雜交瘤、抗人膀胱癌的單抗和導向藥物及膀胱癌診斷試劑的製作方法

2023-05-03 05:34:36

專利名稱：：雜交瘤、抗人膀胱癌的單抗和導向藥物及膀胱癌診斷試劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥生物
技術領域：
，特別涉及一種產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤DTB、其用途及製備方法，抗人膀胱癌的單克隆抗體DTB和導向藥物及膀胱癌免疫診斷試劑，以及所述導向藥物的製備方法。
背景技術：
：膀胱癌是泌尿系統中最常見的腫瘤。儘管目前採用多種措施進行綜合治療，但仍有40%-70%的患者要發生一次或多次復發，10%-15%的患者發展成更高級別的腫瘤或發生轉移，同時這些治療方法還有明顯的毒副作用。膀胱癌在腫瘤切除後的預防復發是臨床的重要課題。目前用於膀胱灌注預防復發的藥物主要分以下幾類(l)抗腫瘤化療藥物，如阿黴素、絲裂黴素C、喜樹鹼類等；(2)免疫增強劑，以卡介苗(BCG)為典型代表。(3)細胞因子，如幹擾素、白細胞介素-2。以上幾類藥物可以單獨使用或聯合使用，雖在降低膀胱癌術後復發率上取得一些效果，但因特異性差、腫瘤多耐藥性(MDR)等問題的存在，總體療效並不理想，高達40%-70%的患者要發生一次或多次復發，10%-15%的患者發展成更高級別的腫瘤或發生轉移。且以上各類藥物分子量小，不但可非特異性地作用於全膀胱及尿道，還可經膀胱及尿道黏膜吸收，因而容易產生局部及全身的毒副作用。以療效較為肯定的絲裂黴素C及卡介苗為例使用卡介苗的患者90。/。有BCG膀胱炎，其它的副作用有血尿、皮滲、發熱、關節炎、附睪炎、尿道狹窄等，還有少見而嚴重的肝炎及肺炎、致命性敗血症等。絲裂黴素C的副作用相對較少，但仍有5%~25%的化學性膀胱炎、5%~15%的過敏性反應，還可見尿道狹窄、骨髓抑制、膀胱壁鈣化等副作用。導向藥物是具有導向能力的分子(如單克隆抗體)和具有活性的效應分子(如毒素、藥物、放射性核素等)偶聯而成的一種具有特異性識別、殺傷或顯像的雜交分子。膀胱癌是一種人體腔內腫瘤，相當於一個人體的"肉試管"，而導向藥物在體外對靶細胞具有高特異和強殺傷作用。尋找一種療效好、副作用少的新的抗人膀胱癌的導向藥物，在膀胱癌的治療上具有重要意義。在膀胱腫瘤的篩查中，膀胱癌的早期發現和正確的預後估計對臨床治療顯得極為重要。近年新用於臨床的分子標記，如核基質蛋白、膀胱腫瘤抗原和衛星不穩定性等，也同樣受限於靈敏度和特異性低的不足。尿脫落細胞學分析和膀胱鏡檢查仍然是膀胱癌診斷和監測的金標準。所以，尋求有效、便利的膀胱癌的診斷方法是非常必要的。
發明內容本發明要解決的技術問題旨在克服上述已有技術的不足，提供了一種雜交瘤，這種雜交瘤能夠產生高效價的抗人膀胱癌的單抗。本發明採用的技術方案是一種產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤DTB,其特徵在於所述雜交瘤由以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫的小鼠的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合而得。進一步地，本發明涉及的雜交瘤由下述方法製備而得以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫小鼠，將致敏的小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，用HAT培養基進行選4奪性培養，用ELISA方法篩選陽性克隆後，用有限稀釋法進行克隆，經過2-3輪克隆化培養，獲得能夠產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細胞。