一種獲得耐鹽轉基因大豆材料的方法與流程
2023-05-11 06:30:06
本發明屬於植物基因工程技術領域，具體涉及一種利用轉基因技術獲得耐鹽大豆新材料的方法。
背景技術：
大豆一直是我國重要的糧食作物和油料作物，但在最近20年，受國外進口大豆衝擊及國內比較效益導致的種植結構調整的影響，我國大豆生產種植面積急劇下降，自1996年由大豆淨出口國轉變成大豆淨進口國以來，大豆進口量逐年增長，2015年達到8169萬噸，佔國內大豆消費總量的87%。隨著我國農業供給側結構性改革的提出與實施，國內大豆種植業迎來了良好機遇。
土壤鹽鹼化是影響大豆生長發育和產量的重要因素，大豆受到鹽脅迫後，其株高、主莖節數、單株莢數、百粒重等關鍵指標均顯著下降。全球有20%耕地受到不同程度的鹽害威脅，在我國鹽鹼地面積達到3300萬公頃以上。因此，如何有效降低鹽鹼非生物逆境對大豆等農作物的影響，增加有效耕地面積，提高糧食總產，保障農業可持續發展是目前我國糧食作物生產中面臨的一個重大問題。
轉基因技術作為近20年應用速度最快的作物育種技術，在抗病蟲、抗除草劑、抗旱作物新品種培育方面均獲得了突破性進展，轉基因作物的商業化應用給全球農業可持續發展帶來了顯著的經濟、生態和社會效益。隨著大豆轉基因技術日趨成熟以及耐鹽相關基因越來越多地被挖掘出來，利用轉基因技術獲得耐鹽大豆新材料成為大豆新品種培育的有效途徑。
agglpf基因是吉林大學張世宏教授課題組從嗜鹽麴黴中克隆出的一種水甘油通道蛋白基因，該基因在酵母細胞中過表達後，能顯著提高受體細胞的抗鹽性、抗旱性和抗金屬離子的特性。此外，與野生型擬南芥相比，轉agglpf基因擬南芥對高鹽和乾旱脅迫的耐受性得到顯著提升。這些研究表明，agglpf基因是一種性狀較為突出的耐鹽基因，但未見有將agglpf基因轉入大豆中的報導。
技術實現要素：
本發明的目的是利用轉基因技術將agglpf基因轉入受體大豆中，進而獲得轉agglpf基因耐鹽大豆材料，提高大豆的耐鹽性，促進大豆產業的發展。
為實現上述目的，本發明所採用的技術方案如下：
提供一種含有agglpf基因的植物表達載體pyl-agglpf，該表達載體是通過對agglpf基因全序列進行xmai和spei雙酶切，並克隆到基礎載體pyl的t-dna區多克隆位點而得到。該表達載體含有一個篩選基因bar，一方面有利於轉化體的篩選，減小後期檢測工作量，另一方面可以通過檢測bar基因來進一步證明目的基因已轉入受體植株。
提供一種轉agglpf基因耐鹽大豆的培育方法，該方法先將agglpf基因克隆構建至表達載體pyl中，再利用根癌農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化法將agglpf基因轉入大豆受體品種p3的基因組中，最終得到耐鹽轉基因大豆材料。但是，本實驗提供的方法不僅限於此，任何一種轉化方法能將本發明提供的重組表達載體導入大豆基因組中都適用。
所述轉agglpf基因耐鹽大豆的培育方法，包括如下步驟：
（1）農桿菌介導的大豆遺傳轉化：將含有agglpf基因的植物表達載體pyl-agglpf，利用根癌農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化法導入大豆受體品種的基因組中，獲得t0代轉化植株；
（2）轉agglpf基因大豆材料的篩選：應用bar試紙條檢測、草胺膦除草劑塗抹、agglpf基因pcr擴增等方法對t0代轉化植株進行篩選鑑定，獲得陽性植株，進行自交獲得t1代種子；對t1代陽性植株進行southernblot分析，獲得外源目的基因為單拷貝的轉基因材料，進行自交獲得t2代種子；
（3）轉agglpf基因大豆材料的耐鹽性鑑定：用200mmnacl溶液對t2代陽性植株進行耐鹽性鑑定，獲得轉agglpf基因耐鹽大豆材料。
