應用ADMA活性的拮抗劑而得到預防或抑制。先兆子癇的抑制包括在已經患有先兆子癇的孕婦中減少、防止或延遲先兆子癇症狀的出現。先兆子癇的預防包括在尚未患先兆子癇但是有發生此病的風險的孕婦中減少、防止或延遲先兆子癇的發生。IUGR的抑制包括在已經患有IUGR的胎兒中減少、防止或延遲IUGR症狀的出現。IUGR的預防包括在尚未患IUGR但是有發生此病風險的胎兒中減少、防止或延遲IUGR的發生。通過給予用於抑制或預防IUGR的物質，有發生IUGR的風險或表現IUGR症狀的胎兒的狀況可因此而得到改善。優選將治療有效量的、用於抑制或預防IUGR發生的物質給予所述胎兒的母親。本發明的另一個方面是對通過本發明的方法鑑定為有發生先兆子癇風險的孕婦的治療。因此，用於抑制或預防先兆子癇的物質，可以用來製造用於治療經本發明的方法鑑定為有發生先兆子癇風險的孕婦的藥物。經本發明的方法鑑定為有發生先兆子癇風險的孕婦的狀況，可以通過給予抑制或預防先兆子癇的物質而因此得到改善。可以將治療有效量的、抑制或預防先兆子癇發生的物質給予經本發明的方法鑑定為有治療必要的孕婦。本發明的另一個方面是對經本發明的方法鑑定為有發生IUGR風險的胎兒的治療。因此，用於抑制或預防IUGR的物質，可以用來製造用於治療經本發明的方法鑑定為有發生IUGR風險的胎兒的藥物。經本發明的方法鑑定為有發生IUGR風險的胎兒的狀況，可以通過給予用於抑制或預防IUGR的物質而因此得到改善。優選將治療有效量的、用於抑制或預防IUGR發生的物質給予經本發明的方法鑑定為有治療必要的胎兒的母親。被鑑定為有發生先兆子癇的風險並因此接受治療的婦女可以處於妊娠前三個月、妊娠中三個月或者妊娠末三個月。被鑑定為有發生IUGR的風險並因此接受治療的胎兒可以處於妊娠前三個月、妊娠中三個月或者妊娠末三個月。通常所述婦女或胎兒處於妊娠4-25周的孕期階段。所述婦女或胎兒可以處於妊娠23-25周的孕期階段。優選所述婦女或胎兒處於妊娠10-25周的孕期階段，更優選妊娠的15-25周。完全發病的先兆子癇通常通過胎兒的分娩來治療。優選使用ADMA活性的拮抗劑來防止先兆子癇的發生。也優選使用ADMA活性的拮抗劑來防止IUGR的發生。ADMA活性的拮抗劑通常降低ADMA的濃度或水平和/或抑制ADMA的作用。ADMA活性的拮抗劑優選L-精氨酸，L-精氨酸是一氧化氮合酶的天然底物並與ADMA相競爭。ADMA活性的拮抗劑還可以是PRMT的抑制劑或DDAH的刺激劑。對先兆子癇的抑制或預防通常還包括抗高血壓治療。對IUGR的抑制或預防也可以包括抗高血壓治療。高血壓治療可以是藥物治療或非藥物治療。優選的非藥物預防方法包括住院治療，停止吸菸和/或連續監測血壓、蛋白水平、血小板計數、腎功能和其它心血管功能的標準指標。優選的藥物預防和/或處理方法包括對婦女給予硫酸鎂、肼苯噠嗪(hydalazine)、拉貝洛爾或阿司匹林。在本發明中，用於抑制或預防先兆子癇或IUGR的物質可以以各種劑型給藥。因而，所述物質可以通過口服給藥，例如以片劑(tablets)、含片(troches)、錠劑(lozenges)、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或者顆粒的形式。所述物質還可以通過非胃腸道給藥，皮下、靜脈內、肌內、胸骨內(intrasternally)、經皮給藥或者通過輸注方法給藥都可以。所述物質還可以以栓劑形式給藥。醫生可以針對每個具體的患者決定所需的給藥途徑。根據本發明，用於抑制或預防先兆子癇或IUGR的物質的組成取決於諸如具體拮抗劑的性質等因素。可以配製合適的物質以使能夠同時、單獨或相繼使用。根據本發明，用於抑制或預防先兆子癇或IUGR的物質通常用可藥用的載體或稀釋劑配製，從而能夠用於本發明的給藥。所述藥用載體或稀釋劑可以是，例如等滲溶液。