一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法及其應用的製作方法

2023-04-25 13:48:41

一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明利用三維膠原支架在低血清濃度下完成膠質瘤幹細胞的富集培養，為膠質瘤體外試驗研究提供了一種新型的，更接近體內真實環境的幹細胞培養方法及應用。所述三維培養方法中選用膠原作為製作3D支架的材料，膠原是細胞外基質最主要的成分，可為細胞提供良好的粘附與遷移環境，並具有良好的生物相容性、機械強度、降解係數和低免疫原性。本發明研究多孔膠原支架三維培養對膠質瘤細胞乾性的影響，探討其機制，摸索更接近於體內腫瘤幹細胞環境的靶向GSCs藥物試驗方法，並進行了藥敏試驗，繼而對膠質瘤耐藥機制進行進一步的研究，為丌發GSCs靶向藥物提供了新的思路奠定基礎，其成果具有一定的理論意義和應用價值。
【專利說明】一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞生物領域，特別涉及一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法及其應用。
【背景技術】
[0002]惡性膠質瘤作為神經系統中發病率最高的惡性腫瘤，在過去的10年裡，即使經歷了手術、放射和化學治療的較大進展，其中位生存期也僅由10個月提高至14個月，並且在針對膠質瘤的多個大型、多中心的新藥試驗中，都未能取得令人滿意的結果，絕大多數的藥物在二期臨床試驗中折戟沉沙，未能體現出與體外試驗時相一致的結論。這種體外試驗與臨床結果不相符的情況在抗膠質瘤治療研究中普遍存在，預示著目前對於惡性膠質瘤的發病機制、發展特性及抗藥機制的認識還有很多的空白，抗惡性膠質瘤腫瘤藥物體外試驗方法存在著進一步改 進的空間。
[0003]近年來腫瘤幹細胞的發現及研究進展，也為膠質瘤復發、轉移及治療抵抗等關鍵機制以及在此基礎上研發診療新技術打開了新的視野，且越來越成為膠質瘤研究領域的熱點。膠質瘤幹細胞(glioma stem cells,GSCs)因其自我更新、多向分化和對治療抵抗的能力，是維持腫瘤惡性生長和復發轉移的「種子細胞」，因此以GSCs為主要靶向的抗膠質瘤治療研究也成為抗膠質瘤治療的新興重點方向之
[0004]那麼進行靶向GSCs治療的研究首先就要求我們有一個針對GSCs進行體外培養的技術以及在此技術之上進行不同於傳統的藥物學試驗方法。在我科以往的抗腫瘤新藥研發中，我們主要按照傳統的腫瘤藥物體外試驗方法，即以檢測單層培養細胞對藥物的反應來進行。該方法由美國國家癌症研究所(NCI)於上世紀八十年代創建，但在臨床應用中，常發現體外試驗敏感的藥物效果與患者體內實體瘤臨床評估的藥效偏差較大。既有研究表明，這至少部分是由於單層培養的體外細胞生長喪失了三維空間結構，無法相對真實地反映體內腫瘤細胞的病理生理結構、生長狀態以及相對耐藥耐輻射的腫瘤幹細胞水平。
[0005]進入GSCs研究時代以後，目前最常用的GSCs體外培養方法是由1992年ReynoldsBA等人在從鼠紋狀體進行神經幹細胞的分離培養中發明的無血清懸浮培養法。該培養方法的特點為:無血清、添加高濃度生長因子的培養液，以及低黏附性培養環境。其優勢為:可以比較簡單、直觀地從細胞層面上體現單個細胞的自我更新及分化能力；但缺陷也很明顯:除了成球培養重複性較差，細胞球內難以觀測等，更重要的是其與體內環境大相逕庭。它無法遷移運動，由單細胞分裂成球而來，無法體現細胞與基質的作用，長期傳代成功率極低，而體內腫瘤幹細胞絕非懸浮狀態，不可運動，其粘附於由其他細胞和基質支持組成的特殊微環境，即特定的「幹細胞龕」內，也可以接觸到血清成分。
[0006]目前應用在製備3D細胞培養的主要材質包括:1.天然有機物:膠原、殼聚糖、葡萄糖氨基聚糖類、藻酸鹽、絲心蛋白、瓊脂糖、澱粉；2.無機大分子聚合物:PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己內酯)、POE (聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。
[0007]因此，目前繼續一種新型的膠質瘤幹細胞培養方法，以真實地反映體內腫瘤細胞的病理生理結構、生長狀態以及相對耐藥耐輻射的腫瘤幹細胞水平。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，所述三維培養方法可為細胞提供良好的粘附與遷移環境，並具有良好的生物相容性、機械強度、降解係數和低免疫原性。利用三維細胞培養這種方法將有效的避免不必要的臨床Ι、π期試驗，從而減少病人資源和後續研究資金的浪費。
