一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產方法
2023-05-11 10:38:41
專利名稱：一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產方法
技術領域：
本發明屬於生物製品領域，應用於森林腦炎病毒抗血清的生產。
背景技術：
森林腦炎又稱蜱傳腦炎(tick-borne encephalitis, TBE)是由森林腦炎病毒 (tick-borneencephalitis virus, TBEV)引起的一種流行於北溫帶的、以侵襲中樞神經系統為主的急性病毒性傳染病。世界範圍內受森林腦炎病毒侵襲的國家除我國外，主要還包括德國、奧地利、匈牙利、俄羅斯及日本等近30個國家。在我國，森林腦炎主要存在三大疫區、六個自然疫源地，主要分布於我國的大、小興安嶺地區和長白山地區，在同緯度的新疆部分地區亦有分布。根據系統進化及分布地域的不同，森林腦炎病毒可以被分為三個亞型歐洲亞型(European subtype)、遠東亞型(Far Eastern subtype)及西伯利亞亞型 (Siberiasubtype)。森林腦炎病毒的三個亞型在傳播媒介、致病性強弱、致死率高低以及預後等方面表現不盡相同。其中，歐洲亞型致病性相對較低，致死率約0 3. 9%，預後良好， 幾乎無嚴重的後遺症發生。遠東亞型及西伯利亞亞型致病性相對較強，致死率也較高，約為 20 30%，且預後不好，在未死亡病例中約有25 37%的患者會留下麻痺型後遺症，從而喪失勞動能力，給社會及家庭造成嚴重的負擔。我國流行株為遠東亞型。森林腦炎病毒在感染後採用血清療法可以防止發病或減輕症狀。血清療法即發病 3天內患者可用恢復期患者或林區居住多年者的血清20 40ml肌注，或椎管內注射5 IOml。由於現在沒有已經上市的抗森林腦炎血清和免疫球蛋白，血清療法使用的是人血清， 這存在感染HIV、HCV、HBV等血源性病毒的巨大風險，而且來源非常有限，不能大範圍使用。 森林腦炎目前尚無有效的治療手段，抗森林腦炎馬血清可作為暴露後預防和發病早期治療的特效藥。目前無上市的抗森林腦炎病毒馬血清。馬血清蛋白對人體來說屬異源蛋白，對人體有很強的致敏性。馬血清製品，常引起下列兩類過敏反應(1)過敏性休克，在注射過程或注射後數分鐘到Ih內患者突感胸悶、氣急、脈搏加速、血壓下降，發冷直到昏迷，重者搶救不及時，可迅速死亡。此系I型過敏反應， 即人體曾注射或接觸過馬血清，致敏而產生IgE細胞抗體，固定在嗜鹼粒細胞和肥大細胞表面，再注射馬血清製品時，抗原抗體相互作用，致上述細胞破裂釋放大量生物活性物質如白三烯、組織胺等，作用於機體引起過敏。(2)血清病(serum sickness)，即注射馬血清製品後1 2周出現蕁麻疹、發熱、淋巴結腫大、臉部紅腫、偶有蛋白尿、嘔吐及關節疼痛等，此系III型過敏反應，即一次性接受較大劑量馬血清製品注射，機體產生的相應IgG與體內殘留的過敏原馬血清結合，形成可溶性循環免疫複合物。沉積於毛細血管內壁，激活機體，引起局部炎症所致。正常未經免疫的馬匹體內由於自身免疫作用會有針對不同病毒的中和抗體IgG， 但含量均很低，經森林腦炎病毒抗原免疫的馬匹，在馬匹的血清內會產生大量能夠中和抗森林腦炎病毒的中和抗體IgG，IgG由F(ab)2段和Fc段組成，其中起到中和病毒作用的成份為F(ab)2段，而Fc段會引起過敏反應，而如何在製備抗森林腦炎馬血清的過程中、獲得高純度的針對森林腦炎病毒的特異性F(ab)2段又是十分困難的。
發明內容
本發明提供一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產方法，以解決馬血清製品常引起過敏反應的問題。本發明應用生物反應器技術培養森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」，能夠獲得高滴度的病毒收穫液，經滅活純化，添加適合的佐劑製備免疫抗原；選擇最佳的免疫程序和採血程序，獲得高特異性、高效價的免疫血清；應用以柱層析技術為核心的抗血清純化工藝，提高抗血清純度，增加F (ab' )2含量。