例如，固體口服形式除活性物質外可以包括稀釋劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；潤滑劑，例如矽石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二醇；結合劑，例如澱粉類、阿拉伯樹膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解劑，例如澱粉、褐藻酸、藻酸鹽或羥基乙酸澱粉鈉；發泡合劑；著色劑；甜味劑；溼潤劑，例如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸酯；以及一般地，用於藥物配方中的無毒性且藥理學上無活性的物質。這類藥物製品可以以已知方法生產，例如通過混合、製成顆粒、壓片、包糖衣或者包膜的方法。用於口服給藥的液體分散系可以是糖漿、乳液或者懸浮液。所述糖漿可以包括載體，例如蔗糖或者含有甘油和/或甘露醇和/或山梨醇的蔗糖。懸浮液和乳液可以包括載體，例如天然樹膠、瓊脂、藻酸鈉、果膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或者聚乙烯醇。用於肌內注射的懸浮液或溶液除活性物質外可以包括可藥用載體，例如無菌水、橄欖油、油酸乙酯、諸如丙二醇的二元醇類，以及根據需要選擇的適當量的鹽酸利多卡因。用於靜脈內給藥或輸注的溶液可以包括載體，例如無菌水，或者所述溶液可以優選無菌、水性、等滲鹽溶液形式。將治療有效量的用於抑制或預防先兆子癇或IUGR的物質給予根據本發明的方法鑑定的患者。如ADMA拮抗劑等藥物的劑量可以根據各種參數，尤其要根據所使用的物質，被治療的患者的年齡、體重和健康狀況，給藥途徑以及所需的用藥方法來確定。此外，醫生可以針對任何具體的患者，決定所需的給藥途徑和劑量。根據具體拮抗劑的活性，治療對象的年齡、體重和健康狀況以及給藥的頻率和途徑，日劑量通常為每kg體重約0.1至50mg。優選地，日劑量水平為5mg至2g。所述劑量可以以單劑量或多劑量形式提供，例如以相同的時間間隔用藥，如每日給藥2、3或4劑。動物模型本發明還提供已經發生先兆子癇的動物模型以及產生該動物的方法。本發明人已指出ADMA在先兆子癇的發生中發揮關鍵作用。因此，ADMA可被用於產生表現出的症狀與被診斷為先兆子癇的孕婦所表現的症狀類似的動物。本發明的動物適合用作研究先兆子癇的模型。本發明還提供其所懷胎兒已經發生IUGR的懷孕動物以及產生該動物的方法。本發明人已指出ADMA在IUGR的發生中發揮關鍵作用。因此，ADMA可被用於產生其所懷胎兒表現出的症狀與被診斷為IUGR的人類胎兒所表現的症狀類似的動物。本發明的動物適合用作研究IUGR的模型。本發明還提供已經發生IUGR的動物胎兒以及產生該動物的方法。本發明人已指出ADMA在IUGR的發生中發揮關鍵作用。因此，ADMA可被用於產生表現出的症狀與被診斷為IUGR的人類胎兒所表現的症狀類似的胎兒。本發明的動物適合用作研究IUGR的模型。給予足夠劑量的ADMA從而在所述動物中引起或產生先兆子癇的症狀，或者在所述胎兒中引起或產生IUGR的症狀。所述足夠劑量通常在動物之間有所變化並且取決於多種因素，例如血漿容量和ADMA的正常孕期水平。ADMA可以通過本領域熟知的方法給予動物。ADMA可以通過口服給藥，例如以片劑、含片、錠劑、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或者顆粒的形式。ADMA還可以通過非胃腸道給藥，皮下、靜脈內、肌內、胸骨內、經皮給藥或者通過輸注方法給藥都可以。所述動物是非人類。所述的非人類動物通常是普遍用於生物醫學研究的種類，例如哺乳動物，並且優選為實驗室品系。合適的動物包括非人類的靈長類動物、狗、貓、羊和嚙齒類動物。所述動物優選為嚙齒類動物，特別是小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂、沙鼠或倉鼠。所述動物最優選為小鼠。所述動物還可以缺少功能性的二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)，該酶代謝ADMA。DDAH缺陷的動物先前已經在WO00/44888(PCT/GB00/00226)中有所敘述。DDAH缺陷的動物不能表達DDAHI和/或DDAHII的活性形式。