從的製作方法

2023-05-03 06:41:16

專利名稱：從的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種化學物質的分離方法，特別涉及一種從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法。
背景技術：
同位素標記15N-L-丙氨酸是一種具有特殊用途的胺基酸，應用於醫學藥理、生化代謝研究及儀器分析等眾多領域，遠比普通的丙氨酸具有更高的價值。近年來，隨著15N-胺基酸國際市場的開拓，15N-L-丙氨酸的市場需求也日益增大。在其研發和生產過程中(包括酶轉化法生產和發酵法生產)，一方面，15N-L-丙氨酸一次提取後遺留下大量的數種15N-胺基酸(雜酸)與15N-L-丙氨酸(目的胺基酸)共存的分離母液；另一方面，由於研究條件的改變和生產條件的波動，不可避免地會產生大量的數種15N-胺基酸與15N-L-丙氨酸共存的反應混和液。在這以上兩種混和液中，目的胺基酸與雜酸間的含量相差均不大，採用現有方法難於進一步分離。由於15N生產原料及15N-胺基酸均價值不菲，為提高15N利用率，降低15N-胺基酸研發及生產成本，必須對胺基酸混合液中15N-L-丙氨酸進行分離提純。
目前，國內外一般採用強酸性陽離子交換樹脂從反應液中直接提取15N-L-丙氨酸，如Zvi E.Kahana的研究(Analytical Biochemistry 126，389-393，1982)和中國專利申請CN03141991.7的技術方案。但這種方法僅在酶催化15N-L-天冬氨酸反應過程中轉化率高的情況下或在15N-L-丙氨酸的一次提取中適用。對於下列情況①轉化率低，有較多底物15N-L-天冬氨酸殘留的情況；②發酵法生產15N-L-丙氨酸過程中，由於菌種代謝過程的複雜性，有部分其它15N-胺基酸同時積累的情況；③發酵培養基中的有機氮源被利用不完全而分解引人其它普通胺基酸的情況；④15N-L-丙氨酸一次提取後餘下含雜酸母液的二次提取的情況。上述情況利用現有方法均不能得到純的15N-L-丙氨酸以及回收其他15N-胺基酸。而且目前國內外也無有關15N-L-丙氨酸二次提取的報導。

發明內容
本發明的目的，在於提供一種從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法。該方法可從含有不同的非目的胺基酸的混和液中分離提取15N-L-丙氨酸，同時得到其他15N-胺基酸。
為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案一種從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，所述的15N-胺基酸混和液包括酶法生產15N-L-丙氨酸過程中的酶反應液和發酵法生產15N-L-丙氨酸過程中的發酵液，包括以下主要步驟a、菌體及金屬離子的去除將15N-胺基酸混和液用草酸處理，將其中的菌體及金屬離子沉澱分離去除；b、15N-L-丙氨酸的分離根據15N-胺基酸混和液中的胺基酸種類和含量的不同，分別採用不同的離子交換樹脂，對步驟a所得15N-胺基酸混和液進行單步或多步吸附洗脫，分離出15N-L-丙氨酸；c、15N-L-丙氨酸的精製將步驟b所得15N-L-丙氨酸溶液去NH4+、脫色、濃縮、結晶、分離、乾燥後精製出15N-L-丙氨酸。
所述的步驟b中，對於轉化率較低的酶反應液或轉化率較高的酶反應液經常規方法一次提取後的母液，其溶液中的15N-L-天冬氨酸含量＞1％，調節pH為9-12，採用鹼性陰離子樹脂進行吸附，用去離子水或弱酸性溶液洗脫，分部收集15N-L-丙氨酸和15N-L-天冬氨酸，分離出15N-L-丙氨酸。
