篩選方法及其應用的製作方法

2023-05-10 19:26:31 1

篩選方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及改善的篩選方法以及，具體地，涉及鑑定特異性針對差異的和/或不經常表達的配體的抗配體的篩選抗配體文庫的方法。
【專利說明】篩選方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及改進的篩選方法以及，具體地，涉及篩選抗配體文庫的方法，以鑑定對差異化表達的和/或不經常表達的配體特異的抗配體。
【背景技術】
[0002]基於蛋白質或多肽的文庫經常用於對某些配體具有特異性的抗配體分子的選擇。
[0003]此類文庫的構造使蛋白質分子以某種方式物理地連接到(physically linkedto)編碼特定蛋白質分子的遺傳信息。因此，該蛋白分子與其基因一起被展示。
[0004]常用的展示形式依賴於細胞或病毒宿主顆粒來提呈所述蛋白分子；並且包括細菌展不(Francisco 等，1993)和卩遼菌體展不(Smith, 1985 ；Smith 和 Scott, 1993 ；ffinter 等，1994)。這些系統在宿主顆粒的表面展示潛在的抗配體分子，同時所展示分子的遺傳信息藏於顆粒內部並且所述方法已被成功應用於基於特異性蛋白質的抗配體的篩選。
[0005]存在依賴於體外翻譯的其他展示形式；包括各種形式的依賴於遺傳信息與蛋白質分子的非共價連接的核糖體展示(Mattheakis等，1994 ；Hanes和Pluckthun, 1997 ；He和Taussig, 1997);並且其他展示形式也依賴於體外翻譯，藉此，在遺傳信息和潛在抗配體蛋白質分子之間存在共價連接，例如Profusion (Weng等,2002)或共價展示技術(Gao等，1997)。
[0006]所展示的肽或蛋白質類抗配體庫可以是完全隨機化的，例如，當使用肽文庫時，或它們可以基於插入賦予變異性的其他結構的恆定區的支架結構(constant regionscaffold structure)。
[0007]通常使用的支架結構基於抗體重鏈和輕鏈可變結構域(McCafferty等，1990),但還可以基於其它支架例如纖維連接蛋白(fibronectin) (Jacobsson和Frykberg,1995 ；Koide等，1998)、蛋白A結構域(Stahl等，1989)或小的穩定蛋白結構域，例如BPTI(Markland 等，1991)。
[0008]從展示文庫選擇顯示一定的結合特異性的抗配體通常通過使用所謂「生物淘選(biopanning)」的方法來進行。
[0009]靶配體可以固定於固相表面並且文庫的特異性抗配體成員暴露給固定的靶配體以使感興趣的抗配體與靶配體結合。未結合的文庫成員隨後被洗去並且感興趣的抗配體被回收並擴增。
[0010]除了抗配體文庫成員之外的蛋白質類顆粒，例如表達抗體片段的噬菌體，可能是「粘性的(Sticky)」，導致一些非靶特異性分子的結合與分離。非特異性結合可以通過以下方式最小化:加入某些化合物至抗配體展示構建體/配體混合物中以用作阻斷劑從而減少非特異性抗配體的背景結合，例如牛奶、牛血清白蛋白、血清(人/胎牛)、明膠以及對於某些(非細胞)應用，去汙劑(detergent)。
[0011]許多洗滌程序已經被設計用來減少文庫成員與細胞的非特異性結合，並幫助細胞從汙染和/或非特異性結 合的文庫成員上分離。[0012]此類方法包括洗滌通過磁力固定於柱子上的細胞(Siegel等，1997)，以最小化剪切力並允許解離的噬菌體的重新結合。洗滌細胞的另一個方法是在更高密度介質例如Ficoll或Percoll中離心，以選擇性去除非特異性和低親和力抗配體，並且進一步在空間上從游離抗配體和非特異性結合的抗配體中分離細胞和細胞結合的抗配體(Carlsson等，1988 !Williams和 Sharon，2002)。