不能表達一種或多種DDAH同種型(isoform)的動物顯示出基本上檢測不到至少一種DDAHmRNA的表達。不能表達一種或多種DDAH同種型活性形式的動物至少表達一種與DDAH相關的多肽，該多肽基本上不表現DDAH活性。合適的動物可以是來自編碼DDAH的基因座的多核苷酸序列已經缺失或者被來自另一基因座或另一有機體的多核苷酸序列置換的動物。因而，基本上沒有DDAHmRNA能夠從該DDAH的基因座表達。或者，DDAH基因的編碼序列已經改變，因而所表達的多肽基本上不表現DDAH活性。通常，合適的非人類動物是所謂的「基因敲除動物」。名詞「基因敲除動物」為本領域技術人員所熟知。通常，本發明的非人類動物如基因敲除動物，是轉基因動物。基因敲除動物可以根據任何適當的方法產生。一般而言，構建包括標記基因(例如側翼與基因組序列相接)的多核苷酸構建體。所述基因組序列對應於所討論的動物中編碼DDAH的基因座上的基因組序列。因此，如果所述多核苷酸構建體與感興趣的動物中編碼DDAH的基因座接觸，同源重組事件會導致和用在多核苷酸構建體中的基因組序列相接的染色體序列與標記基因發生置換。如果標記基因置換了編碼序列或例如啟動子序列的調控序列，基因表達和/或活性就會被完全破壞。所述多核苷酸構建體通常通過原核顯微注射轉移到受精卵中，從而使上述的接觸得以發生。也可以使用其它的方法，例如由胚胎幹細胞或逆轉錄病毒介導的基因轉移進入種系(germlines)。不論採用哪種方法，結果都會產生轉基因動物。例如，經顯微注射的卵可以被植入雌性宿主並且從後代中篩選標記基因的表達。得到的創始動物(founderanimal)可以進行繁殖。因而優選的動物是全部或部分DDAHI或DDAHII基因座發生缺失或置換的小鼠，即DDAHI或DDAHII基因敲除的小鼠。所述動物還可以過表達參與ADMA的內源性合成及活性的酶，例如PRMT。上述的轉基因技術當然同樣適用於生產過表達蛋白的非人類動物。在這種情況下，使用的多核苷酸構建體不用標記基因置換內源性基因部分。相反，內源性基因可以用包括啟動子的多核苷酸構建體來置換，所述啟動子為例如與編碼序列有效連接的能驅動高水平表達的啟動子。或者，所述構建體可以包括與報告基因有效連接的適當的啟動子序列。還可以構建不置換內源性序列的構建體。使用這類構建體會導致動物含有內源性序列和插入了構建體的該序列。上述的非人類轉基因動物還可以獨立地用於鑑別下述的預防或治療先兆子癇或IUGR的物質。所述動物為懷孕動物。名詞「懷孕」在此定義為一種狀態，其中動物具有如同真正懷孕一樣的生理學行為以及對藥物治療作出的反應。因此，本發明可以使用具有類似於懷孕的狀態例如假孕的動物。治療物質的篩選本發明進一步提供使用動物的整體或一部分來鑑別預防或治療先兆子癇或IUGR的物質的方法。這種方法通常使用本發明的非人類懷孕動物或本發明的非人類胎兒。但是在一個實施方案中，使用如上所述的DDAH缺陷的懷孕動物，所述動物事先不給予ADMA。由於缺少DDAH即代謝ADMA的酶，導致內源性ADMA水平升高。所述DDAH缺陷動物優選基因敲除小鼠。預防先兆子癇的物質能夠降低、防止或延遲先兆子癇任何症狀的出現。治療先兆子癇的物質能夠緩解或消除已經被診斷患有該疾病的患者的先兆子癇症狀。預防IUGR的物質能夠降低、防止或延遲IUGR任何症狀的出現。治療IUGR的物質能夠緩解或消除已經被診斷患有該疾病的胎兒的IUGR症狀。鑑別物質的方法通常在動物的孕期中已經出現先兆子癇的症狀之前或之後實施。鑑別預防先兆子癇的物質的方法通常在動物已經出現先兆子癇的症狀之前實施。鑑別治療先兆子癇的物質的方法通常在動物已經出現先兆子癇的症狀之後實施。鑑別物質的方法通常在胎兒已經出現IUGR的症狀之前或之後實施。鑑別預防IUGR的物質的方法通常在胎兒已經出現IUGR的症狀之前實施。鑑別治療IUGR的物質的方法通常在動物已經出現IUGR的症狀之後實施。合適的能夠在上述方法中檢測的物質包括組合文庫(combinatoriallibrary)、確定的化學物質(definedchemicalentities)、肽和類肽、寡聚核苷酸以及天然產物庫，例如展示(例如噬菌體展示文庫)和抗體產物。