[0009]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0010]一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，利用三維膠原支架，並摸索出適宜的低血清培養濃度，所述培養方法包括以下步驟:
[0011]1)將三維膠原支架切割成的立方體，使用前Co60照射消毒過夜，4°C乾燥環境儲存備用，待接種細胞前，以細胞培養液浸泡預處理12小時；
[0012]2)將膠質瘤細胞株消化離心至單細胞懸液，再用PBS洗淨2遍，以去除血清成份，並進行細胞計數，以每個三維膠原支架I X IO4~5 X IO4個細胞的密度將膠質瘤細胞接種於步驟I)處理後的三維膠原支架上，靜置4小時，待細胞有效粘附於支架上後，置於細胞培養板中培養，每2日更換I次培養液，即得到3D膠質瘤細胞模型。
[0013]進一步的，步驟I)中所述的細胞培養液為添加I %胎牛血清的DMEM。
[0014]進一步的，所述三維膠原支架的平均孔徑為50 μ m。
[0015]進一步的，所述三維膠原支架的材料為I型膠原。
[0016]進一步的，膠質瘤細胞株為U87細胞細胞。
[0017]本發明相比現有技術的有益效果是:
[0018]1、本發明中製備3D細胞培養的主要材質選用膠原，膠原是細胞外基質最主要的成分，可為細胞提供良好的粘附與遷移環境，並具有良好的生物相容性、機械強度、降解係數和低免疫原性；
[0019]2、利用本發明所述三維細胞培養，在少見惡性腫瘤的臨床前藥敏試驗和藥物篩選中，將有效的避免不必要的臨床1、II期試驗，從而減少病人資源和後續研究資金的浪費；
[0020]3、採用本發明所述方法培養得到的膠質瘤細胞，在三維支架微環境中可自發聚集成團塊狀，其細胞生長形態與二維培養細胞迥異，細胞膜表面結構較二維培養細胞含更豐富凸起樣或纖毛樣結構，與人體內生長膠質瘤細胞形態更接近，利於後續研究膠質瘤幹細胞治療藥物；
[0021]4、本發明率先研究以三維膠原支架為膠質瘤幹細胞培養的新技術，更好的模擬體內膠質瘤幹細胞微環境，為進一步研發靶向膠質瘤幹細胞治療藥物提供新的體外實驗平臺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為雷射共聚焦顯微鏡顯示細胞分布情況；
[0023]圖2為掃描電鏡顯示細胞生長形態；
[0024]圖3為流式細胞術檢測培養體系內腫瘤細胞生存情況。【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026]一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，利用三維膠原支架，並摸索出適宜的低血清培養濃度，所述培養方法包括以下步驟:
[0027]I)將三維膠原支架切割成的立方體，使用前Co60照射消毒過夜，4°C乾燥環境儲存備用，待接種細胞前，以細胞培養液浸泡預處理12小時；
[0028]2)將膠質瘤細胞株消化離心至單細胞懸液，再用PBS洗淨2遍，以去除血清成份，並進行細胞計數，以每個三維膠原支架I X IO4~5 X IO4個細胞的密度將膠質瘤細胞接種於步驟I)處理後的三維膠原支架上，靜置4小時，待細胞有效粘附於支架上後，置於細胞培養板中培養，每2日更換I次培養液，即得到3D膠質瘤細胞模型。
[0029]進一步的，步驟I)中所述的細胞培養液為添加I %胎牛血清的DMEM。
[0030]進一步的，所述三維膠原支架的孔徑為50 μ m。
[0031]進一步的，所述三維膠原支架的材料為I型膠原。
[0032]進一步的，膠質瘤細胞株為U87細胞。
[0033]實施例2
[0034]本實施例是在實施例1的基礎上的優選化方案，提供了一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法。本實施例中與實施例1相同的部分，請參照實施例1中公丌的內容進行理解，實施例1公丌的內容也應當作為本實施例的內容，此處不作重複描述。
[0035]所述三維培養方法包括以下步驟:
[0036]常規二維培養的U87細胞消化離心後，製備成單細胞懸液，再接種於孔徑約50 μ m的膠原支架上，在1%胎牛血清(FBS)+DMEM培養液條件下進行培養。觀測細胞是否能與較好粘連於支架膠原基質上並生長，螢光顯微鏡觀測轉入綠色螢光蛋白(GFP)的U87細胞增殖情況，掃描電鏡(SEM)及HE切片觀測細胞生長形態，流式細胞術檢測培養體系內腫瘤細胞生存情況(AnnexinV+PI法)，雷射共聚焦顯微鏡三維重建法觀測細胞在支架內分布情況。參見圖1、圖2。其中圖1，A.轉染GFP的U87細胞可在支架上增殖性生長；B，C，D.雷射共聚焦顯微鏡顯示細胞在支架上的分布情況，其中在64-125 μ m的範圍內細胞分布較多；E.顯示不同的增殖速度，3D培養的U87細胞增殖速度慢於2D單層培養的，其生長趨勢較平緩；F.顯示3D培養中的細胞凋亡比例高於2D培養的，這也反映了與2D培養不同的增殖特性。