[0013]取決於篩選方法(selection process)的有效性,可能需要幾輪淘選來去除或至少充分減少非特異性抗配體至期望的水平(Dower等，1991)。
[0014]在另一個篩選方法(selection method)中，祀配體結合同處於溶液中的特異性抗配體文庫成員。然後結合的抗配體通過採用例如可回收的標籤而分離，所述標籤附加至靶配體。最常使用的標籤是生物素，其允許靶分子和所展示的特異性文庫成員之間的複合體(complex)通過採用結合至固相支持物例如珠子上的親和素而得到回收(Siegel等，1997)。
[0015]當靶配體是公知的且以純化的形式提供時採用這些方法。一次針對一個單獨靶配體的篩選是常規的。針對幾種限定的靶配體的篩選可同時進行。靶配體可以是一種或更多種的小的半抗原、蛋白質、碳水化合物、DNA和脂類。
[0016]對於許多應用，針對差異表達的配體的特異性抗配體是感興趣的。例如，當與那些健康對照相比，蛋白質可在源自患有疾病的患者的細胞和組織上差異表達。這些疾病包括微生物、病毒或寄生蟲感染，哮喘，慢性炎症和自身免疫性疾病，癌症，神經、心血管或胃腸道疾病。相似的，體液的蛋白質組成，例如，血漿、腦脊液、尿液、精液、唾液和粘液，可能在健康對照和患有疾病的患者之間存在差異。
[0017]因此，除了它們作為鑑定差異表達的配體的研究工具的常規應用，特異性針對差異表達的配體的抗配體可以用作診斷、預防和/或治療疾病的工具。
[0018]基因組學和蛋白質組學領域中的最新進展已經表明了許多至今尚未確定為差異表達的分子的存在，強調了用於針對這些潛在的靶配體產生特異性的抗配體的方法的重要性。
[0019]許多這些差異表達的分子被期望著表達在細胞表面上，藉此組成採用例如特異性抗體的靶向治療的潛在靶標，所述特異性抗體可以偶聯至生物活性(例如細胞毒性)試劑上。
[0020]巨大並且高度多樣性的抗配體展示文庫提供特異性針對碳水化合物、蛋白質、月旨類或其組合作用的未知細胞配體的抗配體的分離方法。
[0021]原則上，當前可用的生物淘選過程包括基於全細胞、細胞部分和細胞膜的方法，其允許顯示特異性針對天然構型的細胞膜配體的抗配體的展示構建體的分離。
[0022]人類和人源化的治療性抗體日益被用於治療各種疾病，包括急性和慢性炎症性疾病、免疫和中樞神經系統疾病以及癌症。人類治療性抗體被認為是治療人類疾病最吸引人的方式，這是由於它們完全的人類來源以及相關的免疫原性的缺乏，參與抗體Fe依賴的宿主免疫效應機制的優化能力，以及它們與其鼠源、嵌合和人源化的相似抗體相比優異的體內半衰期。現在人類抗體通常通過不同的技術產生，包括人源化小鼠和高度多樣性的噬菌體抗體文庫。
[0023]大的(>105獨特 的(unique)抗體克隆)人類抗體文庫足夠多樣性，包含特異性針對顯著數量的抗原的高親和力抗體，所述抗原包括幾乎所有種類的自體抗原。在自體免疫疾病中，自體抗原是除了作為正常組織成分之外還是體液或細胞介導的免疫反應的靶標，代表了突出的治療意義上的抗原種類。
[0024]人類抗體文庫還被認為與攜帶人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠相比，當選擇結合人類和小鼠之間結構上保守的受體表位的抗體時，提供了優勢，因為這類抗體在體內是通過自身耐受機制負向選擇的。這些保守的區域尤其具有治療意義，因為保守區域經常是功能相關的(例如結合所必須的配體結合結構域並且賦予配體/受體誘導的細胞反應)，並且靶向這些保守表位的抗體可被篩選為協同實驗疾病模型系統內的體內治療活性。