例如可以使用單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體以及人源化抗體。所述抗體可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，例如Fab、F(ab』)2或Fv片段。通常會篩選有機分子，優選分子量為50至2500道爾頓的有機小分子。候選產物可以是生物分子，包括糖類、脂肪酸類、類固醇、嘌呤類、嘧啶類、衍生物、結構類似物或它們的組合。候選試劑從各種廣泛的來源獲得，包括合成或天然物質庫。可以使已知的藥物試劑受到定向或隨機化學修飾，例如醯化、烷化、酯化、醯胺化(amidification)等作用，從而產生結構類似物。優選的檢測物質包括影響ADMA、NOS、NO、DDAH或PRMT的水平或活性的物質。本發明還提供通過本發明的篩選方法鑑別的物質在預防或治療先兆子癇或IUGR中的應用。因此，被鑑別的物質可以用於製造用來預防或治療先兆子癇或IUGR的藥物。用以下實施例說明本發明實施例1.方法研究參與者所有參加King’sCollegeHospital常規產前護理的婦女都在妊娠23-25周時進行了子宮動脈彩色都卜勒檢查(AcusonAspen，California，USA)。按上述方法(AlbaigesGetal.ObstetGynecol2000；96559-64)獲得子宮動脈的都卜勒波形。當得到三個相似的連續波形時，注意到出現舒張早期切跡，並計算兩血管的平均搏動指數(PI)。在都卜勒研究時募集了43名具有被連續鑑別出的異常子宮動脈都卜勒波形(出現雙例舒張早期切跡)的孕婦，並與43名具有正常子宮動脈都卜勒波形的孕婦在年齡、種族和吸菸狀況方面相匹配。在登記時，所有婦女都是單胎妊娠，健康，未在進行藥物治療，沒有早發性心血管疾病(prematurecardiovasculardisease)的個人史或家族史，並且妊娠胎兒發育良好。登記孕婦的年齡、種族、吸菸狀況、產次、心率以及BP。讓受試者坐下，使用動態血壓監視器(SpaceLabsMedical90207，WA，USA)在其右臂測量血壓(BP)。進行三次測量並取平均數。本研究經地方倫理委員會(LocalEthicsCommittee)批准並且所有受試者都遞交了書面的知情同意書。母體內皮功能的評估在妊娠23-25周時，按上述使用7MHz線陣式換能器和AspenAcuson系統(California，USA)，進行右側肱動脈的超聲檢查(CelermajerDSetal.Lancet1992；3401111-5；SavvidouMDetal.ObstetGynecol2000；15502-7)。每3秒鐘收集一次舒張末期的動脈圖像並以數字格式儲存。採用半自動邊緣檢測算法測定每張圖像的動脈直徑。按記錄第一分鐘內所有檢測值的均數來計算基礎血管直徑。肱動脈的FMD定義如下將橡皮箍袖帶末端充氣，直至記錄的位置指示到300mmHg，並保持5分鐘，隨後迅速放氣，在由於上述充氣而誘發的反應性充血的過程中血管直徑增加的百分率。血流變化(反應性充血)即血流刺激物擴張作用的指標，通常按[(橡皮箍袖帶放氣15秒後的血流-基礎血流)/基礎血流]×100％計算。所有測量都由有經驗的操作者完成並且在研究的24小時內對FMD數據進行分析。在本實驗室中，FMD的觀察者間變異性為1.02±0.6％(95％一致區間(LimitsofAgreement)-1.7-2.4％)(SavvidouMDetal.ObstetGynecol2000；15502-7)。在懷孕人群以外，對舌下硝酸甘油(GTN)產生的內皮非依賴性擴張通常被用作對照，但本研究中避免使用GTN。然而，先前的研究顯示GTN誘導的擴張並不因懷孕而改變(DorupIetal.AmJPhysiol1999；276H821-5)。血漿非對稱二甲基精氨酸、對稱二甲基精氨酸和L-精氨酸的分析在為測定血漿ADMA、SDMA和L-精氨酸濃度而進行的血管研究時，將血液樣本(5ml)置於含有檸檬酸鹽的試管中。38名對照組婦女和40名具有雙側子宮動脈切跡的婦女同意取血。離心後，血漿在-70℃保存至檢測。