一種連續分離5』－核苷三磷酸的方法
2023-05-02 14:06:31 1
專利名稱：一種連續分離5』－核苷三磷酸的方法
技術領域：
本發明屬於生物製品加工領域，涉及一種連續分離5』-核苷三磷酸的方法。
背景技術：
關於核苷酸類物質的分離方法，半個世紀以前，人們就開始了探索過程，一種苯乙烯型強鹼性陰離子交換樹脂首次用於核苷酸的分離，並達到了較好的分離效果。接著人們又開發出了DEAE-葡聚糖凝膠、PEI-纖維素，甚至陽離子交換樹脂用於核苷酸混合物的分離。詹谷宇等(胞嘧啶核苷三磷酸生物合成研究，西北醫藥雜誌[J]，1997，12(2)，81-82)報導其利用離心，乙醇沉澱法首先得到CTP粗品，經732氫型陽離子交換柱和711氯型陰離子交換柱兩部純化後，收率沒有提及，但是根據該文獻可以看出相對較低，通過多步有機溶劑結晶，得到的CTP晶體的含量為93.4％。英國專利(No.14043/681968)中報導，在對UTP轉化液進行預處理後，首先通過氯型強酸性陽離子交換樹脂Dowex 2，後通過氯型弱酸性陽離子樹脂Duolite A7，進行兩步純化。後得到UTP鈉鹽洗脫液的純度為97.5％，收率為72.2％。邱蔚然等(CN99113707.8)利用用卡拉膠魔芋多糖固定化酵母轉化得到核苷三磷酸，反應結束後產物離心過濾，濾液用717陰離子交換樹脂進行處理，吸附其中的核苷三磷酸，後用0.7mol/L的(pH＝2)NaCl洗脫，收集洗脫液，加入乙醇，使核苷三磷酸沉澱，經過濾和真空乾燥後可得到目標產物-核苷三磷酸，專利中沒有體積產品的純度和收率。上述報導的分離效果都不太理想，純度不高，收率較低。這些分離方法普遍比較複雜，無法滿足其大規模產業化的要求。
現行NTP的生產工藝中，固定床離子交換技術得到廣泛的應用。而現有的固定床離子交換技術存在多種弊端，它是一種分批式作業，吸附、洗脫、再生等步驟在同一床內進行，單批作業周期長，不連續，離子交換樹脂容量不能充分利用，從而化學實際消耗量大，不經濟，廢水排放量大等是這種交換方式的明顯缺點。
發明內容
本發明的目的是在於克服目前5』-核苷三磷酸分離過程中的成本高、操作繁瑣、不易規模化的缺陷，提供一種連續離子交換技術取代通用固定床交換技術，並結合納濾技術分離酶轉化5』-核苷三磷酸的方法。
本發明是建立在一步分離和連續分離的思想之上的，其特點在於利用溶液中目標產物與共存雜質之間在物理、化學以及生物學性質的差異，使其在分離操作中具有不同的傳質速率和(或)平衡狀態，以及連續式離子交換技術這一新型分離理念從而實現5』-核苷三磷酸分離的目的。
本發明的目的可以通過下列技術措施來實現一種連續分離5』-核苷三磷酸的方法，該方法採用連續離子交換系統和納濾的組合技術分離酶轉化5』-核苷三磷酸，具體方法是將酶轉化的5』-核苷三磷酸清液泵入裝有陰離子離子交換樹脂的連續離子交換系統中進行吸附，採用pH2～14，濃度在0.001M～2M之間的無機鹽溶液以適當的流速泵入連續離子交換系統進行洗雜、洗脫；用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜將離子交換洗脫液同步濃縮和脫鹽，結晶乾燥。
所述的方法，其中連續離子交換系統是指由多根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統，即通過組合式閥門將離子交換過程中的吸附、洗雜、洗脫和再生不同工段之間的按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹脂吸附飽和後立刻移出吸附段送入洗雜段進行洗雜，洗雜結束後立刻移出洗雜段送入洗脫段進行洗脫，洗脫完成後立刻移出洗脫段送入再生段進行再生，再生清洗完成後立刻移出再生段送入吸附段再進行吸附，如此循環的操作過程，且每個工段的第1根離子交換柱的狀態切換同步進行，並保證至少有一根離子交換柱處於吸附階段。
所述的方法，其中由多根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統是指由6～60根固定床離子交換柱組成，優選12～36根組成的連續操作的離子交換系統。
所述的方法，其中5』-核苷三磷酸的酶轉化清液上樣濃度為1～30g/L，優選5～25g/L。
所述的方法，其中無機鹽溶液是氯化鈉、氯化銨或硫酸銨溶液。
所述的方法，其中用於洗脫的無機鹽溶液濃度為0.1M～2M。
所述的方法，其中以濃度為0.2～2M的酸和鹼按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
所述的方法，其中再生過程中所用的酸是鹽酸或硫酸，鹼是氫氧化鈉或氨水。
所述的方法，其中陰離子離子交換樹脂的型號為301型、302型、303型、311型、312型或313型。所述的方法，其中洗雜溶液pH值2～8，洗脫溶液pH值2～6。