[0025]特異性針對幾乎所有種類人類可溶性抗原(例如細胞因子、趨化因子、生長因子、脂類、碳水化合物和綴合分子等)，以及細胞表面受體(例如1TM、4TM、7TM和多TM跨膜受體等)的高親和力抗體已經成功從高度多樣性人類抗體文庫中分離出來。
[0026]細胞表面受體組成了一類具有突出的治療意義的靶標，並且結合不同癌症細胞相關受體的幾種抗體已被證實用於癌症治療，包括利妥昔單抗(rituximab)(抗⑶20)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(抗 Her2)和西妥昔單抗(cetuximab)(抗 EGFR)。
[0027]但是，從抗體受體特異性並不能很容易地預測治療的有效性；針對相同靶受體的抗體可能在治療有效性上差別很大，不依賴於它們的結合親和力(Beers等，2008 ；Cragg和Glennie，2004)，並且針對替代的分子靶標的抗體可能顯示是有希望的，並且有時是意想不到的治療潛力(Beck等，2010 ;Cheson和Leonard，2008)。例如，不同CD20特異性抗體克隆與CD20抗原具有相似的結合親和力並攜帶相同的小鼠IgG2a恆定區，但在體內消耗B細胞的能力根本上不同(Beers等，2008 ；Cragg和Glennie，2004)，並且針對其他不是CD20的腫瘤相關細胞表面 受體的抗體可能具有針對B細胞癌症的顯著抗腫瘤活性(綜述請參見Cheson 和 Leonard,2008)。
[0028]因此，在高度多樣性的抗體文庫中，對任何給定類型的癌症最具治療有效性的、強力的和最耐受的抗體很可能是特異性針對幾種不同受體的任何一種，並且在高度多樣性的文庫中鑑定治療性優化的抗體克隆需要對多個並且理想狀況下所有的特異性針對不同疾病細胞相關的受體的文庫成員進行功能篩選。
[0029] 申請人:之前已經開發了能夠從人類噬菌體抗體文庫回收結合至不同表面受體的抗體克隆的篩選技術(生物淘選方法)，與其他細胞群體(非靶細胞)相比所述受體在一種細胞群體(靶細胞)上差異表達(W02004/023140，Fransson 等，2006 ；Frendeus, 2006)(在下文中被稱為差異生物淘選)。W02004/023140的公開內容(和其所有國家階段遞交的衍生內容)全文作為參考引入本發明。
[0030]這個篩選方法實質上包括六個步驟，如圖1所示。重要的是，這個方法包括以下順序的篩選步驟:
[0031]I)差異生物淘選，然後
[0032]2)篩選靶標對非靶標的特異性，然後
[0033]3)更小量的克隆通過Sanger技術進行常規測序
[0034]採用這個技術，使得產生顯示針對差異表達表面受體的靶細胞對非靶細胞的高特異性的抗體池成為可能。
[0035]Sanger測序是當前用於在「低通量」方式下鑑定獨特結合物的技術的一個例子。其他例子包括在限制性酶消化之前和之後跑抗體基因DNA的膠，並通過對不同的限制性酶(間接地，不同的序列)不同的敏感性揭示獨特大小。
[0036]當用於分離靶向癌症B細胞(靶標)對T細胞(非靶標)差異表達的表面受體的抗體時(「B非T」 (BnonT)差異淘選)，該方法鑑定了針對不同靶細胞差異表達的表面受體的抗體，包括HLA-DR、表面Ig和ICAM-1 (表1)。
[0037]表1.通過現有篩選方法分離的抗體的頻率和特異性，例如連續差異生物淘選、結合篩選和Sanger測序，靶向癌症B細胞對T細胞差異表達的表面受體(「B非T」差異淘選)
[0038]
【權利要求】
