改進高鹽法提取線粒體dna的方法及其應用的製作方法

2023-05-11 09:32:31 1

專利名稱：：改進高鹽法提取線粒體dna的方法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種DNA提取的方法，是一種從細胞中提取染色體DNA和細胞器DNA的方法，特別是涉及到線粒體DNA提取的方法及其應用。技術背景細胞中重要的細胞器線粒體在細胞凋亡、衰老及程序化死亡中發揮有重要作用。現已在多種疾病中發現患者細胞的線粒體DNA(mtDNA)發生突變。對此線粒體疾病的分子遺傳機理的研究可以進一步闡明這些疾病的病因，並為治療提供理論指導。將此mtDNA從細胞中分離提取出來是最基本的工作。胡義德、Tamura和Palva等用鹼變性法提取了人血白細胞、心肌等組織中的mtDNA;戴紀剛等建立了Triton法，先除去細胞核，再分離提取胞漿中的mtDNA。還有常用的高鹽法通過SDS(十二烷基硫酸鈉)破壞細胞膜、核膜，使蛋白質變性，'從而游離出核酸，EDTA抑制細胞中DNA酶的活性，蛋白酶K進一步將蛋白質降解成小肽，加入飽和乙酸鈉後，絕大部分線性大分子量DNA和蛋白質在SDS作用下變性形成沉澱，環狀mtDNA仍為自然狀態，通過高速離心，即可得到mtDNA。此3種方法各有優缺點鹼變性法操作時間較短，但要求條件比較嚴格，不易重複，不適合臨床大批量應用；Triton法通過核質分離提取mtDNA操作時間較短，但產量低，易降解。而高鹽法操作簡單，但一般常用的高鹽主要是氯化鈉，醋酸鈉等，只具有沉澱DNA的作用，所提取的mtDNA純度較低，質量不易控制。
發明內容本發明所解決的技術問題是提供一種在高鹽法的基礎上改進的高鹽法提取線粒體DNA的方法及其應用。本改進高鹽法提取線粒體DNA的方法中除了使用醋酸鈉等鹽類外，還在裂解細胞時同時使用了異硫氰酸胍、鹽酸胍等蛋白變性劑，其具有去除細胞內蛋白質的作用，可以大大提高其後步驟中提取線粒體DNA的純度。一種改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，包括以下步驟(1)細胞清洗取100300ii1的分離好的細胞或組織勻漿液，加入20900n1細胞清洗液，所述細胞清洗液為pH7.4的PBS緩衝液或生理鹽水，溫和條件下混勻，室溫或冰浴約IO分鐘，在800010000rpra轉速下離心2030秒，棄上清，重複上述步驟一或兩次後，得沉澱物A;(2)細胞裂解向所述沉澱物A中加入約300Pl的含有濃度為110mol/L的異硫氰酸胍或鹽酸胍的細胞裂解液，溫和振蕩或反覆用移液器吸打沉澱物A46次，在800010000rpm轉速下離心約30秒，取上清液B，棄沉澱物；(3)乙醇或異丙醇沉澱向所述上清液B中加入1/10其體積的濃度為3mol/L的pH5.2的NaAc溶液和2倍於其體積的乙醇或直接加入等體積的異丙醇，充分混勻，得混合物C;(4)將所述混合物C在1200014000rpm轉速下離心5分鐘，棄上清，再用75%乙醇重懸沉澱，1200014000rpm轉速下離心5分鐘，棄上清，室溫放置510分鐘後，加入約25u1TE緩衝液，所述TE緩衝液為pH7.2的0.01MTris.HC1和0.01MEDTA，混勻，50。C保溫510分鐘，在1200014000rpm轉速下離心約1分鐘，吸取上清，即得到所提取的線粒體DNA。本發明改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其中所述步驟(2)中的細胞裂解液的基礎成分為0.5%的NP-40裂解液，其包括50raMTris.HCl、15mMNaCl、5mMEDTA、0.5%NP-40和lraMPMSF，pH6.8，用時配製好後再加入異硫氰酸胍或鹽酸胍，使其濃度為110mol/L;也可以採用其他已知的可以破除細胞膜和核膜的常用裂解溶液。本發明改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其中所述步驟(1)和步驟(2)之間還包括步驟加入約20ul的20mg/ml的蛋白酶K溶液。可以更好地去除蛋白質。