所述的步驟b中，當酶反應液中含有纈氨酸、賴氨酸中的一種或兩種時，或者發酵液中含有15N-L-纈氨酸、15N-L-苯丙氨酸、15N-L-賴氨酸中的一種或多種時，採用強酸性或弱酸性陽離子交換樹脂，通過多步吸附和洗脫，分離出15N-L-丙氨酸。
所述的多步吸附和洗脫包括以下步驟第一步、先將酶反應液或發酵液調節pH為1.0-5.0，採用NH4+-強酸性陽離子交換樹脂吸附，其中的賴氨酸或15N-L-賴氨酸被吸附，在流出液中首先得到纈氨酸和15N-L-丙氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-纈氨酸的混和液，接著得到15N-L-苯丙氨酸，最後在弱鹼性洗脫液中得到(15N-)L-賴氨酸，分部收集；第二步、將第一步所得15N-L-丙氨酸和纈氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-纈氨酸的混和液調節pH為1.0-5.0，採用強酸性或弱酸性陽離子交換樹脂吸附，用強酸弱鹼性鹽溶液洗脫，在洗脫液中首先得到15N-L-丙氨酸，其後得到(15N-)L-纈氨酸，分部收集，分離出15N-L-丙氨酸。
所述的分離出的15N-L-丙氨酸再採用酸性陽離子交換樹脂吸附，用去離子水洗柱，至流出液中檢驗不出酸根離子，再用弱鹼性溶液洗脫，得到不含酸根離子的純15N-L-丙氨酸。
步驟c中所述的脫色採用活性炭脫色；濃縮採用加熱減壓蒸發濃縮，加熱溫度為40-70℃；結晶在無水乙醇介質中結晶；乾燥採用真空加熱乾燥，加熱溫度為40-80℃。
所述的弱酸性溶液為0.025-0.5mol/L的鹽酸或乙酸。
所述的弱鹼性溶液為0.025-0.5mol/L的氨水，所述的強酸弱鹼性鹽溶液為0.025-0.5mol/L的氯化銨溶液。
本發明的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，有效地解決了酶法和發酵法生產15N-L-丙氨酸過程中因雜酸多導致15N-L-丙氨酸難於分離的問題，提高了15N-L-丙氨酸的產量並增大了15N原料的利用率。實現了從酶反應液及發酵液中分別分離出15N-L-天冬氨酸、15N-L-纈氨酸、15N-L-苯丙氨酸以及15N-L-賴氨酸，而得到15N-L-丙氨酸。
本發明工藝路線簡單，操作方便，投入少，提高了15N-L-丙氨酸的生產得率，避免了研發和生產過程中15N-L-丙氨酸及其它15N胺基酸的損失，最大限度地節省了15N原料。產品質量達到藥品標準。適合工業應用。
具體實施例方式
實施例1.
原料為酶法生產15N-L-丙氨酸過程中的酶反應液，其主要成分包括15N-L-丙氨酸52g/L、15N-L-天冬氨酸12g/L和少量KH2PO4、MgSO4·7H2O，溶液的pH＝7-9，總體積為50mL。
首先向酶反應液中在不斷攪拌的同時加入草酸，一邊溶解一邊加入，直至混和液的pH值達到3.0，然後置於冷凍離心機在5000rpm下離心30min，除去菌體及金屬離子。收集上清液，沉澱用相當於其體積的去離子水洗滌3遍，將洗滌液和上清液合併後備用。
接著將上述混合液用10mol/L的NaOH溶液調節pH＝9.0，以80mL/h的流速通入強鹼性陰離子交換樹脂201×4柱(717樹脂，3.4×64cm)吸附，用去離子水以50mL/h的流速洗柱至流出液清澈無色且pH＝7。再用0.025mol/L的HCl溶液以50mL/h的流速洗脫，在上樣吸附流出液與去離子水洗脫液以及HCl洗脫流出液體積為1-1800mL段收集到15N-L-丙氨酸，2700-4200mL段收集到15N-L-天冬氨酸，從而將二者完全分離。得到的15N-L-丙氨酸和15N-L-天冬氨酸分別用6mol/L的HCl調節pH＝2.5，再經一次001×7樹脂(732樹脂，2.5×55cm)以50mL/h的流速吸附，用去離子水以30mL/h的流速洗柱至流出液加入AgI不出現白色沉澱，流出液清澈無色且pH＝7時，換2mol/L的氨水洗脫，得到不含陰離子的純15N-L-丙氨酸或15N-L-天冬氨酸。