本發明的雜交瘤與已有技術相比具有以下積極效果能夠產生高效價的抗人膀胱癌的單抗DTB,並且分泌穩定。本發明還涉及所述雜交瘤DTB用於製備抗人膀胱癌單克隆抗體DTB的用途。本發明還涉及一種產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤的製備方法，所述製備方法包括下述步驟以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫小鼠，將致敏的小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，用HAT培養基進行選擇性培養，用ELISA方法篩選陽性克隆後，用有限稀釋法進行克隆，經過2-3輪克隆化培養，獲得能夠產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細胞。本發明的雜交瘤的製備方法與已有技術相比簡單易操作。本發明還涉及一種單克隆抗體DTB,所述單克隆抗體是由上述的雜交瘤所產生。本發明的單克隆抗體與已有技術相比具有以下積極效果免疫組織化學和免疫螢光法證明，該抗體DTB與人膀胱癌組織及膀胱癌細胞E-J呈強陽性反應，而與人正常膀胱組織和其它非膀胱癌細胞無交叉反應，表明抗膀胱癌單克隆抗體DTB特異性強。本發明還涉及一種抗人膀胱癌的導向藥物，所述導向藥物的抗體部分是上述抗人膀胱癌的單克隆抗體。進一步地，所述導向藥物由上述的抗人膀胱癌的單克隆抗體和蓖麻毒素A鏈連接而成。本發明的導向藥物與已有技術相比具有以下積極效果(1)殺傷腫瘤的作用強，不會產生耐藥性，預防術後復發的效果明顯優於目前常規的治療方法，對一些原發肺瘤可以有效地控制其生長。(2)特異性好，避免了機體其它正常組織非特異攝取所致的損傷和蓖麻毒素B鏈的非特異性所帶來的毒副作用。(3)不進入血液，可避免血清中的人抗鼠抗體(HAMA)以及抗蓖麻毒素A鏈抗體的產生。(4)局部給藥，避免了血液的稀釋。對那些由於種種原因對抗癌藥物不敏感的復發患者，通過加大藥物劑量、調整用藥頻率，可獲得非常明顯的治療效果。體外細胞殺傷實驗表明，DTB-RA具有很強的特異殺傷活性，其對人膀胱癌細胞E-J的半抑制濃度(IC5Q)為1.0x10—"M，而對非膀胱癌細胞(人直腸癌細胞Lovo)的半抑制濃度為1.2xlO—9M。本發明還涉及一種製備所述導向藥物的方法，所述製備方法包括下述步驟完整的蓖麻毒素經還原及親和層析，分離純化得到具有酶活性蓖麻毒素A鏈(RA)。蓖麻毒素A鏈與摩爾比過量的交聯劑SPDP反應，透析。DTB單抗與摩爾比過量的交聯劑SPDP反應，攪拌，透析。分別將透析好的蓖麻毒素A鏈與DTB單抗以等摩爾比例混合，攪拌，過G-100凝膠過濾柱。上樣後收集的第一洗脫峰即為導向藥物DTB-RA,將DTB-RA過濾除菌，凍存。本發明的導向藥物的製備方法與已有技術相比筒單易操作。本發明還涉及一種膀胱癌免疫診斷試劑，所述診斷試劑由包被在酶標板上的人膀胱癌細胞系E-J細胞裂解液和抗人膀胱癌單克隆抗體DTB組成，採用竟爭ELISA法檢測尿脫落細胞中的膀胱癌抗原。本發明的膀胱癌免疫"^斷試劑與已有技術相比具有以下積極效果(1)非損傷性，直接檢測尿脫落細胞，避免了膀胱鏡檢查給病人帶來的不便與痛苦。(2)靈敏度達到了86%，特異性達到了92%，遠高於目前的膀胱腫瘤標記物(如核基質蛋白、細胞角蛋白、透明質酸等)的檢測和尿脫落細胞的病理學檢查。(3)特異性強、靈敏度高，採用竟爭ELISA法檢測細胞中的膀敏度較低的缺點。(4)方便快捷，適合於早期膀胱癌患者的篩查和腫瘤復發的衝企測。本發明提供的抗人膀胱癌導向藥物及其膀胱癌免疫診斷試劑，為癌症病人的診斷、治療、預後和監測提供了有效的途徑。圖1表示本發明涉及的DTB單抗，按常規方法對膀胱癌細胞E-J進行免疫螢光的400倍照片；圖2表示本發明涉及的DTB單抗，按常規方法對其它細胞進行免疫螢光的400倍照片；圖3表示本發明涉及的導向藥物DTB-RA鑑定的吸光光度值。