本發明改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其中所述步驟(2)中在加入含有異硫氰酸胍或鹽酸胍的細胞裂解液反覆振蕩後再向沉澱物A中加入1020u1的25mg/tnl的RNA酶A，室溫放置約10分鐘，再加入約800"1濃度為4mol/L的NaCl(V溶液，調節PH5.2，加入約20ul樹脂，混勻，室溫放置約5分鐘後再離心取上清液B。本發明改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，所述步驟(4)為以下步驟所替代將所述混合物C全部加入一個離心管式吸附柱中，所述吸附柱放入收集管中，在13000rpm轉速下離心3060秒，倒掉收集管中的廢液，加入約500yl抑制物去除液，所述抑制物去除液為50%異丙醇水溶液，在12000rpm轉速下離心30秒，棄廢液，再加入約700n1漂洗液，所述漂洗液為75%無水乙醇和3MNaAc的混合溶液，在12000rpm轉速下離心30秒，棄掉廢液，再加入500ul漂洗液，在12000rpm轉速下離心30秒，棄掉廢液，然後將吸附柱放至原先的收集管中，在13000rpm轉速下離心2分鐘，儘量除去漂洗液，取出吸附柱，放入一個乾淨的離心管中，在吸附柱的吸附膜的中間部位加50ul已在6570'C水浴中預熱的洗脫緩衝液TE，室溫放置35分鐘，在12000rpm轉速下離心l分鐘，將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，在12000rpm轉速下離心1分鐘，吸取上清，即得到所提取的線粒體DNA。本發明改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其中所述吸附柱的芯材料包括尼龍膜、矽膠膜或硝酸纖維素膜。本發明的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法可以使用常規生物學試劑製成試劑盒，直接應用在臨床標本中快速提取線粒體DNA。也可以直接應用在臨床標本中快速提取線粒體DNA。本發明改進高鹽法提取線粒體DNA的方法是非常方便快速提取線粒體DNA的方法。本方法不需要使用有毒的苯酚等試劑，結合吸附柱使用後更為快速，簡捷，單個樣品操作一般可在20分鐘內完成，多次柱漂洗確保高純度，典型的產量20(^1全血可提取出36Pg，0D260/0D280典型的比值達1.71.9，長度可達30kb50kb,可直接用於PCR、Southern-blot和各種酶切反應。該方法操作簡便、成本低，尤其適用於從臨床標本中(特別是外周血中)快速提取線粒體DNA。具體實施方式實施例1:不同濃度異硫氰酸胍處理與傳統高鹽法提取線粒體DNA對比實驗步驟(一)新鮮玩凝血或冷凍抗凝血1.取300u1全血，血液標本最好先去除紅細胞，加入900u1紅細胞裂解液(O.16MNHX1,0.13mMEDTA，12mMNaHC03;16.96mmol/LTris，用lmol/LHCL調PH至7.2,也可以直接採用商品化的紅細胞裂解液)溫和混勻56次，室溫或冰浴'10分鐘，8000rpm離心2030秒，棄上清。若紅細胞溶解不完全，則沉澱物發紅，可再加900iil紅細胞裂解液，重複上述步驟一次。若全血在使用之前被冷凍，則需重複步驟l、2兩次。2.沉澱物中加入300yl細胞清洗液，所述細胞清洗液為pH7.4的PBS緩衝液，溫和條件下混勻，室溫或冰浴約10分鐘，在8000rpm轉速下離心2030秒，棄上清，重複上述步驟一或兩次後，得沉澱物。3.加入300yl含有不同濃度的異硫氰酸胍(1，3，5，7，10mol/L)的細胞裂解液，溫和振蕩或反覆用移液器吸打白色沉澱物4~6次，加入10u1RNA酶A(25mg/ml)，室溫放置10分鐘。其中細胞裂解液的基礎成分為0.5%的NP-40裂解液，其包括50mMTris.Cl、15mMNaCl、5mMEDTA、0.5%NP-40和lmMPMSF,pH6.8，用時配製好後再加入異硫氰酸胍，使其濃度為1，3，5，7，10mol/L。4.再加入800ul4mol/LNaC104PH5.2，20ul樹月旨，混勻，室溫放置5分鐘。5.8000rpm離心30秒，取上清，棄沉澱物。6.向上清中加入1/10其體積的濃度為3mol/L的pH5.2的NaAc溶液，以及2倍於其體積的75%乙醇，充分混勻，得混合物。7.將所述混合物在12000轉速下離心5分鐘，棄上清，得沉澱物；8.