本發明採取的技術方案是，包括下列步驟(1)、森林腦炎毒株採用森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」；(2)、採用生物反應器培養Vero細胞，感染病毒，上罐細胞密度為1 X 106/ml，加入病毒量為1 100 200，製備病毒原液，採用β-丙內酯滅活病毒，製備抗原，另外加入弗氏不完全佐劑；(3)、馬匹免疫程序及採血程序一個免疫採血周期為兩個月，免疫程序為0天、3 天、10天、17天、35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；採血從第15天開始靜脈採血，每隔 7天採一次，每次3000ml ；0)、血漿製備；(5)、消化、滅活；(6)、純化採用鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯合純化。本發明步驟(6)純化中鹽析法如下第一次沉澱，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用1 2N鹽酸調節 pH5. 0 5. 4，加溫至56 58°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內降溫至40 45°C，過濾，取清液；第二次沉澱上述清液用1 2N氫氧化鈉調節pH至7. 0 7. 4，每IOOml加硫酸銨20g， 攪拌均勻後靜止30分鐘，過濾，取沉澱；明礬沉澱，上述沉澱用水稀釋至蛋白含量為2g/L， 每IOOml加入10%明礬液6 10ml，用1 2N氫氧化鈉調節pH至7. 7 7. 9，用0. 45um 的膜進行澄清過濾，取清液。本發明步驟(6)純化中離子交換劑吸附法如下①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩衝液進行平衡；②將用0. 45um的膜進行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用PH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩衝液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質被吸附在層析介質上，F(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體後，用20%乙醇洗柱，使介質浸泡其中保存。本發明特點在於一是製備高純度的免疫抗原免疫抗原純度越高，產生的特異性中和抗體水平就越高，雜蛋白就越少；二是免疫原的免疫程序和採血程序免疫程序的設計是馬匹體內能夠產生高水平中和抗體的關鍵，本發明的採血程序能夠獲得高水平的中和抗體；三是馬血清的純化使所採集的馬血清中獲得高純度的F(ab)2段，從而儘量降低過敏反應發生率。
本發明的優點所用森林腦炎病毒毒株為我國獨有的遠東亞型，本發明所製備的抗森林腦炎病毒(遠東亞型)馬血清屬國際首創，填補了我國在該領域的空白，處於國際領先水平。應用本發明方法製備的抗森林腦炎病毒馬血清成品所含致敏源極少，經豚鼠致敏性試驗證明應用本發明方法製備的抗森林腦炎病毒馬血清成品幾乎無過敏反應發生，樣品組與生理鹽水陰性對照組無顯著性差異。表1應用本發明方法製備10批抗森林腦炎馬血清成品的結果統計表
批次總蛋白質 (g/L)IgG %F(ab)2%效價(IU/ml)201105017.424.3294.54240.3201105028.133.1595.36234.56201105037.943.6494.45247.2201106046.532.5396.32216.96201106058.631.7897.42225.71201106067.364.7693.56237.06201106077.923.5295.37244.2201107088.043.1795.80236.96201107098.974.6594.02245.71201107107.363.1495.6227. 8結果顯示應用本發明的鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯合純化技術製備的抗森林腦炎馬血清，F (油)2純度高達90%以上；效價大於200IU/ml ；雜蛋白含量低，總蛋白質含量小於10g/L，IgG含量小於5% ；會大大降低過敏反應的發生率。
