培養基及其在發酵生產丙酸中的應用的製作方法

2023-05-10 19:45:51 1

本發明涉及微生物發酵技術領域，尤其涉及培養基及其在發酵生產丙酸中的應用。

背景技術：

丙酸及其鈣鹽作為一種防腐保鮮劑，對於黴菌、酵母菌及細菌等具有廣泛的抗菌作用，尤其是丙酸鈣，在酸性條件下，產生游離丙酸，具有抗菌作用。丙酸鈣其抑菌作用受環境pH值的影響，在pH值5.0時黴菌的抑制作用最佳；pH值6.0時抑菌能力明顯降低，最小抑菌濃度為0.01％。在酸性介質(澱粉、含蛋白質和油脂物質)中丙酸及其鈣鹽對各類黴菌、革蘭氏陰性桿菌或好氧芽孢桿菌有較強的抑制作用，還可以抑制黃麴黴素的產生，而對酵母菌無害，對人畜無害，無毒副作用，並能給人畜提供必需的鈣。因此丙酸及其鈣鹽是食品、釀造、飼料、中藥製劑諸方面的一種新型、安全、高效的食品與飼料用防黴劑，被廣泛的應用於食品、飼料、醫藥等方面。

丙酸還是種重要的精細化工原料及產品，在有機合成工業、塗料、油漆、染料、化妝品、醫藥、農藥、香料、林產化學產業及其它一些部門有著廣泛的應用。以丙酸作原料可製得DL-丙氨酸，進而可生產維生素B6；用丙酸、乙酸和纖維素反應生成CAP，可生成一種生物可降解塑料；還用於生產農藥除草劑的2-氯丙酸，用於工業、建築等的粘著劑、防水劑的丙酸乙烯酯等，都是以丙酸作為原料；丙酸另外還可用作電鍍助劑等。

現有丙酸及其鈣鹽生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法。國際上主要採用化學合成法以石油為原料工業化生產丙酸及其鈣鹽，然而，化學合成法汙染重、成本高、操作條件苛刻，不符合全球環保意識不斷增強的潮流，因此，人們逐漸把注意力投向了微生物發酵法。

目前，國內工業上常使用甘油作為碳源發酵培養基發酵生產丙酸，所得丙酸與鹼或鹽進一步反應生成相應的丙酸鹽，但是以甘油為碳源丙酸菌菌體生長速度緩慢，達到所需菌體密度時間較長，從而使發酵時間延長，所以縮短發酵時間進行高密度培養提高產量已成為微生物法發酵丙酸鈣研究的主要方向。

技術實現要素：

有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供培養基及其在發酵生產丙酸中的應用，本發明在發酵培養基中添加氯化血紅素、無機鹽，並以葡萄糖作為碳源，從而使丙酸桿菌生長旺盛，提高了丙酸的產量。

本發明提供了一種活化產酸丙酸桿菌種子的培養基，包括：

本發明實施例中，活化產酸丙酸桿菌種子的培養基的pH值為7.0。

其中，葡萄糖的濃度為20g/L。

酵母提取物為酵母粉，蛋白腖為胰蛋白腖大豆肉湯。

本發明還提供了一種發酵培養基，包括水和：

本發明實施例中，發酵培養基中包括：

本發明實施例中，發酵培養基中包括：

本發明實施例中，發酵培養基中包括：

本發明實施例中，發酵培養基中包括：

本發明實施例中，活化產酸丙酸桿菌種子的培養基的pH值為7.0。

其中，葡萄糖的濃度為20g/L。

酵母提取物為酵母膏。

本發明提供的發酵培養基以葡萄糖為碳源，其中添加氯化血紅素及硫酸錳、氯化鎂，從而能夠提高產酸丙酸桿菌的活性，使菌種生長良好，並且提高丙酸的產量，實驗表明，採用本發明提供的發酵培養基進行發酵生產丙酸，丙酸的在培養液中的含量可達244.7ppm。發酵生產率為0.213g/(L·h)，生產速率比原發酵生產率0.143g/(L·h)提高了48.83％。