用75%乙醇重懸沉澱，12000轉速下離心5分鐘，棄上清，室溫放置510分鐘後，加入約25wlTE(0.01MTrisHClPH7.2,0.01MEDTA)緩衝液，混勻，50。C保溫510分鐘，在12000rpm轉速下離心約l分鐘，吸取上清，即得到所提取的線粒體DNA。(二)分離好的白細胞1.取100yl白細胞，按l:3的比例加入細胞清洗液，所述細胞清洗液為生理鹽水，溫和條件下混勻，室溫或冰浴約10分鐘，在8000rpm轉速下離心2030秒，棄上清，重複上述步驟一或兩次後，得沉澱物。2.加入300yl含有不同濃度的異硫氰酸胍(1，3,5，7,1Omol/L)的細胞裂解液，充分混勻，加入10u1RNA酶A(25mg/ml)，室溫放置10分鐘。3.其餘接(一)的步驟4。表h實施例1線粒體DNA提取的結果tableseeoriginaldocumentpage7表1結果表明改進的前加異硫氰酸胍的高鹽法比傳統的高鹽法在DNA產量上有所提高，而且DNA質量上也有顯著的改善。實施例2:不同濃度鹽酸胍處理與傳統高鹽法提取線粒體DNA對比實驗步驟1.取300u1全血，血液標本最好先去除紅細胞，加入900p1紅細胞裂解液(O.16MNH4C1，0.13mMEDTA，12mMNaHC03;16.96mraol/LTris，用lraol/LHCL調PH至7.2，也可以直接採用商品化的紅細胞裂解液)溫和混勻56次，室溫或冰浴10分鐘，8000rpm離心2030秒，棄上清。若紅細胞溶解不完全，則沉澱物發紅，可再加900yl紅細胞裂解液，重複上述步驟一次。若全血在使用之前被冷凍，則需重複步驟l、2兩次。2.沉澱物中加入300iU細胞清洗液，所述細胞清洗液為pH7.4的PBS緩衝液，溫和條件下混勻，室溫或冰浴約10分鐘，在8000rpm轉速下離心2030秒，棄上清，重複上述步驟一或兩次後，得沉澱物。3.加入300y1含有不同濃度的鹽酸胍(1，3，5,7，10mol/L)的細胞裂解液，溫和振蕩或反覆用移液器吸打白色沉澱物46次，加入10u1RNA酶A(25mg/ml),室溫放置10分鐘。其中細胞裂解液的基礎成分為0.5%的NP-40裂解液，其包括50mMTris.Cl、15mMNaCl、5raMEDTA、0.5%NP-40和lmMPMSF,pH6.8，用時配製好後再加入鹽酸胍，使其濃度為1,3，5，7，10mol/L。4.再加入800nl4mol/LNaC104PH5.2，20ul樹脂，混勻，室溫放置5分鐘。5.8000rpm離心30秒，取上清，棄沉澱物。6.向上清中加入1/10其體積的濃度為3mol/L的pH5.2的NaAc溶液，以及2倍於其體積的75%乙醇，充分混勻，得混合物。7.將所述混合物在12000轉速下離心5分鐘，棄上清，得沉澱物；8.用75%乙醇重懸沉澱，12000轉速下離心5分鐘，棄上清，室溫放置510分鐘後，加入約25ulTE(0.01MTrisHClpH7.2,0.01MEDTA)緩衝液，混勻，50'C保溫510分鐘,在12000rpm轉速下離心約l分鐘，吸取上清，即得到所提取的線粒體DNA。(二)分離好的白細胞1.取100ul白細胞，按l:3的比例加入細胞清洗液，所述細胞清洗液為生理鹽水，溫和條件下混勻，室溫或冰浴約10分鐘，在8000rpm轉速下離心2030秒，棄上清，重複上述步驟一或兩次後，得沉澱物。2.加入300iU含有不同濃度的鹽酸胍(1，3,5，7，10mol/L)的細胞裂解液，充分混勻，加入10ulRNA酶A(25mg/ml),室溫放置10分鐘。3.其餘接(一)的步驟4。表2:實施例2線粒體DNA提取的結果tableseeoriginaldocumentpage8表2結果表明改進的高鹽鹽酸胍比傳統的高鹽法在DNA產量上有所提高，而且DNA質量上也有顯著的改善。吸附離心法與傳統方法的比較實驗步驟1、取200yl新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。如果全血起始量小於200ul，則用緩衝液或生理鹽水補足到200ul。如果起始量介於200u1300u1之間，則後續操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介於300y1lml之間，則需要先進行紅細胞裂解操作。