保藏說明保藏日期2008年3月5曰保藏單位全稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏單位簡稱CGMCC保藏單位地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院農i生物研究所，100101分類命名抗人膀胱癌單克隆抗體雜交瘤細胞株保藏編號CGMCCNo.2393具體實施例方式參照附圖，將詳細敘述本發明的具體實施方式。本發明涉及一種產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細胞抹DTB，它能夠產生高效價的抗人膀胱癌的單抗DTB，並且分泌穩定。實施例l:製備雜交瘤細胞抹材料人膀胱癌細胞系E-J細胞(北京北方偉業發展有卩艮公司)Balb/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCCCRL-1772)方法1)免疫以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫Balb/C小鼠，以1x107個細胞/0.5mlPBS的劑量進行腹腔注射。2周後對小鼠進行再次免疫，注射體積和方法不變。待小鼠血清效〗介達到要求後準備進行細胞融合，融合前三天對小鼠進行加強免疫。在免疫小鼠的同時準備小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCCCRL-1772)。2)細胞融合將致敏的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞按照下述方法進行細胞融合(1)取對數生長的骨髓瘤細胞Sp2/0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養液混懸細胞後計數，取所需的細胞數，用不完全培養液洗滌2次。同時製備免疫脾細胞懸液，用不完全培養液洗滌2次。(2)將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:10的比例混合在一起，用不完全培養液洗1次，1200rpm，8分4中。(3)棄上清，用滴管吸淨殘留液體，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略加鬆動，在室溫下融合①30秒內加入預熱的lml45%PEG(Merek公司)含5%DMSO(Sigma公司)，邊加邊攪拌，作用90秒鐘。②加預熱的不完全培養液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入lml,2ml,3ml，4ml，5ml和10ml。(4)離心，800rpm，6分鐘，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640(GIBCO公司)輕輕混懸。(5)將融合後細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100jal/孔，37℃、5%C02孵箱培養。)，用HAT培養基進行選擇性培養(以小鼠腹腔巨喧細月包為飼養細"包)。3)4企測用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清以E-J細胞(105個/ml)包被96孔板，每孔100pl，37。C培養過夜。細胞貼壁後，加4%多聚曱醛室溫固定IO分鐘，洗滌3次，加待檢上清lOOul,37℃孵育1小時。洗滌3次，加酶標二抗(抗小鼠IgG-HRP),37℃孵育1小時。洗滌3次，加底物顯色劑50pl，室溫靜置5分鐘，加終止液50μl。