以下結合說明書附圖對連續離子交換系統作進一步的說明料液從固定床上部進入在每個工序結束後就通過閥門的切換把完成工序的樹脂柱「移動」到下一個工序，且每道工序通過操作流量的調節或是樹脂裝填量的調節來實現同步運行。對於16根離子交換柱構成連續離交系統，根據物料的特點和工藝條件的需要採用吸附段為5根，洗雜段為3根，洗脫段為3根，再生段為5根的工藝形式，圖1～17為連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置在循環周期中分別處於不同狀態的示意圖。在吸附段的5根離交柱中第5根離交柱的作用是保護整個離交柱的吸附段不會被上柱液穿透而造成損失，當第1根離交柱吸附飽和後就會被移出吸附段，進入洗雜段，成為洗雜工段的第3根柱，而洗雜段的第1根離交柱此時在洗雜流速的控制下剛好洗雜完成，進入洗脫段，成為洗脫工段的最後一根柱，此時可以通過控制洗脫流速使得洗脫段的原第一根也同時洗脫結束，移入再生段的最後一根進行再生，再生段的第一根也再生完畢，開始吸附了。這樣通過控制各個工段的流速，可以使得離交過程的四個工段保持同樣的節奏進行工作。
酶轉化NTP指將原料經酵母轉化而得到的NTP，該方法是本領域普通技術人員公知的技術。
流速受各工段條件的影響，原則是保證各工段同步運行，本領域普通技術人員可根據樹脂的狀態調整流動相的流速。
本發明相比現有技術具有如下優點本發明運用連續離子交換技術由於提高了樹脂的利用率，減少了樹脂用量，運用一種陰離子交換樹脂進行分離純化，工藝步驟簡單洗脫液濃度變高，洗雜效果好，減少了洗脫劑和洗雜劑的用量；同時酸、鹼等再生劑由於提高了利用率而用量減小，同時也減少了酸、鹼的排放。
表1 固定床和連續離交系統性能參數得比較(相同產能)
本發明突破國內外同行對5』-核苷三磷酸分離純化方式的模式化，將離子交換與納濾膜分離相結合，節約了脫鹽和濃縮的步驟可以直接進行結晶純化。使得本發明的分離純化技術簡便易行，效果佳，不僅其設備投資、運行成本低廉，而且可以根據分離量的多少，實現從公斤級到噸級的分離。通過本發明所得產品在產品收率和產品質量方面都獲得了極好的結果，保證了產品品質。
圖1是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態1的示意圖。
圖2是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態2的示意圖。
圖3是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態3的示意圖。
圖4是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態4的示意圖。
圖5是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態5的示意圖。
圖6是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態6的示意圖。
圖7是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態7的示意圖。
圖8是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態8的示意圖。
圖9是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態9的示意圖。
圖10是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態10的示意圖。
圖11是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態11的示意圖。
圖12是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態12的示意圖。
圖13是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態13的示意圖。
圖14是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態14的示意圖。
圖15是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態15的示意圖。
圖16是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態16的示意圖。
圖17是本發明連續分離5』-核苷三磷酸的離子交換裝置處於狀態17的示意圖。
具體實施例方式
通過下列實施實例進一步定義本發明，實施實例是為說明而非限制本發明。本領域中任何普通技術人員能夠理解這些實施實例不以任何方式限制本發明，可做適當的修改而不違背本發明的實質和偏離本發明的範圍。
以下實施例中所採用的連續離子交換系統是指有多根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統，即通過組合式閥門將離子交換過程中的吸附、洗雜、洗脫和再生不同工段之間的按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹脂吸附飽和後立刻移出吸附段送入洗雜段進行洗雜，洗雜結束後立刻移出洗雜段送入洗脫段進行洗脫，洗脫完成後立刻移出洗脫段送入再生段進行再生，再生清洗完成後立刻移出再生段送入吸附段再進行吸附，如此循環的操作過程，且每個工段的第1根離子交換柱的狀態切換同步進行，並至少保證有一根離子交換柱處於吸附階段。