1.一種分離針對至少一種差異表達的靶配體的至少一種抗配體的方法，包括以下步驟: (a)對抗配體的文庫進行差異生物淘選以分離至少一種抗配體；以及 (b)對步驟(a)中分離的抗配體進行高通量測序。
2.如權利要求1所述的方法，還包括以下步驟: (c)對特異性針對差異表達的配體的抗體進行驗證篩選。
3.如前述權利要求任一項所述的方法，其中差異生物淘選步驟包括以下子步驟: (i)提供抗配體的文庫； (ii)提供含有固定至或整合入減法配體構建體的配體的第一配體群； (iii)提供含有固定至或整合入靶配體構建體的、與步驟(ii)的配體相同的配體的第二配體群； (iv)通過使用從質量作用的普遍規律得出的一個或多個方程確定群中減法配體構建體和靶配體構建體的量:
4.如前述權利要求任一項所述的方法，其中高通量測序步驟利用454測序、Illumina、SOLiD方法或Helicos系統進行。
5.如前述權利要求任一項所述的方法，其中驗證篩選步驟利用流式細胞術、FMAT、ELISA、MSD 或 CBA 進行。
6.如權利要求3所述的方法，其中配體不表達於靶構建體或減法構建體之一。
7.如權利要求3或6所述的方法，包括從配體釋放抗配體的進一步步驟。
8.如權利要求3或6或7所述的方法，其中步驟(ii)至(ix)平行進行，以分離針對多個不同配體的多個抗配體。
9.如權利要求3或6-8所述的方法，其中步驟(ii)至(ix)重複一次或多次。
10.如權利要求3或6-9所述的方法，其中減法構建體或靶構建體之一的量以過量於減法構建體或靶構建體另一個的方式提供。
11.如權利要求10所述的方法，其中配體的過量在10和1000倍之間或在2和10倍之間或1000和I, 000，000倍之間。
12.如權利要求3或6-11所述的方法，其中步驟(iv)的方程是:
13.如權利要求3或6-12所述的方法，其中分離裝置選自固相支持物、細胞膜和/或其部分、合成膜、珠子、化學標籤和自由配體的至少一種。
14.如權利要求3或6-13所述的方法，其中減法構建體和靶構建體的分離裝置具有不同的密度。
15.如權利要求3或6-14所述的方法，其中減法構建體的分離裝置為膜囊或整個細胞膜。
16.如權利要求3或6-15所述的方法，其中步驟(ix)利用密度離心、固相支持封存、磁珠封存、化學標籤結合和水相分配的至少一種進行。
17.如前述權利要求任一項所述的方法，其中步驟(a)的文庫是包含多個展示抗配體的文庫成員的展示文庫。
18.如前述權利要求任一項所述的方法，其中文庫是噬菌體展示文庫。
19.如前述權利要求任一項所述的方法，其中配體是抗原；受體配體；以及含有碳水化合物、蛋白質、肽、脂類、多核苷酸、無機分子和綴合分子的至少一種的酶靶標的至少一種。
20.如前述權利要求任一項所述的方法，其中抗配體文庫可通過抗體和抗原結合性變體、其衍生物或其片段；具有工程化的可變表面的支架分子；受體；和酶的至少一種進行構建。
21.如權利要求3或6-20所述的方法，其還包括暴露配體及其分離裝置至影響靶配體在所述配體構建體上的表達的刺激物的進一步步驟。
22.—種製備藥物組合物的方法，其包括，在通過前述權利要求任一項所述的方法鑑定具有期望性質的抗配體後，將所述抗配體加至藥學上可接受的載體。
23.由權利要求22的方法製備的藥物組合物，其用於醫藥中。
24.權利要求23的藥物組合物在製備用於預防、治療、成像、診斷或預後疾病的藥物中的用途。
25.實質上如本發明·實施例和附圖所述的方法。
【文檔編號】G01N33/68GK103827302SQ201280046053
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年9月20日 優先權日:2011年9月22日
【發明者】比約恩·弗倫多斯, 詹妮·馬特森 申請人:生物發明國際公司