2、加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200y1含有5mol/L異硫氰酸胍或鹽酸胍的細胞裂解液，立刻渦旋振蕩充分混勾，在70'C放置10分鐘。溶液應變清亮(但顏色偏黑色)。可選步驟，一般不需要如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200u1細胞裂解液前加20ulRNaseA(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置510分鐘。3、冷卻後加入100yl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉澱。上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低產量，必要時如樣品粘稠不易混勻時可以渦旋振蕩15秒混勻。4、將上一步混合物(包括可能有的沉澱)加入一個柱芯材料採用矽基質吸附膜的吸附柱中，(吸附柱放入收集管中)13000rpin離心3060秒，倒掉收集管中的廢液。5、加入500ul抑制物去除液(5(^異丙醇水溶液)，12000rpm離心30秒，棄廢液。其中抑制物去除液用於去除蛋白酶。6、加入700yl漂洗液(75《無水乙醇和3MNaAc),12000rpm離心30秒，棄掉廢液。7、加入500u1漂洗液，12000rpm離心30秒，棄掉廢液。8、將吸附柱放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，儘量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下遊反應。取出吸附柱，放入一個乾淨的離心管中，在吸附膜的中間部位加50ul洗脫緩衝液TE(洗脫緩衝液事先在65-7(TC水浴中預熱效果更好)，室溫放置35分鐘，12000rpm離心l分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液即為DNA樣品。本實施例採用高鹽法結合柱離心式吸附柱方法從細胞或組織中提取線粒體DNA(mtDNA)，獨特的高鹽裂解液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，然後基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附於離心柱內矽基質膜，再通過一系列快速的漂洗一離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最後低鹽的洗脫緩衝液將純淨基因組DNA從矽基質膜上洗脫。所得的線粒體DNA純度為1.8±0.1，得率為每毫升血液0.81.0嗎線粒體DNA，以此為模板進行PCR反應，擴增線粒體DNA編碼基因，產量豐富、特異性高。本實施例所提取的線粒體DNA質量和產量與實施例1、2相似，但是所耗費的時間縮短了大約一半，實施例l、2的所有操作步驟需要大約5060分鐘，而結合吸附柱離心只需要2030分鐘，大大縮短了時間，提高了效率。本方法所提取得到的線粒體DNA可以存放在28'C，如果要長時間存放，可以放置在—20°C。以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。權利要求1.一種改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)細胞清洗取100～300μl的分離好的細胞或組織勻漿液，加入20～900μl細胞清洗液，所述細胞清洗液為pH7.4的PBS緩衝液或生理鹽水，溫和條件下混勻，室溫或冰浴約10分鐘，在8000～10000rpm轉速下離心20～30秒，棄上清，重複上述步驟一或兩次後，得沉澱物A；(2)細胞裂解向所述沉澱物A中加入約300μl的含有濃度為1～10mol/L的異硫氰酸胍或鹽酸胍的細胞裂解液，溫和振蕩或反覆用移液器吸打沉澱物A4～6次，在8000～10000rpm轉速下離心約30秒，取上清液B，棄沉澱物；(3)乙醇或異丙醇沉澱向所述上清液B中加入1/10其體積的濃度為3mol/L的pH5.2的NaAc溶液和2倍於其體積的乙醇或只加入等體積的異丙醇，充分混勻，得混合物C；(4)將所述混合物C在12000～14000rpm轉速下離心5分鐘，棄上清，再用75％乙醇重懸沉澱，12000～14000rpm轉速下離心5分鐘，棄上清，室溫放置5～10分鐘後，加入約25μlTE緩衝液，所述TE緩衝液為pH7.2的0.01MTris.HCl和0.01MEDTA，混勻，50℃保溫5～10分鐘，在12000～14000rpm轉速下離心約1分鐘，吸取上清，即得到所提取的線粒體DNA。