將15N-L-丙氨酸純組分合併，先蒸發至固體並用水反覆溶解蒸發至冷凝液pH＝7，再加去離子水稀釋至1.5％的濃度(重量比)，加熱至80℃時加入0.2g的活性炭，並在攪拌下維持80-90℃加熱30min後，多次反覆抽濾混和液，直至溶液清澈明亮。再將溶液於60℃下減壓蒸發濃縮，至蒸發液即將飽和時再分批、少量、多次加入溫度為-10℃的無水乙醇，且邊加入邊攪拌，直至白色15N-L-丙氨酸大量析出且不再增多時為止。將此結晶母液於-20℃下放置過夜，然後抽濾分離出15N-L-丙氨酸結晶，將其於60℃真空乾燥箱內放置3h.，得到純淨的白色粉末狀15N-L-丙氨酸2.18g，提取收率為83.6％，15N豐度為9.88％，純度為98.24。15N-L-天冬氨酸也用類似方法精製，得白色粉末狀產品0.48g，提取收率為80.0％，15N豐度為10.17％，純度為98.34％。
實施例2原料同實施例1。
首先將酶反應液按實施例1的步驟除去菌體及金屬離子後，用10mol/L的NaOH溶液調節pH＝12.0，以80mL/h的流速通入弱鹼性陰離子交換樹脂331柱(3.4×64cm)上樣吸附，用去離子水以50mL/h的流速洗柱至流出液清澈無色且pH＝7。再用0.05mol/L的HCl溶液以50mL/h的流速洗脫，在上樣吸附的流出液與去離子水洗脫液中即得到15N-L-丙氨酸，在HCl洗脫液體積為2500-6100mL段收集到15N-L-天冬氨酸，從而將二者完全分離。其後，用與實施例1相同的方法除去陰離子後精製。得到15N-L-丙氨酸產品2.25g，收率為86.4％，15N豐度為98.31％，純度為98.26％；15N-L-天冬氨酸產品0.52g，收率為86.7％，15N豐度為98.8％，純度為98.33％。
實施例3.
原料為酶法生產15N-L-丙氨酸過程中的酶反應液，其主要成分包括15N-L-丙氨酸55g/L、纈氨酸3.4g/L、賴氨酸2.8g/L、15N-L-天冬氨酸4.3g/L和少量KH2PO4、MgSO4·7H2O，總體積為50mL。
將001×7(732)樹脂裝填於2.5×55cm的玻璃柱中，以每小時50mL的流速通入0.5mol/L的氨水，待流出液pH＝10時結束洗滌，靜止4h後，水洗至pH＝7時完成轉型，得到NH4+型001×7樹脂柱備用。
首先向酶反應液中在不斷攪拌的同時加入草酸，一邊溶解一邊加入，直至溶液的pH達到1.0，然後將其置於冷凍離心機中在5000rpm下離心30min，除去菌體及金屬離子。收集上清液，沉澱用相當於其體積的去離子水洗滌3遍，將洗滌液和上清液合併後備用。
然後將上述溶液用6mol/L的HCl調節至pH＝2.5，以22mL/h的流速通過NH4+型001×7樹脂柱，收集流出液，對流出液的紙層析測試顯示沒有賴氨酸斑點，有15N-L-丙氨酸、15N-L-天冬氨酸和纈氨酸斑點。說明賴氨酸被吸附，流出液中含有15N-L-丙氨酸、15N-L-天冬氨酸和纈氨酸。將這三種胺基酸流出液用6mol/L的HCl調節pH＝2.5，經一次001×7樹脂(2.5×55cm)以35mL/h的流速吸附，用去離子水以30mL/h的流速洗柱至流出液清澈無色且pH＝7時，採用0.05mol/L氯化銨溶液洗脫。在洗出液體積為1500-2200mL段收集到15N-L-天冬氨酸，8000-8600mL段收集到15N-L-丙氨酸，7500-7900mL段收集到纈氨酸，從而將三者完全分離。其後，將得到的15N-L-丙氨酸用6mol/L的HCl調pH＝2.5，再經一次001×7樹脂(2.5×55cm)以50mL/h的流速吸附，用去離子水以35mL/h的流速洗柱至流出液清澈無色且加入AgI沒有出現白色沉澱時，換2mol/L氨水洗脫，得到15N-L-丙氨酸純組分。用與實施例1相同的方法精製後得到15N-L-丙氨酸產品2.12g，提取收率為77.2％，豐度為98.31％，純度為98.29％。對15N-L-天冬氨酸純組分用同處理15N-L-丙氨酸相同的方法去氯離子、精製，得到15N-L-天冬氨酸產品0.68g，提取收率為78.8％，豐度為98.8％。