所述轉agglpf基因耐鹽大豆具有下述（1）和（2）中的全部特徵：
（1）所述轉基因大豆與所述受體大豆相比，耐鹽性顯著提高；
（2）所述轉基因大豆與所述受體大豆相比，抗除草劑效果顯著提高。
實驗證明，利用本發明提供的方法，可獲得同時抗除草劑和耐鹽的轉基因大豆材料，與受體大豆相比，利用本發明提供的方法培育的耐鹽轉基因大豆不僅對除草劑草胺膦有明顯的抗性，且耐鹽性明顯提高。利用本方法獲得的耐鹽轉基因大豆材料是未來應對緩解土壤鹽漬化的有效途徑之一，對農業生產具有重要的經濟價值和廣闊的應用前景。
附圖說明
圖1為agglpf基因表達載體圖譜及載體構建電泳檢測結果圖，其中a為pyl-agglpf表達載體圖譜，b為相應載體酶切電泳檢測結果圖。
圖2為農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化過程圖。
圖3為t0代轉agglpf基因大豆陽性植株的除草劑塗抹檢測結果圖。
圖4為t0代轉化植株的pcr分析電泳圖。
圖5為t1代轉agglpf基因大豆植株的southernblot雜交結果圖。
圖6為t2代轉agglpf基因大豆植株的耐鹽性鑑定結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1植物表達載體構建。
根據ncbi上公開的agglpf基因（genbank登錄號kj679500）的核苷酸序列，按照植物密碼子偏愛性人工合成agglpf基因。根據植物雙元表達載體多克隆位點分子特徵，分別在agglpf基因上遊引入內切酶xmai酶切位點，下遊引入內切酶spei酶切位點。
通過pcr方法擴增得到agglpf基因全長序列（861bp），並通過雙切雙連的方法進行xmai和spei酶切後，將agglpf基因連接至pyl載體上獲得表達載體pyl-agglpf（圖1a），構建好的質粒經測序和酶切檢測（圖1b），將驗證正確的植物表達載體轉入農桿菌eha101中，用於下一步大豆遺傳轉化。
實施例2農桿菌介導的大豆遺傳轉化。
在本研究中，選擇帶有目的基因agglpf的農桿菌菌株eha101，利用根癌農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化法對大豆受體品種p3進行遺傳轉化。
農桿菌介導大豆子葉節轉化法的過程見圖2，基本流程如下：
（1）農桿菌28℃培養16h後收集菌體，轉入yep液體培養基中，直至od600值0.5～0.7備用；
（2）選取大豆受體品種p3成熟種子，氯氣滅菌16h。滅菌後種子放入gm萌發培養基（培養基配方參照olhoft等）弱光萌發16h；
（3）切子葉節，從胚軸處將大豆種子一分為二，切時刀尖蘸工程菌液。將切開後的子葉節放入工程菌液中，輕柔晃動30min，轉入共培養基中，避光培養（23℃，3～5d）；
（4）共培養後，將伸長的胚軸切去約2/3，保留約5mm的胚軸，插入加篩選劑的sim伸長培養基中，誘導叢生芽生長，培養條件25℃，光照16h/d，光照強度2000lx；
（5）在sim培養基中培養7d後，轉入sem篩選培養基中，間隔15d繼代1次，篩選3～4輪，得到分生苗；
（6）將已經伸長的分生苗從外置體上切下，轉入生根培養基中生根；
（7）生根健全的轉化苗，經煉苗（3～5d）後移入盆中栽培。
在本實驗中我們共製備了1700個大豆外植體，發生誘導的外植體有801個，最終得到t0代轉基因再生植株68株，其中經bar試紙條檢測呈陽性為49株，轉化率接近8.5%。
實施例3轉基因植株的草胺膦抗性檢測。
由於植物表達載體中以草胺膦作為篩選標記，因此在t0代轉基因材料苗期可採用草胺膦塗抹葉片的方法快速檢測轉基因陽性苗。
具體方法：用棉籤蘸取濃度為135mg/l的適量草胺膦溶液，輕柔擦拭半片葉子，同葉以塗抹清水作為對照，在正常光照情況下3～5d後觀察葉片生長情況，若塗抹部位出現枯萎，則不抗草胺膦（圖3）。