具體實施例方式實施例1細胞非洲綠猴腎(Vero)細胞；森林腦炎毒株森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」；(I)Vero細胞傳代，罐培養，上罐細胞密度為1 X 106/ml，細胞密度達到lX107ml 時，按感染比例1 100加入森腦病毒，連續灌流收穫病毒液，免疫螢光法檢測病毒毒力；(2)抗原製備將病毒收穫液用30萬單位濾膜超濾濃縮20倍，按1 4000加入 β -丙內酯，於4°C滅活過夜後，37°C水解2個小時，收穫樣品過4FF柱純化，收第一個吸收峰樣品，按1 1加入弗氏不完全佐劑；(3)免疫和採血一個免疫採血周期為兩個月，免疫程序為0天、3天、10天、17天、 35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；採血從第15天開始靜脈採血，每隔7天採一次，每次 3000ml ；(4)血漿製備離心4000rpm，將紅細胞和血漿分離，將分離好的血漿置4°C 2天。(5)消化、滅活將免疫血漿用蒸餾水稀釋2倍，用IN鹽酸調節pH至3.0，加入胃蛋白酶lmg/ml，及甲苯0.2% (ml/ml)，30°C下消化1. 5小時，終止後，60°C IOh加溫處理滅活可能汙染的外源因子；(6)純化鹽析第一次沉澱，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用IN鹽酸調節PH5. 0，加溫至56°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內降溫至40°C，過濾，取清液；第二次沉澱 上述清液用IN氫氧化鈉調節pH至7. 0，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻後靜止30分鐘， 過濾，取沉澱；明礬沉澱，上述沉澱用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml加入10%明礬液 6ml，用1 2N氫氧化鈉調節pH至7. 7，用0. 45um的膜進行澄清過濾，取清液；疏水層析用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝膠裝柱，用高鹽PBS平衡上樣， 遞減的鹽濃度對樣品進行洗脫；離子交換劑吸附純化①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩衝液進行平衡；②將用0. 45um的膜進行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用PH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩衝液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質被吸附在層析介質上，F(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體後，用20%乙醇洗柱，使介質浸泡其中保存；(9)濃縮、澄清及除菌過濾將穿透液採用Amicoh公司的Centricon-3-30，截留分子量30kDa的蛋白質超濾濃縮，調整蛋白含量至170g/L，調節pH至6. 0 7. 0，用0. 22um濾膜除菌過濾。(10)分裝、包裝、成品入庫。實施例2細胞非洲綠猴腎(Vero)細胞；森林腦炎毒株森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」；(I)Vero細胞傳代，罐培養，上罐細胞密度為1 X 106/ml，細胞密度達到lX107ml 時，按感染比例1 150加入森腦病毒，連續灌流收穫病毒液，免疫螢光法檢測病毒毒力；(2)抗原製備將病毒收穫液用30萬單位濾膜超濾濃縮20倍，按1 4000加入 β -丙內酯，於4°C滅活過夜後，37°C水解2個小時，收穫樣品過4FF柱純化，收第一個吸收峰樣品，按1 1加入弗氏不完全佐劑；(3)免疫和採血一個免疫採血周期為兩個月，免疫程序為0天、3天、10天、17天、 35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；採血從第15天開始靜脈採血，每隔7天採一次，每次 3000ml ；(4)血漿製備離心4000rpm，將紅細胞和血漿分離，將分離好的血漿置4°C 2天；(5)消化、滅活將免疫血漿用蒸餾水稀釋2 4倍，用1 2N鹽酸調節pH至3. 3， 加入胃蛋白酶lmg/ml，及甲苯0. 2% (ml/ml)，30°C下消化1. 5小時，終止後，60°C IOh加溫處理滅活可能汙染的外源因子。(6)純化鹽析第一次沉澱，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用1. 5N鹽酸調節pH5. 2，加溫至57°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內降溫至42°C，過濾，取清液；第二次沉澱上述清液用1. 