加入血漿樣本(10μmol/L)0.5ml等分試樣中的內源性胺基酸和內標L-高精氨酸在CBA固相萃取管(Varian，HarborCity，CA)上進行了固相萃取，並用鄰苯二醛(OPA)衍生，OPA衍生物按上述方法(TsikasDetal.JChromatogrBBiomedSciAppl1998；705174-6)通過HPLC分離並通過螢光檢測進行監測。L-精氨酸、L-高精氨酸、SDMA和ADMA的OPA衍生物分別在8.8±0.1、10.9±0.1、14.8±0.2和16.3±0.2分鐘(均數±標準差，n＝6)時洗脫下來。對所有胺基酸而言，準確性和精密度在一批六個一起處理的質量對照樣本中確定，從而使其分別為接近100％和低於7.3％。臨床結局的定義獲取所有被研究婦女懷孕期間的信息，包括妊娠年齡、分娩方式和嬰兒出生體重。參加本研究的婦女的臨床處理由知道23-25周時的子宮動脈波形記錄結果，但是不知道肱動脈FMD和甲基精氨酸測定結果的產科醫生來承擔。根據國際妊娠高血壓研究學會(InternationalSocietyfortheStudyofHypertensioninPregnancy)的標準(Daveyetal.AmJObstetGynecol1988；158892-8.)界定先兆子癇。在這種分類法中，先兆子癇被定義為先前血壓正常的婦女在妊娠20周後發生的合併有蛋白尿(24小時尿液收集中的總蛋白≥300mg，或者如果這點做不到時，通過浸染棒在至少間隔4小時的兩個連續的時期測得2+蛋白尿)的高血壓(一次舒張期的血壓讀數≥110mmHg，或者至少間隔4小時的兩次連續舒張期的血壓讀數≥90mmHg)。IUGR被定義為出生體重低於針對新生兒的妊娠期和性別的第5百分位數(GardosiJetal.Lancet1992；339283-7)。統計學分析用Shapiro-Wilk檢驗考察連續數據分布的正態性。對非正態分布的數據進行對數轉換。對正態和非正態分布的數據來說，描述數據表示為均數±標準差或者中位數(四分位距)。採用學生t檢驗來比較帶有和不帶有雙側切跡的婦女之間的變量。在多組間進行比較以單因素方差分析並隨後以事後檢驗(posthoctest，Tukey-Kramer)進行。採用卡方(χ2)檢驗來比較各組間的分類變量。在適合的地方進行單變量線性(univariatelinear)和多變量回歸(multivariateregression)分析。採用社會科學統計學軟體包(StatisticalPackageforSocialSciences，第8版)進行統計分析。2.結果研究參與者的基礎特徵具有正常子宮動脈都卜勒波形的婦女均未發生先兆子癇並且所有這些婦女都分娩出適當大小的嬰兒。根據懷孕結局，把在妊娠23-25周時具有子宮動脈雙側切跡的婦女(n＝43)分成三組沒有併發症的婦女(n＝19，44.2％)、發生IUGR的婦女(n＝14，32.6％)以及發生PE的婦女(n＝10，23.2％，包括四例具有IUGR的)。從研究記錄得到的人口統計學和臨床特徵，根據懷孕結局在表1中給出。各組之間在基礎人口統計學特徵上沒有統計學上的顯著性差異。在隨後發生先兆子癇的婦女中，有較大比例是吸菸者，但是其差異在統計學上不顯著(p＝0.43)。在最終發生先兆子癇的婦女中，收縮期和舒張期的血壓顯著升高，但是仍然處於正常範圍內。發生先兆子癇的婦女具有顯著升高的子宮動脈搏動指數(PI)，並且與沒有任何孕期併發症的婦女相比，較早分娩出較小的嬰兒。根據懷孕結局的母體FMD從所有婦女中獲取FMD記錄並根據懷孕結局在表2中給出。隨後發生先兆子癇的婦女與沒有切跡並具有正常結局的婦女(8.59±2.76％，p＜0.0001)，以及具有雙側切跡但是具有正常結局的婦女(8.15±4.32％，p＝0.0001)相比，具有顯著降低的FMD(3.58±2.76％，圖1)。懷孕中伴有IUGR併發症的婦女與沒有切跡並具有正常結局的婦女相比，也具有較低的FMD(6.17±2.82％對8.59±2.76％，P＝0.004)。不論是否出現雙側切跡，具有正常結局的孕婦具有相似的FMD(8.59±2.76％對8.15±4.32％，p＝0.92)。