實施例4原料為發酵法生產15N-L-丙氨酸過程中的發酵液，主要成分包括15N-L-丙氨酸16.6g/L、15N-L-纈氨酸2.2g/L、15N-L-苯丙氨酸0.91g/L、15N-L-賴氨酸0.46g/L、葡萄糖和少量無機鹽，總體積為400mL。
將001×7(732)樹脂裝填於4.4×84cm的玻璃柱中，以每小時100mL的流速通入3mol/L的氨水，待流出液pH＝10時結束洗滌，靜止4h後，水洗至pH＝7時轉型為NH4+型001×7樹脂柱備用。
將上述發酵液在玻棒攪拌的同時加入草酸，一邊溶解一邊加入，直至混和液pH達到4.0，然後置於冷凍離心機中在5000rpm下離心30min，收集上清液，沉澱用1倍體積的去離子水洗滌3遍，將洗滌液和上清液合併後備用。
將上述混合液以類似實施例3的方式用6mol/L的HCl調節pH＝2.5，以120mL/h的流速通過NH4+型001×7樹脂柱，15N-L-賴氨酸被吸附，流出液中在220-2500mL段為15N-L-丙氨酸和15N-L-纈氨酸的混合液，在2700-3300mL段為純15N-L-苯丙氨酸溶液。將NH4+型001×7樹脂柱再用1.0mol/L氨水洗脫，洗脫液為純15N-L-賴氨酸溶液。其後，以類似實施例3的方式，分離15N-L-丙氨酸與15N-L-纈氨酸的混和液，用6mol/L的HCl調pH＝2.5，經一次001×7樹脂(3.4×64cm)以70mL/h的流速吸附，在洗脫液體積為4000-7200mL段得到15N-L-丙氨酸，7200-8100mL段得到15N-L-纈氨酸，從而將兩者完全分離。15N-L-丙氨酸用與實施例1相同的方法精製後得到產品4.88g，提取收率為73.5％，15N豐度為98.22％，純度為98.27％。15N-L-纈氨酸、15N-L-苯丙氨酸、15N-L-賴氨酸溶液分別用與實施例3相同的方法去氯離子、精製，結果表1所示。
表1

實施例5原料為酶法生產15N-L-丙氨酸過程中的酶反應液(轉化率99.60％)一次提取後的母液，主要成分包括15N-L-丙氨酸5.1g/L、l5N-L-天冬氨酸6.5g/L，總體積為200mL(為先後四次一次提取後母液的合併液)。將上述母液用10mol/L NaOH溶液調節pH＝10.0，以30mL/h的流速通入弱鹼性陰離子交換樹脂331柱(2.5×55cm)上樣吸附，用去離子水以30mL/h的流速洗柱至流出液清澈無色且pH＝7。再用0.05mol/L的HCl溶液以30mL/h的流速洗脫，在上樣吸附的流出液與去離子水洗脫液中即得到15N-L-丙氨酸，在HCl洗脫液體積為1700-4500mL段收集到15N-L-天冬氨酸，從而將二者完全分離。其後，用與實施例1相同的方法除去陰離子後精製。得到15N-L-丙氨酸0.84g，提取收率為82.7％，15N豐度為9.88％，純度為98.21％；得到15N-L-天冬氨酸1.10g，提取收率為84.5％，15N豐度為10.17％，純度為98.36％。
權利要求
1.一種從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，所述的15N-胺基酸混和液包括酶法生產15N-L-丙氨酸過程中的酶反應液和發酵法生產15N-L-丙氨酸過程中的發酵液，其特徵在於包括以下主要步驟a、菌體及金屬離子的去除將15N-胺基酸混和液用草酸處理，將其中的菌體及金屬離子沉澱分離去除；b、15N-L-丙氨酸的分離根據15N-胺基酸混和液中的胺基酸種類和含量的不同，分別採用不同的離子交換樹脂，對步驟a所得15N-胺基酸混和液進行單步或多步吸附洗脫，分離出15N-L-丙氨酸；c、15N-L-丙氨酸的精製將步驟b所得15N-L-丙氨酸溶液去NH4+、脫色、濃縮、結晶、分離、乾燥後精製出15N-L-丙氨酸。
