血小板糖蛋白IB－α變體融合多肽及其用法的製作方法

2023-05-10 18:01:46

專利名稱：血小板糖蛋白IB－α變體融合多肽及其用法的製作方法
背景技術：
與血管相關的疾病的負面作用，比如中風、心臟病、動脈硬化，被認為至少部分是由血管炎症及其修復反應所引起的。血管炎症及修復反應包括血液循環中的多種類型細胞之間的交互粘附作用。此方面的例子可能出現在血小板、白細胞和血管內表面(也就是血管內皮)之間。在流體剪向衝擊力較大的條件下，血小板會通過其表面的Ib-IX-V糖蛋白複合體和位於血管內皮外膜的血管性血友病因子之間的交互作用而粘附在血管的內皮上。此外，附著在血管內皮上的血小板還會在v-WF(血管性血友病因子)作用的範圍內粘附血管血液中的其他血小板，從而使血小板層疊形成的血栓增厚。由GPIb-IX-V形成的GPIα鏈也使得α-凝血酶更容易附著到血小板的表面，從而加強了GPV和活性蛋白酶受體(PARs)的凝血酶促進分裂。
與此相對的是，白血球也可以直接粘附於活性血管內皮，或間接得通過由vWF固定的血小板附著.在這兩種情況下，白血球細胞表面的粘附在選擇蛋白或整聯蛋白組粘合受體的分子都會促進這樣的粘附過程.一般認為，白血球-血小板之間的粘合，至少部分是由於，白血球表面的整聯蛋白分子MacI和血小板表面的GPIb-IX-V聯合體成分的交互作用而出現的。
在血管疾病出現時，比如動脈硬化斑破裂，或者由血管成形術、動脈狹窄、心肺替代管手術、局部缺血損傷或狹窄引起的機械損傷，發生時，白血球或血小板會在損傷部位堆積並且由於彼此可作為另一層的底層使這種堆積成倍增長。白血球和血小板的這種堆積會產生多種因子，包括促細胞分裂原、細胞因子和趨化因子，這些因子促使血管疾病向著不理想的方向進一步發展。
包括來自於GPIα的v-WF粘合區域的用於治療的多肽已經被公開。其中之一的多肽基於這樣一個序列，該序列是包含兩個胺基酸取代物(G233V，M239V)的野生型人類的GPIα胺基酸序列。一個Ig融合蛋白包含290個細胞外胺基酸，受v-WF粘合作用主導的這種變異體能夠抑制冠狀動脈血栓。
發明簡述本發明提供了一種糖蛋白IB-α高級變體多肽，可用於作為血管疾病的治療藥物。在不同的實施方案中，這種變體至少表現出一種下述一種性質低聚合性、強穩定性以及對凝血酶的弱束縛作用。這種變體的作用之一是作為融合蛋白用以治療與血管炎症、血栓、動脈硬化以及血管成形術後的再狹窄相關的血管症狀。
一方面，相對於，具有人類自然的GPIα胺基酸序列(序列代碼1)的多肽，或者相對上述序列包含了兩個胺基酸取代物G233V和M239V的名為GPIb2V的多肽，這兩者與α凝血酶的粘附而言；本發明的多肽與α凝血酶的粘附具有較低的免疫親合力。當多肽與α凝血酶的粘附具有較低的免疫親合力時，更多的凝血酶可用於血栓形成過程，在某一過程中可減少不希望的流血。顯示出可以減少凝血酶粘附作用的多肽的例子，是那些包括一個、兩個或者三個胺基酸取代物Y276F、Y278F、Y279V的代碼為1和2序列，或者其保守變體。
在一些實施方案中，相對於包含代碼為1和2的胺基酸序列的多肽的聚合性來說，本發明的多肽的聚合性低。在某些例子中，細胞中本多肽合成過程中也發現具有低聚合性。一個這方面的例子是，包含了C65S胺基酸取代物的多肽或其保守變體，相對於代碼為1和2的胺基酸序列來說，具有低聚合性。
在一些實施方案中，本發明的多肽相對於包含代碼為1和2的胺基酸序列的多肽，對蛋白質水解具有較強的耐性。一個這方面的例子是包含了K237V的胺基酸取代物的多肽或其保守變體，相對於代碼為1和2的胺基酸序列，對蛋白質水解具有較強的耐性。
本發明的多肽的合適例子是那些，相對於代碼為1和2的胺基酸序列，包含下述胺基酸序列取代物Y276F，Y276FK237V，Y276FC65S，Y276FY278FY279F，Y276FY278FY279FK237V和Y276FY278FY279FC65S。
本發明的多肽可以作為融合蛋白。例如，糖蛋白Ibα融合蛋白可以包括一條包含至少糖蛋白IB-α多肽變體一部分的多肽，與第二條肽鏈連接。在一些例子中，這個第二條肽鏈形成多聚體，比如二聚體。在另一些例子中，這個第二條肽鏈至少包括免疫球蛋白多肽鏈的一部分。
本發明同樣提供了糖蛋白-Ibα變體多肽的核酸編碼，及載體、細胞和用糖蛋白-Ibα變體多肽編碼核酸表達這種糖蛋白-Ibα變體多肽的方法。本發明同樣進一步提供了，糖蛋白-Ibα變體融合多肽的的核酸編碼，以及這種編碼的核酸的載體，以及一種含有這種載體或核酸的細胞。
本發明也提供了一種通過連接與糖蛋白Ibα融合多肽的而抑制白血球粘合到生物組織的方法。大量的白血球被連接足以抑制白血球和生物組織的粘附。
在另一方面，本發明提供了一種治療與血小板活化有關的血管疾病的途徑。這個途徑包括在某一過程中使用有效劑量的糖蛋白Ibα融合多肽。
本發明還包括了，用於治療的，包括糖蛋白Ibα變體多肽或糖蛋白Ibα變體融合多肽的化合物。
除非另有說明，本文中所有的科學和技術術語的含義均為本發明所屬領域的通用含義。儘管多種方法，和近似或等同於本文中的原料，可以用於實踐或檢驗本發明，下面將會描述合適的實施方式。本申請中對所有出版物、專利申請文件、專利，和其他參考文獻，都作為整體來參考。除非有衝突，其所用的描述包括定義，有約束力。此外，本申請中所提到的材料、方法和實施例僅是用來說明，而不用來限制。
本發明的其他特點和優點，將在以下的詳細說明和權利要求中，顯現出來。