[0037]本實施例中所述支架山中科院發育生物所製備提供，材質為I型膠原。所述支架請參見文獻，CHEN L, XIAO Z, MENGL, et al.The enhancement of cancer stem cellproperties of MCF_7cells in3D collagen scaffolds for modeling of cancer andant1-cancer drugs[J].Biomaterials,2012,33(5):1437_44。
[0038]觀測三維膠原支架培養對膠質瘤細胞乾性影響:將不同方式(二維vs三維)及不同血清條件(10% vs3%vsl%vs0)培養的細胞消化成單細胞懸液後，用流式細胞術檢測膠質瘤乾性細胞(U87CD133+U87細胞)的比例。摸索出三維膠原支架富集培養膠質瘤幹細胞的適宜條件，包括不同血清濃度培養液，不同時間段收集細胞以及與懸浮成球細胞比較等，在此基礎之上尋找三維膠原支架培養膠質瘤幹細胞的方法。所述適宜條件為:將支架內細胞浸沒於I %胎牛血清+DMEM培養液，在37°C、5% CO2、飽和溼度培養箱中培養，一般收集細胞時間以5天左右。
[0039]膠質瘤U87細胞在三維膠原支架中可進行性增殖生長，但增殖速度較二維培養顯著性減慢，其差異有顯著性，參見圖1。進一步採用HE切片和SEM觀測膠質瘤細胞在三維膠原支架內生長情況可發現，膠質瘤細胞在三維支架微環境中可自發聚集成團塊狀，其細胞生長形態與二維培養細胞迥異，細胞膜表面結構較二維培養細胞含更豐富凸起樣或纖毛樣結構，與人體內生長膠質瘤細胞形態更接近，參見圖2。在不同濃度下進行三維培養對膠質瘤U87細胞乾性影響的觀測，在1% FBS濃度條件下進行三維培養可對膠質瘤細胞乾性明顯提升，且幹細胞比例不弱於經典的懸浮成球方法。進一步進行乾性基因、耐藥基因RT-PCR和western blotting的檢測，發現Q)133、Sox2、Nanog等乾性基因及MGMT等耐藥相關基因表達均顯著上調，尤其以Sox2、MGMT上調最顯著，參見圖3。流式細胞術顯示I %血清條件下，三維膠原支架中培養膠質瘤幹細胞(U87CD133+)比例上調(A10% FBS, B3% FBS, Cl%FBS，D無FBS)，該條件下，RT-PCR顯示乾性因子基因表達上調(E)，部分耐藥基因上調，MGMT最明顯(F)。Western blotting顯示相關因子蛋白水平上調(G)。驗證了 1%FBS+DMEM利用三維膠原支架培養膠質瘤U87細胞可上調細胞乾性，富集培養幹細胞，所培養的細胞同時耐藥基因及蛋白上 調。
【權利要求】
1.一種新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，其特徵在於，利用三維膠原支架，並摸索出適宜的低血清培養濃度，所述培養方法包括以下步驟: 1)將三維膠原支架切割成的立方體，使用前Co60照射消毒過夜，4°C乾燥環境儲存備用，待接種細胞前，以細胞培養液浸泡預處理12小時； 2)將膠質瘤細胞株消化離心至單細胞懸液，再用PBS洗淨2遍，以去除血清成份，並進行細胞計數，以每個三維膠原支架I X IO4~5 X IO4個細胞的密度將膠質瘤細胞接種於步驟I)處理後的三維膠原支架上，靜置4小時，待細胞有效粘附於支架上後，置於細胞培養板中培養，每2日更換I次培養液，即得到3D膠質瘤細胞模型。
2.根據權利要求1所述的新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，其特徵在於，步驟I)中所述的細胞培養液為添加I %胎牛血清的DMEM。
3.根據權利要求1所述的新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，其特徵在於，所述三維膠原支架的平均孔徑為50 μ m。
4.根據權利要求3所述的新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，其特徵在於，所述三維膠原支架的材料為I型膠原。
5.根據權利要求1所述的新型膠質瘤幹細胞的三維培養方法，其特徵在於，膠質瘤細胞株為U87細胞 。
【文檔編號】A61P35/00GK103898058SQ201410129815
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】呂東來, 卞修武, 陳葉苗 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院