本發明提供的發酵培養基在發酵生產丙酸中的應用。

本發明還提供了一種發酵生產丙酸的方法，包括：

步驟1：以活化產酸丙酸桿菌種子的培養基將保藏編號為CGMCC 1.2232的產酸丙酸桿菌活化，製得活化菌種；

步驟2：將活化菌種接種至本發明提供的發酵培養基，經發酵至pH值恆定獲得含有丙酸的發酵液；

所述發酵至120h，補加甘油及氯化血紅素。

步驟1中所述活化為將保藏編號為CGMCC 1.2232的產酸丙酸桿菌接種於活化產酸丙酸桿菌種子的培養基，在無氧條件下，30℃培養48h。

活化步驟中，所述產酸丙酸桿菌與活化產酸丙酸桿菌種子的培養基的體積比為1:99。

活化步驟中，培養基的體積佔培養用厭氧瓶體積的4/5。優選為，250mL厭氧瓶裝200mL活化產酸丙酸桿菌種子的培養基。

其中，步驟2中活化菌種與本發明提供的發酵培養基的體積比為1:9。

為保持無氧條件需持續充入氮氣。

本發明所述發酵生產丙酸的方法在發酵過程中對發酵pH進行分段控制。

所述分段控制優選為：發酵0～120小時的pH值為5.5～6.7；發酵120h後，pH值為6.8～6.99。

具體的，步驟2中發酵的條件為無氧發酵，溫度為30℃～35℃，攪拌轉速50rpm～150rpm，發酵前120h調節pH值為6.2；120h後調節pH值為6.9。

pH值的調節採用流加鹼液的方式。

所述鹼液為氫氧化鈣水溶液。其中，Ca(OH)2的質量-體積(g/mL)比為10％。

一些實施例中，步驟2中無氧發酵的溫度為30℃，攪拌轉速為150rpm。

氯化血紅素溶解於甘油；所述補加至發酵液中氯化血紅素的濃度為4mg/L；補加至發酵液中甘油的濃度為20g/L～40g/L。

本發明中，步驟2中無氧發酵於發酵罐中進行，為保持無氧條件需持續充入氮氣。發酵罐中，發酵培養基佔發酵罐體積的3/5。優選為，10L發酵罐裝6L發酵培養基。經過流加鹼液、補加含有氯化血紅素的甘油、發酵後，發酵液的體積為7L。

作為優選，產酸丙酸桿菌在活化前經過前處理；前處理為將保藏編號為CGMCC 1.2232的產酸丙酸桿菌接種於前處理培養基；在無氧條件下，30℃培養60h；所述前處理培養基包括：

前處理中，所述產酸丙酸桿菌與活化產酸丙酸桿菌種子的培養基的體積比為1:99。

為了製得丙酸產品，將步驟2中獲得的含有丙酸的發酵液經離心機離心後，去除菌體，取上清液進行噴霧乾燥，獲得丙酸產品。

本發明提供培養基，並提供了利用培養基進行發酵生產丙酸的方法，本發明以葡萄糖為碳源，其中添加氯化血紅素及硫酸錳、氯化鎂，從而能夠提高產酸丙酸桿菌的活性，使菌種生長良好，並且提高丙酸的產量，實驗表明，採用本發明提供的發酵培養基進行發酵生產丙酸，丙酸在培養液中的含量可達48.95g/L。發酵生產率為0.213g/(L·h)，生產速率比原發酵生產率0.143g/(L·h)提高了48.83％。

附圖說明

圖1示實施例1測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度；

圖2示實施例2測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度；

圖3示實施例3測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度；

圖4示實施例4測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度；

圖5示實施例5測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度；

圖6示對比例1測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度；

圖7示對比例2測量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標為時間，縱坐標為高度。

具體實施方式

本發明提供了培養基及其在發酵生產丙酸中的應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。

本發明採用的儀器皆為普通市售品，皆可於市場購得。

下面結合實施例，進一步闡述本發明：

實施例1本發明發酵工藝生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計，二級種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，初始發酵培養基成分：按重量百分比計，酵母膏：10g/L、蛋白腖：5g/L、氯化血紅素3mg/L、硫酸錳0.015g/L、氯化鎂0.02g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：10g/L，餘量為水，發酵120小時後，按發酵液體積計算，補加30g/L的甘油及4mg/L的氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率150rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，發酵前120小時將pH值維持在6.2，發酵120小時後將pH維持在6.9。

3、發酵過程結束：

pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為37.25g/L(圖1)，發酵所用時間為216h，丙酸生產速率為0.172g/(L·h)，生產率提高20.58％。