圖1表示GPIbα嵌合體對瑞斯託菌素引起的人體血小板凝集作用的抑制作用。Y軸代表野生型GPIbα(「正常」)和GPIbα-IgWT、GPIbα-290/2V-Ig，GPIbα-290/2V/FFF-Ig的嵌合體的光透過率。
圖2表示GPIbα嵌合體，在冠狀動脈血栓的犬牙Folts』模型下的，抗血栓形成的效能。(Y軸LCX blood)。圖3表示在由PFA-100評估的冠狀動脈血栓犬牙模型下，GPIbα-290/2V-Ig和GPIbα-290/2V/FFF-Ig對血小板功能的抑制作用。
本發明詳細描述根據本發明，糖蛋白Ibα衍生的多肽具有對α凝血酶的低粘附性、低聚合性，和/或對蛋白質水解的高抵抗力，可以作為治療製劑用於多種情況，可以抑制由活性血小板細胞與血管細胞上的血管性血友病因子的粘附。在一些情況中，本多肽可以用作融合多肽。
本發明的蛋白質變體具有低凝血酶粘合性，可減少流血。凝血酶和血小板GPIbα受體的粘附是血液凝結所必須的。凝血酶與治療性的可溶解GPIb的粘附，由於將凝血酶與血小板GPIbα受體隔離開來減少了凝血酶誘導的血小板凝集，增加了有機體內的出血。本發明的蛋白質變體顯示出了對凝血酶的低親合力，這就使得更多的凝血酶可參與與血小板GPIbα受體間的交互作用，從而加強了血液凝結。
合適的這樣的多肽包括這樣的胺基酸序列，相對於下述的，包含65-279個胺基酸的，代碼1的原生GPIbα蛋白序列和代碼2的胺基酸序列所代表的GPIb2V變體來說，在其間具有1到15個胺基酸被取代、缺失或插入。在一個或多個例子中，這種多肽表現出下面的一種或多種活性(i)相對於包含代碼為1和2的人體的胺基酸序列的多肽來說，對α凝血酶具有較低的粘附性；(ii)相對於包含代碼為1和2的人體的胺基酸序列的多肽來說，具有低聚合性；或(iii)相對於包含代碼為1和2的人體的胺基酸序列的多肽來說，具有較強的抗蛋白質水解的性能。
由於不希望圍於理論，這些性質被認為是基於，包含GPIb2V變體序列(序列代碼2)的多肽在目標區域被取代的結果。在65位點(也就是，C65S)的半胱氨酸被取代為絲氨酸殘基，抑制了GPIbα分子的聚合作用，尤其是在重組體產生的過程中。在276、278和279位點發現的酪氨酸殘基往往被翻譯並修飾為硫化酪氨酸，這樣產生了與α凝血酶之間的陽離子靜電交互作用。通過將他們轉化為苯丙氨酸，有選擇的排除這些酪氨酸殘基(即，Y276F、Y278F和Y279F取代物)降低了與α凝血酶的粘合性(Marchese et al.，J.Biol Chem.2709571-78)，並且仍能夠保持與vWF的期望的粘附性。在這個位點上的賴氨酸被纈氨酸取代能夠阻止重組體產生過程中的水解。
原生人體的糖蛋白Ibα鏈的290胺基酸序列片斷如下HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR(SEQ ID NO1)GPIb2V變體的胺基酸序列如下面代碼2所述。這種變體在
發明者格雷·肖, 黛安妮·S·薩科, 雷文德裡·庫瑪, 徐瑾 申請人:韋思公司