實施例1採用16根離子交換柱構成連續離交系統，吸附段為5根，洗雜段為3根，洗脫段為3根，再生段為5根。每根離交柱裝填30g樹脂(311型)，離交柱的直徑為1.5釐米，高度為25釐米。處理料液為酶轉化的5』-核苷三磷酸清液用去離子水稀釋到10g/L後，用鹽酸調節料液pH值2.3，吸附流速為2.5ml/min，吸附容量為0.22g/g溼樹脂；洗雜溶液為pH 5.0的0.075mol/L NaCl溶液，洗雜流速為5ml/min，洗雜至無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜段第一根離子交換柱無雜質流出為單根離子交換柱洗雜液用量標準)；洗脫液為pH7.0的1.0mol/L NaCl，洗脫流速為2ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫段第一根離子交換柱洗脫完全為單根離子交換柱冼脫液用量標準)，洗脫液用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜同步納濾濃縮脫鹽後結晶、乾燥，得到純度為97.5％的5』-核苷三磷酸，收率在91.0％。以濃度為1M的鹽酸和1M的氫氧化鈉按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
實施例2待處理料液為酶轉化的5』-核苷三磷酸清液用去離子水稀釋到8g/L後，吸附樹脂型號為301，採用16根離子交換柱構成連續離交系統，吸附段為4根，洗雜段為4根，洗脫段為3根，再生段為5根。每根離交柱裝填1000g樹脂，離交柱的徑高比為1∶5。用鹽酸調節料液pH值2.2，吸附流速為20ml/min，吸附容量為0.24g/g溼樹脂；洗雜溶液為pH 2.0的0.05mol/L NaCl溶液，洗雜流速為40ml/min，洗雜至無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜段第一根離子交換柱無雜質流出為單根離子交換柱洗雜液用量標準)；洗脫液為pH7.0的1.0mol/L NaCl，洗脫流速為10ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫段第一根離子交換柱洗脫完全為單根離子交換柱冼脫液用量標準)，洗脫液用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜同步納濾濃縮脫鹽後結晶、乾燥，得到純度為98.2％的5』-核苷三磷酸，收率在91.5％。以濃度為1.0M的鹽酸和1.0M的氫氧化鈉按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
實施例3待處理料液為酶轉化的5』-核苷三磷酸清液用去離子水稀釋到11g/L後，吸附樹脂型號為311，採用16根離子交換柱構成連續離交系統，吸附段為4根，洗雜段為4根，洗脫段為3根，再生段為5根。每根離交柱裝填1Kg樹脂，離交柱的徑高比為1∶5。用鹽酸調節料液pH值2.4，吸附流速為25ml/min，吸附容量為0.25g/g溼樹脂；洗雜溶液為pH 2.0的0.075mol/LNaCl溶液，洗雜流速為50ml/min，洗雜至無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜段第一根離子交換柱無雜質流出為單根離子交換柱洗雜液用量標準)；洗脫液為pH7.0的1.0mol/LNaCl，洗脫流速為15ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫段第一根離子交換柱洗脫完全為單根離子交換柱冼脫液用量標準)，洗脫液用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜同步納濾濃縮脫鹽後結晶、乾燥，得到純度為98.3％的5』-核苷三磷酸，收率在92.0％。以濃度為1.2M的鹽酸和1.2M的氫氧化鈉按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
實施例4待處理料液為酶轉化的5』-核苷三磷酸清液用去離子水稀釋到12g/L後，吸附樹脂型號為301，採用16根離子交換柱構成連續離交系統，吸附段為5根，洗雜段為3根，洗脫段為3根，再生段為5根。每根離交柱裝填500g樹脂，離交柱的徑高比為1∶5。用鹽酸調節料液pH值2.5，吸附流速為10ml/min，吸附容量為0.24g/g溼樹脂；洗雜溶液為pH 2.0的0.05mol/L NaCl溶液，洗雜流速為20ml/min，洗雜至無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜段第一根離子交換柱無雜質流出為單根離子交換柱洗雜液用量標準)；洗脫液為pH7.0的1.0mol/L NaCl，洗脫流速為5ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫段第一根離子交換柱洗脫完全為單根離子交換柱冼脫液用量標準)，洗脫液用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜同步納濾濃縮脫鹽後結晶、乾燥，得到純度為98.3％的5』-核苷三磷酸，收率在91.4％。以濃度為1.5M的鹽酸和1.5M的氫氧化鈉按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