2.根據權利要求1所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的步驟b中，對於轉化率較低的酶反應液或轉化率較高的酶反應液經常規方法一次提取後的母液，其溶液中的15N-L-天冬氨酸含量＞1％，調節pH為9-12，採用鹼性陰離子樹脂進行吸附，用去離子水或弱酸性溶液洗脫，分部收集15N-L-丙氨酸和15N-L-天冬氨酸，分離出15N-L-丙氨酸。
3.根據權利要求1所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的步驟b中，當酶反應液中含有纈氨酸、賴氨酸中的一種或兩種時，或者發酵液中含有15N-L-纈氨酸、15N-L-苯丙氨酸、15N-L-賴氨酸中的一種或多種時，採用強酸性或弱酸性陽離子交換樹脂，通過多步吸附和洗脫，分離出15N-L-丙氨酸。
4.根據權利要求3所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的多步吸附和洗脫包括以下步驟第一步、先將酶反應液或發酵液調節pH為1.0-5.0，採用NH4+-強酸性陽離子交換樹脂吸附，其中的賴氨酸或15N-L-賴氨酸被吸附，在流出液中首先得到纈氨酸和15N-L-丙氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-纈氨酸的混和液，接著得到15N-L-苯丙氨酸，最後在弱鹼性洗脫液中得到(15N-)L-賴氨酸，分部收集；第二步、將第一步所得15N-L-丙氨酸和纈氨酸或15N-L-丙氨酸和15N-L-纈氨酸的混和液調節pH為1.0-5.0，採用強酸性或弱酸性陽離子交換樹脂吸附，用強酸弱鹼性鹽溶液洗脫，在洗脫液中首先得到15N-L-丙氨酸，其後得到(15N-)L-纈氨酸，分部收集，分離出15N-L-丙氨酸。
5.根據權利要求2或3或4所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的分離出的15N-L-丙氨酸再採用酸性陽離子交換樹脂吸附，用去離子水洗柱，至流出液中檢驗不出酸根離子，再用弱鹼性溶液洗脫，得到不含酸根離子的純15N-L-丙氨酸。
6.根據權利要求1所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於步驟c中所述的脫色採用活性炭脫色；濃縮採用加熱減壓蒸發濃縮，加熱溫度為40-70℃；結晶在無水乙醇介質中結晶；乾燥採用真空加熱乾燥，加熱溫度為40-80℃。
7.根據權利要求2所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的弱酸性溶液為0.025-0.5mol/L的鹽酸或乙酸。
8.根據權利要求4所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的弱鹼性溶液為0.025-0.5mol/L的氨水，所述的強酸弱鹼性鹽溶液為0.025-0.5mol/L的氯化銨溶液。
9.根據權利要求5所述的從15N-胺基酸混合液中分離提純15N-L-丙氨酸的方法，其特徵在於所述的弱鹼性溶液為0.025-0.5mol/L的氨水。
全文摘要
本發明提供了一種從
文檔編號C07C227/00GK1781902SQ200410089079
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月3日 優先權日2004年12月3日
發明者周震, 侯靜華, 李良君, 杜曉寧, 宋明鳴 申請人:上海化工研究院