在本研究中，我們將經bar試紙條初檢呈陽性的49株再生植株移栽至溫室花盆中培養，利用草胺膦抗性檢測方法，最終得到36個t0代轉基因材料。
實施例4t0代轉基因植株的pcr檢測。
根據agglpf基因序列設計基因全長檢測引物，引物序列如下：
引物1（上遊引物）：atgctccataactttgttggtt；
引物2（下遊引物）：tcaatccagtcggagagctgtgt。
使用ctab法提取大豆轉化植株及受體對照p3的基因組dna。
利用上述引物對36個t0代轉化植株基因組dna進行目的基因agglpf的pcr擴增檢測。
pcr反應體系（20µl）：dna模板50ng，10×buffer2.0µl，2.5mmdntps2µl，10µm引物各0.5µl，5u/µltaq酶0.2µl，加ddh2o至20µl。pcr反應程序：95℃預變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸5min。
pcr擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結果利用凝膠成像系統進行拍照和分析。
agglpf基因的pcr擴增結果如圖4所示，在36個t0代轉化植株中有29株含有目的基因agglpf。
實施例5t1代轉基因植株的southernblot分析。
為了檢測agglpf基因整合到大豆基因組中的拷貝數，選取10個t1代轉基因材料進行基因組dna的southernblot分析。
southernblot分析使用的是roche的地高辛試劑盒kitⅱ型，實驗具體流程參照試劑盒說明書。
以克隆到載體上的agglpf基因全長序列（861bp）作為southern雜交探針，使用ecori內切酶進行基因組dna酶切。
實驗結果表明，有4個轉基因品系表現為外源目的基因以單拷貝插入到基因組中（圖5的泳道2、4、7、10），說明目的基因已經真正的整合到植物基因組中，其中雜交帶大小有所不同，說明不同轉基因品系中的外源基因整合位點不同。
實施例6轉基因大豆材料耐鹽性鑑定。
取經southernblot鑑定agglpf為單拷貝的轉基因大豆的t2代株系的種子，進行大豆苗期耐鹽性鑑定，將受體材料和轉基因材料播種在裝有ph7.5左右的草炭土營養缽中，每份材料均播種30粒以上，轉基因和對照材料分別設定2組（澆灌鹽水組及澆清水對照組），每組設定5次重複。在幼苗生長至2片複葉完全展開以後，轉基因和對照材料各選一組，用200mm的nacl溶液澆灌，其他轉基因材料和對照材料正常澆水。
1周以後觀察鹽害情況，篩選到耐鹽的轉基因材料，見圖6。其中ck1為非轉基因大豆澆灌鹽水處理，ck2為非轉基因大豆澆灌清水處理，d1為轉基因大豆澆灌鹽水處理，d2為轉基因大豆澆灌清水處理。
實驗結果表明，轉基因基因大豆植株在鹽脅迫處理1周後仍然存活，且與未經鹽脅迫處理的植株生長狀況無顯著性差異，而非轉基因植株在鹽脅迫處理3天後就開始出現葉片枯萎的症狀，1周後完全死亡，表明我們獲得了耐鹽性較好的轉agglpf基因大豆材料。
應當說明的是，上述實施例為本發明的具體實施例子，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，本領域技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有改進和變更，均應認為是本發明的保護範圍。
吉林省農業科學院
一種獲得耐鹽轉基因大豆新材料的方法
2
1
22
dna
人工序列
agglpf基因的pcr檢測引物1
1
atgctccataactttgttggtt22
2
23
dna
人工序列
agglpf基因的pcr檢測引物2
2
tcaatccagtcggagagctgtgt23