5N氫氧化鈉調節pH至7. 4，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻後靜止30分鐘，過濾，取沉澱；明礬沉澱，上述沉澱用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml加入10%明礬液8ml，用1. 5N氫氧化鈉調節pH至7. 8，用0. 45um的膜進行澄清過濾，取清液；疏水層析用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝膠裝柱，用高鹽PBS平衡上樣， 遞減的鹽濃度對樣品進行洗脫；離子交換劑吸附純化①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩衝液進行平衡；②將用0. 45um的膜進行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩衝液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質被吸附在層析介質上，F(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體後，用20%乙醇洗柱，使介質浸泡其中保存；(9)濃縮、澄清及除菌過濾將穿透液採用Amicoh公司的Centricon-3-30，截留分子量30kDa的蛋白質超濾濃縮，調整蛋白含量至17(^/1，調節？!1至6.5，用0. 22um濾膜除菌過濾。(10)分裝、包裝、成品入庫。實施例3細胞非洲綠猴腎(Vero)細胞；森林腦炎毒株森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」；(I)Vero細胞傳代，罐培養，上罐細胞密度為1 X 106/ml，細胞密度達到lX107ml 時，按感染比例1 200加入森腦病毒，連續灌流收穫病毒液，免疫螢光法檢測病毒毒力；(2)抗原製備將病毒收穫液用30萬單位濾膜超濾濃縮20倍，按1 4000加入 β -丙內酯，於4°C滅活過夜後，37°C水解2個小時，收穫樣品過4FF柱純化，收第一個吸收峰樣品，按1 1加入弗氏不完全佐劑；(3)免疫和採血一個免疫採血周期為兩個月，免疫程序為0天、3天、10天、17天、 35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；採血從第15天開始靜脈採血，每隔7天採一次，每次 3000ml ；(4)血漿製備離心4000rpm，將紅細胞和血漿分離，將分離好的血漿置4°C 2天；(5)消化、滅活將免疫血漿用蒸餾水稀釋4倍，用2N鹽酸調節pH至3. 6，加入胃蛋白酶lmg/ml，及甲苯0.2% (ml/ml)，30°C下消化1. 5小時，終止後，60°C IOh加溫處理滅活可能汙染的外源因子；(6)純化鹽析第一次沉澱，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用2N鹽酸調節PH5. 4，加溫至58°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內降溫至45°C，過濾，取清液；第二次沉澱 上述清液用2N氫氧化鈉調節pH至7. 4，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻後靜止30分鐘， 過濾，取沉澱；明礬沉澱，上述沉澱用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml加入10%明礬液 10ml，用2N氫氧化鈉調節pH至7. 9，用0. 45um的膜進行澄清過濾，取清液；疏水層析用Butyl Sepharose Fast Flow疏水凝膠裝柱，用高鹽PBS平衡上樣， 遞減的鹽濃度對樣品進行洗脫；離子交換劑吸附純化