在多元回歸分析中，FMD的顯著性預測因子(predictors)是基礎血管的大小(p＝0.002)、由懷孕結局定義的亞組狀況(p＜0.001)和吸菸狀況(p＜0.001)。甚至在對吸菸狀況進行矯正後，FMD的組間差異仍然顯著。二甲基精氨酸和L-精氨酸的水平具有雙側切跡的婦女與具有正常子宮動脈都卜勒波形的婦女相比，具有顯著升高的ADMA水平(分別為2.4[1.97-3.14]μmol/L對0.81μmol/L，p＜0.0001，圖2)。隨後發生先兆子癇的婦女與正常懷孕的婦女相比，具有顯著升高的ADMA水平(分別為2.7[2.21-3.21]μmol/L對0.81μmol/L，p＜0.0001，表3)。在隨後發生先兆子癇的婦女中所觀察到的水平上，ADMA競爭性抑制L-精氨酸酶促合成NO並減弱內皮依賴性舒張。ADMA提供了發生先兆子癇的機制並且將增加的胎盤血管阻力與由系統性母體內皮功能障礙所導致的母體高血壓相關聯。對稱二甲基精氨酸(SDMA；對NO合成沒有影響的、ADMA的立體異構體)的水平在所有組中相似，因此ADMA/SDMA的摩爾比在具有雙側切跡和先兆子癇的婦女中顯著升高(表3)。L-精氨酸濃度和L-精氨酸/ADMA的摩爾比在所有具有雙側切跡和先兆子癇的婦女中略微但是顯著地升高(當與不具備所述特徵的婦女相比時)。有趣的是，儘管接著發生了PE的婦女具有最低水平的FMD，但是她們具有最高而不是最低水平的L-精氨酸(表3)。ADMA和內皮功能的相關性在具有正常都卜勒波形的婦女組中，ADMA的水平與FMD沒有顯著相關。但是，在具有雙側子宮動脈切跡的婦女組中，ADMA的血漿水平和FMD之間存在微弱卻顯著的負相關(r＝-0.35，p＝0.02)。為了進一步研究這種關係，我們在通過不同懷孕結局區分的具有雙側切跡的三個亞組中，在ADMA水平和FMD之間進行了單變量分析(univariateanalyses)。只有在最終發生了先兆子癇的孕婦組中，ADMA和FMD之間具有強烈的負相關(r＝-0.8，p＝0.005，圖3)。表1根據懷孕結局，每組婦女中人口統計學的、臨床母親的和新生兒的特徵。*p＜0.0001，p＜0.001所有比較都是與檢測中沒有雙側切跡的婦女組進行的表2根據懷孕結局，每組婦女中的母體血管特徵。*p＝0.004，與沒有切跡且結局正常的婦女比較。P＜0.0001，與沒有切跡且結局正常的婦女比較。P＜0.0001，與具有切跡且結局正常的婦女比較。表3根據懷孕結局，每組婦女中的ADMA、SDMA和L-精氨酸水平。*p＜0.0001，p＜0.005所有比較都是與檢測中沒有雙側切跡的婦女組進行的。權利要求1.一種鑑別孕婦是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生宮內發育遲緩(IUGR)的風險的方法，所述方法包括檢測孕婦的非對稱二甲基精氨酸(ADMA)並由此確定婦女是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險。2.根據權利要求1的方法，其中所述ADMA在取自婦女的流體樣本中檢測。3.根據權利要求2的方法，其中所述確定婦女是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險包括確定流體樣本中的ADMA是否高於1.5μmol/L。4.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述孕婦處於妊娠10至25周的孕期階段。5.根據權利要求4的方法，其中所述婦女處於妊娠15至25周的孕期階段。6.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述確定婦女是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險包括確定該婦女的ADMA水平是否至少為正常孕期水平的3倍。7.