實施例2本發明發酵工藝生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計，二級種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，初始發酵培養基成分：按重量百分比計，酵母膏：10g/L、蛋白腖：5g/L、氯化血紅素3mg/L、硫酸錳0.015g/L、氯化鎂0.02g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，餘量為水，發酵120小時後，按發酵液體積計算，補加30g/L的甘油及4mg/L氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率150rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，發酵前120小時將pH值維持在6.2，發酵120小時後將pH維持在6.9。

3、發酵過程結束：

pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為38.70g/L(圖2)，發酵所用時間為214h，丙酸生產速率為0.181g/(L·h)，生產率提高26.47％。

實施例3本發明發酵工藝生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計，二級種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，初始發酵培養基成分：按重量百分比計，酵母膏：10g/L、蛋白腖：5g/L、氯化血紅素3mg/L、硫酸錳0.015g/L、氯化鎂0.02g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：30g/L，餘量為水，發酵120小時後，按發酵液體積計算，補加30g/L的甘油及4mg/L氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率150rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，發酵前120小時將pH值維持在6.2，發酵120小時後將pH維持在6.9。

3、發酵過程結束：

pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為40.35g/L(圖3)，發酵所用時間為210h，丙酸生產速率為0.192g/(L·h)，生產率提高34.37％。

實施例4本發明發酵工藝生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計，二級種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，初始發酵培養基成分：按重量百分比計，酵母膏：10g/L、蛋白腖：5g/L、氯化血紅素2mg/L、硫酸錳0.01g/L、氯化鎂0.01g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，餘量為水，發酵120小時後，按發酵液體積計算，補加20g/L的甘油及4mg/L的氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率150rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，發酵前120小時將pH值維持在6.2，發酵120小時後將pH維持在6.9。

3、發酵過程結束：

pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為36.13g/L(圖4)，發酵所用時間為217h，丙酸生產速率為0.166g/(L·h)，生產率提高16.43％。

實施例5本發明發酵工藝生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計，二級種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，初始發酵培養基成分：按重量百分比計，酵母膏：10g/L、蛋白腖：5g/L、氯化血紅素4mg/L、硫酸錳0.025g/L、氯化鎂0.03g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，餘量為水，發酵120小時後，按發酵液體積計算，補加40g/L的甘油及4mg/L的氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率150rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，發酵前120小時將pH值維持在6.2，發酵120小時後將pH維持在6.9。

3、發酵過程結束：

pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為48.95g/L(圖5)，發酵所用時間為230h，丙酸生產速率為0.213g/(L·h)，生產率提高48.83％。

對比例1現有發酵工藝生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、甘油：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、甘油：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，發酵培養基成分：按重量體積百分比計，酵母粉：10g/L、蛋白腖：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、甘油：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

2、將種子液按照5％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率50rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，將pH值維持在7.0。

3、發酵過程結束：

當pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為33.7g/L(圖6)，發酵所用時間為235h，丙酸生產速率為0.143g/(L·h)。

對比例2其它培養基發酵生產丙酸

一、預處理

將常規甘油保藏的產酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種於裝有種子培養基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養基)中，向厭氧瓶中充氮氣後，置於30℃培養箱靜置培養60h。按重量體積百分比(g/ml)計，種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，餘量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養所得菌種按照1％的接種量無菌轉入裝有種子培養基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養基)，充入無菌氮氣，培養溫度為30℃，時間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計，二級種子培養基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白腖大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，餘量為水，pH 7.0。

三、生產發酵

1、在10L發酵罐中投入6L發酵培養基，初始發酵培養基成分：按重量百分比計，酵母膏：10g/L、蛋白腖：5g/L、氯化血紅素4mg/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，餘量為水，發酵120小時後，按發酵液體積計算，補加40g/L的甘油及4mg/L氯化血紅素。

2、將種子液按照5％的接種量接種於發酵罐中；

發酵生產：培養溫度為30℃，攪拌速率50rpm，並保持氮氣的持續充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)2溶液，將pH值維持在7.0。

3、發酵過程結束：

當pH值不再變化，發酵停止，離子色譜法測量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為34.9g/L(圖7)，發酵所用時間為226h，丙酸生產速率為0.154g/(L·h)。

以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。