①用DEAE Sepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0， 0. 15MNaCl, IOmM磷酸鹽緩衝液進行平衡；②將用0. 45um的膜進行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用pH 值為7.0，0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩衝液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質被吸附在層析介質上，F(ab' )2流穿；③用2M NaCl清洗柱體後，用20%乙醇洗柱，使介質浸泡其中保存；(9)濃縮、澄清及除菌過濾將穿透液採用Amicoh公司的Centricon-3-30，截留分子量30kDa的蛋白質超濾濃縮，調整蛋白含量至170g/L，調節pH至6. 0 7. 0，用0. 22um濾膜除菌過濾。(10)分裝、包裝、成品入庫。試驗例1免疫程序和採血程序的確定(1)目的通過小鼠試驗，應用免疫螢光法測定抗森林腦炎病毒中和抗體，從而確定免疫程序和採血日期。(2)原理本試驗的試驗動物為小白鼠，邊免疫邊採血測定小鼠體內抗森林腦炎病毒中和抗體的產生水平，找到恰當的時間點進行加強免疫，摸索最佳免疫程序，以及採血時間。(3)動物18g 22g小白鼠，30隻。(4)儀器設備螢光顯微鏡、超淨工作檯、離心機、CO2培養箱、4°C冰箱等。(5)材料96孔細胞培養板、抗森林腦炎病毒血清參考品、Vero細胞、抗森林腦炎病毒螢光抗體(自製)、玻璃毛細管、2ml注射器、森林腦炎抗原液(自製)、一次性乳膠手套等。(6)方法第0天免疫，小鼠頸部皮下免疫0. 2ml/只，第3天加強免疫一針；第二天開始採血用於中和抗體檢測，持續採血，分離血清測定中和抗體。如下表2
權利要求
1.一種抗森林腦炎病毒馬血清的生產方法，其特徵在於包括下列步驟(1 )、森林腦炎毒株採用森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」；(2)、採用生物反應器培養Vero細胞，感染病毒，上罐細胞密度為1X 106/ml，加入病毒量為1 :10(Γ200，製備病毒原液，採用β-丙內酯滅活病毒，製備抗原，另外加入弗氏不完全佐劑；(3)、馬匹免疫程序及採血程序一個免疫採血周期為兩個月，免疫程序為O天、3天、10 天、17天、35天，每次免疫為頸部皮下2. Oml/匹；採血從第15天開始靜脈採血，每隔7天採一次，每次3000ml ；(4)、血漿製備；(5)、消化、滅活；(6)、純化採用鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯合純化。
2.根據權利要求1所述的抗森林腦炎病毒馬血清的生產方法，其特徵在於步驟(6)純化中鹽析法如下第一次沉澱，將上述處理的每IOOml消化液中加入硫酸銨15g，用廣2N鹽酸調節 ρΗ5· 0 5· 4，加溫至56 58°C，30分鐘；加溫完畢，30秒內降溫至4(T45°C，過濾，取清液；第二次沉澱上述清液用廣2N氫氧化鈉調節pH至7. (Γ7. 4，每IOOml加硫酸銨20g，攪拌均勻後靜止30分鐘，過濾，取沉澱；明礬沉澱，上述沉澱用水稀釋至蛋白含量為2g/L，每IOOml 加入10%明礬液6 10ml，用廣2N氫氧化鈉調節pH至7. Π. 9，用0. 45um的膜進行澄清過濾，取清液。
3.根據權利要求1所述的抗森林腦炎病毒馬血清的生產方法，其特徵在於步驟(6)純化中離子交換劑吸附法如下①用DEAESepharose Fast Flow等陰離子交換劑裝柱，用pH值為7. 0，0. 15M NaCl, IOmM磷酸鹽緩衝液進行平衡；②將用0.45um的膜進行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用PH值為 7. 0,0. 15M NaCl，IOmM磷酸鹽緩衝液洗柱，流速為;3ml/min，收集穿透液，酸性雜質被吸附在層析介質上，F (ab』)2流穿；③用2MNaCl清洗柱體後，用20%乙醇洗柱，使介質浸泡其中保存。
全文摘要
本發明提供了一種抗森林腦炎病毒馬血清的製備方法，屬於生物製品領域。應用森林腦炎病毒遠東亞型「森張株」；高純度的免疫抗原的製備，免疫採血周期為兩個月，免疫程序為0天、3天、10天、17天、35天，採用鹽析法、疏水層析法和離子交換法聯合純化技術，可獲得高純度的F(ab)2段。生產出的抗血清具有高品質，成品效價不低於200IU/ml，總蛋白質含量不高於10g/L，F(ab')2含量不低於90%，IgG含量不高於5%，且經豚鼠致敏性試驗證實幾乎不引起豚鼠的過敏反應。
文檔編號A61K35/16GK102335198SQ20111030944
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月13日 優先權日2011年10月13日
發明者丁麗麗, 井偉東, 劉巖, 姜文波, 崔文廣, 李宇輝, 楊屹, 苑志剛, 苗麗, 蔡月紅, 郭秀俠 申請人:長春生物製品研究所有限責任公司