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述確定婦女是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險包括確定該婦女是否具有高於正常孕期比值的ADMA/對稱二甲基精氨酸(ADMA/SDMA)。8.根據權利要求7的方法，其中包括確定ADMA/SDMA的比值是否至少高於正常孕期比值5倍。9.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述孕婦是被懷疑有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒被懷疑有發生IUGR的風險。10.根據權利要求9的方法，其中所述婦女是吸菸者。11.根據前述任一項權利要求的方法，其中進一步包括對所述婦女進行子宮動脈的都卜勒波形分析和/或肱動脈的血流介導的擴張。12.ADMA抗體在製造用於確定婦女是否有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒是否有發生IUGR的風險的裝置中的用途。13.根據權利要求12的用途，其中所述裝置包括緩衝溶液。14.一種抑制或預防孕婦發生先兆子癇或者抑制或防止其所懷胎兒發生IUGR的方法，所述方法包括給予孕婦有效量的ADMA活性拮抗劑。15.根據權利要求14的方法，其中所述孕婦通過根據權利要求1-11任一項的方法被鑑定為有發生先兆子癇的風險或其所懷胎兒被鑑定為有發生IUGR的風險。16.ADMA活性的拮抗劑在製造用於抑制或預防先兆子癇或者抑制或預防IUGR的藥物中的用途。17.根據權利要求14或15的方法或者根據權利要求16的用途，其中所述ADMA活性拮抗劑是L-精氨酸。18.一種非人類的懷孕雌性動物，其中通過給予ADMA在所述動物中引起了先兆子癇。19.一種非人類的懷孕雌性動物，其中通過給予ADMA在所述動物所懷胎兒中引起了IUGR。20.一種非人類的胎兒，其中通過對懷有所述胎兒的非人類雌性動物給予ADMA，在所述胎兒中引起了IUGR。21.一種在非人類懷孕雌性動物中引起先兆子癇或者在其所懷胎兒中引起IUGR的方法，所述方法包括給予該動物足以導致先兆子癇或IUGR劑量的ADMA。22.根據權利要求18或19的非人類懷孕雌性動物，根據權利要求20的非人類胎兒或者根據權利要求21的方法，其中所述非人類懷孕雌性動物是二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)缺陷的動物。23.一種鑑別預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR的物質的方法，所述方法包括對權利要求18、19或22中所定義的動物給予候選物質並評估該候選物質是否能夠預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR。24.一種鑑別預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR的物質的方法，所述方法包括對DDAH缺陷的懷孕動物給予候選物質並評估該候選物質是否能夠預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR。25.根據權利要求24的方法，其中所述DDAH缺陷的動物是基因敲除小鼠。26.通過根據權利要求23-25任一項的方法所鑑別的物質在製造預防或治療先兆子癇或者預防或治療IUGR的藥物中的用途。全文摘要已經證實非對稱二甲基精氨酸(ADMA)的水平在隨後發生先兆子癇或其所懷胎兒隨後發生宮內發育遲緩(IUGR)的婦女中升高，並且ADMA在孕婦高血壓的發生中發揮關鍵的作用。因此，孕婦中的ADMA水平可以用於確定孕婦是否有發生先兆子癇的風險或者胎兒是否有發生IUGR的風險。而且，ADMA活性的拮抗劑在抑制或預防先兆子癇或者抑制或預防IUGR中是有效的。文檔編號G01N33/68GK1802566SQ200480016090公開日2006年7月12日申請日期2004年4月19日優先權日2003年4月17日發明者M·塞維多,A·興戈蘭尼,P·瓦蘭斯,K·尼科萊德斯申請人:倫敦大學學院