實施例5待處理料液為酶轉化的5』-核苷三磷酸清液用去離子水稀釋到12g/L後，吸附樹脂型號為311，採用16根離子交換柱構成連續離交系統，吸附段為4根，洗雜段為4根，洗脫段為3根，再生段為5根。每根離交柱裝填1Kg樹脂，離交柱的徑高比為1∶5。用鹽酸調節料液pH值2.2，吸附流速為25ml/min，吸附容量為0.25g/g溼樹脂；洗雜溶液為pH 2.0的0.075mol/L NaCl溶液，洗雜流速為50ml/min，洗雜至無雜質為止(用HPLC檢測確定洗雜段第一根離子交換柱無雜質流出為單根離子交換柱洗雜液用量標準)；洗脫液為pH7.0的1.0mol/LNaCl，洗脫流速為15ml/min，洗脫完全(用HPLC檢測確定洗脫段第一根離子交換柱洗脫完全為單根離子交換柱冼脫液用量標準)，洗脫液用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜同步納濾濃縮脫鹽後結晶、乾燥，得到純度為98.1％的5』-核苷三磷酸，收率在92.6％。以濃度為1.2M的鹽酸和1.2M的氫氧化鈉按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
權利要求
1.一種連續分離5』-核苷三磷酸的方法，其特徵在於該方法採用連續離子交換系統和納濾的組合技術分離酶轉化5』-核苷三磷酸，具體方法是將酶轉化的5』-核苷三磷酸清液泵入裝有陰離子離子交換樹脂的連續離子交換系統中進行吸附，採用pH2～14，濃度在0.001M～2M之間的無機鹽溶液以適當的流速泵入連續離子交換系統進行洗雜、洗脫；用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜將離子交換洗脫液同步濃縮和脫鹽，結晶乾燥。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於連續離子交換系統是指由多根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統，即通過組合式閥門將離子交換過程中的吸附、洗雜、洗脫和再生不同工段之間的按順序切換，將吸附段離子交換柱在樹脂吸附飽和後立刻移出吸附段送入洗雜段進行洗雜，洗雜結束後立刻移出洗雜段送入洗脫段進行洗脫，洗脫完成後立刻移出洗脫段送入再生段進行再生，再生清洗完成後立刻移出再生段送入吸附段再進行吸附，如此循環的操作過程，且每個工段的第1根離子交換柱的狀態切換同步進行，並保證至少有一根離子交換柱處於吸附階段。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於由多根離子交換柱串聯的連續操作的離子交換系統是指由6～60根固定床離子交換柱組成。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於5』-核苷三磷酸的酶轉化清液上樣濃度為1～30g/L。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於無機鹽溶液是氯化鈉、氯化銨或硫酸銨溶液。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於用於洗脫的無機鹽溶液濃度為0.1M～2M。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於以濃度為0.2～2M的酸和鹼按先酸後鹼的順序泵入需再生的離子交換柱進行再生，再生完成後用去離子水淋洗。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於酸是鹽酸或硫酸，鹼是氫氧化鈉或氨水。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於陰離子離子交換樹脂的型號為301型、302型、303型、311型、312型或313型。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於洗雜溶液pH值2～8，洗脫溶液pH值2～6。
全文摘要
本發明公開了一種連續分離5』－核苷三磷酸的方法。該方法採用連續離子交換系統和納濾的組合技術分離酶轉化5』－核苷三磷酸，具體方法是將酶轉化的5』－核苷三磷酸清液泵入裝有陰離子離子交換樹脂的連續離子交換系統中進行吸附，採用pH2～14，濃度在0.001M～2M之間的無機鹽溶液以適當的流速泵入連續離子交換系統進行洗雜、洗脫；用截留分子量為150～300道爾頓的納濾膜將離子交換洗脫液同步濃縮和脫鹽，結晶乾燥。本發明具有分離介質擔載量大、設備投資少，易於規模化生產，生產成本低的優點。
文檔編號C07H1/00GK1872867SQ20061008538
公開日2006年12月6日 申請日期2006年6月12日 優先權日2006年6月12日
發明者應漢傑, 呂浩, 趙谷林 申請人:南京工業大學