2.根據權利要求1所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的細胞裂解液的基礎成分為0.5%的NP-40裂解液，其包括50mMTris.HCl、15mMNaCl、5mMEDTA、0.5%NP-40和lmMPMSF，pH6.8，用時配製好後再加入異硫氰酸胍或鹽酸胍，使其濃度為110mol/L。3.根據權利要求2所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其特徵在於所述步驟(1)和步驟(2)之間還包括步驟加入約20ixl的20mg/ml的蛋白酶K溶液。4.根據權利要求3所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其特徵在於所述步驟(2)中在加入含有異硫氰酸胍或鹽酸胍的細胞裂解液反覆振蕩後再向沉澱物A中加入1020ul的25mg/ral的RNA酶A，室溫放置約10分鐘，再加入約800u1濃度為4mol/L的NaC104溶液，調節PH5.2，加入約20ul樹脂，混勻，室溫放置約5分鐘後再離心取上清液B。5.根據權利要求1所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其特徵在於所述步驟(4)為以下步驟所替代將所述混合物C全部加入一個離心管式吸附柱中，所述吸附柱放入收集管中，在13000rpm轉速下離心3060秒，倒掉收集管中的廢液，加入約500ul抑制物去除液，所述抑制物去除液為50%異丙醇水溶液，在12000rpm轉速下離心30秒，棄廢液，再加入約700ul漂洗液，所述漂洗液為75%無水乙醇和3MNaAc的混合溶液，在12000rpm轉速下離心30秒，棄掉廢液，再加入500ul漂洗液，在12000rpm轉速下離心30秒，棄掉廢液，然後將吸附柱放至原先的收集管中，在13000rpm轉速下離心2分鐘，儘量除去漂洗液，取出吸附柱，放入一個乾淨的離心管中，在吸附柱的吸附膜的中間部位加50ixl己在6570'C水浴中預熱的洗脫緩衝液TE，室溫放置35分鐘，在12000rpni轉速下離心1分鐘，將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，在12000卬m轉速下離心l分鐘，吸取上清，即得到所提取的線粒體DNA。6.根據權利要求5所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法，其特徵在於所述吸附柱的芯材料包括尼龍膜、矽膠膜或硝酸纖維素膜。7.—種在權利要求l一6中任一項所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法中使用的試劑盒,其特徵在於所述試劑盒包括權利要求l一6任一項所述的方法中使用的全部試劑，且按照使用的順序排列。8.權利要求1-6任一項所述的改進高鹽法提取線粒體DNA的方法在臨床標本中快速提取線粒體DNA的應用。9.權利要求7所述的試劑盒在臨床標本中快速提取線粒體DNA的應用。全文摘要一種在高鹽法的基礎上改進的高鹽法提取基因組和線粒體DNA的方法及其應用。本改進高鹽法提取線粒體DNA的方法中使用包含異硫氰酸胍、鹽酸胍等的蛋白變性劑進行細胞裂解，不僅具有沉澱蛋白質的作用，還具有抑制核酸酶的作用，可以大大提高DNA的純度和產量。結合吸附柱使用後更為快速，簡捷，單個樣品操作一般可在20分鐘內完成，多次柱漂洗確保高純度，可直接用於PCR、Southern-blot和各種酶切反應。該方法操作簡便、成本低，尤其適用於從臨床標本中(特別是外周血中)快速提取基因組和線粒體DNA。文檔編號C12P19/34GK101250522SQ20081010394公開日2008年8月27日申請日期2008年4月14日優先權日2008年4月14日發明者劉麗賢,樸戴,段海清,金政策,韓東一申請人:金政策