結果用酶標儀測定波長450nm的OD值，OD值高於陰性對照2倍以上者可-見為陽性。4)細胞克隆化培養將選出的陽性雜交瘤細胞克隆化培養(有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細胞為飼養細胞)。經過2-3輪克隆化培養，獲得穩定的能夠產生高效價單抗的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞克隆擴大培養，並凍存保種。本發明中的一種陽性雜交瘤細胞為抗人膀胱癌單克隆抗體雜交瘤細胞抹，該雜交瘤細胞繫於2008年3月5日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,中國，北京)，保藏號為CGMCCNo.2393。實施例2:DTB單克隆抗體的製備和純化將上述雜交瘤細胞DTB接種至小鼠腹腔，製備腹水，再從腹水中提取單抗。單抗DTB的純化採用ProteinG親和層析法。首先製備ProteinG親和層析柱，用PBS平衡柱子後，取含DTB單抗的腹水過柱，然後用PBS洗柱子，至OD值接近於零，以0.2M的甘氨酸-HC1溶液(pH2.8)洗脫，收集洗脫液，測定各收集管的OD值，保留峰值區的洗脫液，洗脫液經透析濃縮後用於製備免疫偶聯物。實施例3:DTB單克隆抗體的性質鑑定按常規方法對人膀胱癌組織切片進行免疫組化染色，結果如圖1、2所示。結果表明，人膀胱癌組織經DTB單抗、二抗及底物染色後呈陽性反應，而人正常膀胱組織經DTB單抗、二抗及底物染色後呈陰性反應。用DTB單抗，按常規方法對膀胱癌細胞E-J和其它細胞進行免疫螢光。結果如圖1、2所示。結果表明，DTB單抗與E-J細胞呈強陽性反應，與其它非膀胱癌細胞無交叉反應。表1DTB單抗與人細胞系的反應性細胞系DTB單抗E-J+++293T—HepG2—Jurkat—K562—Lovo—MCF-7—實施例4:抗人膀胱癌的導向藥物DTB-RA的製備免疫組織化學和免疫螢光法證明，DTB抗體與人膀胱癌組織及膀胱癌細胞E-J呈強陽性反應，而與人正常膀胱組織和其它非膀胱癌細胞無交叉反應。表明抗膀胱癌單克隆抗體DTB特異性強，是理想的導向載體。蓖麻毒素A鏈(RA)是由完整的蓖麻毒素經還原及親和層析分離純化得到具有酶活性A鏈。蓖麻毒素A鏈能直接滅活真核生物細胞核糖體大亞基中的28SrRNA,從而阻斷蛋白質合成，導致細胞死亡。抗人膀胱癌導向藥物DTB-RA是由抗人膀胱癌單克隆抗體DTB與蓖麻毒素A鏈(RA),通過異型雙功能交聯劑SPDP化學偶聯製備而成。方法1)蓖麻毒素的製備(1)蓖麻籽去殼，搗碎，研磨；用乙醚脫脂後，加入的醋酸水溶液溶解沉澱，用Tris-HCl(0.1M/pH8.4)透析，即為粗毒；(2)製備Sepharose-6B親和層析柱，用Tris-HCl平衡柱子後，取粗毒過柱，然後用用Tris-HCl洗脫雜蛋白，至OD值接近於零，用含0.2M半乳糖的Tris-HCl緩衝液洗脫毒素蛋白，收集洗脫液，測定各收集管的OD值，保留峰值區的洗脫液。)2)製備蓖麻毒素A鏈完整的蓖麻毒素經還原及親和層析完整的蓖麻毒素與Sepharose-6B柱孵育後，用200mM的DTT洗脫，收集洗脫液，測定各收集管的OD值，保留峰值區的洗脫液，洗脫液經透析濃縮後用於製備免疫偶聯物，分離純化得到具有酶活性蓖麻毒素A鏈(RA)。3)交聯蓖麻毒素A鏈與摩爾比10倍過量的交聯劑SPDP反應，用醋酸緩衝液(0.02M,pH4.5)透析過夜，加入終濃度為50mM的二碌,蘇糖醇(DTT)，室溫攪拌30分鐘，用PBS透析過夜。DTB單抗與摩爾比10倍過量的交聯劑SPDP反應，室溫攪拌30分鐘，用PBS透析過夜。分別將透析好的蓖麻毒素A鏈與DTB單抗以等摩爾比例混合，室溫攪拌過夜，加樣於G-100凝膠過濾柱上。上樣後收集各洗脫峰，第一峰即為導向藥物DTB-RA,第二峰為DTB抗體，第三峰為蓖麻毒素A鏈(RA)，將DTB-RA過濾除菌，-20°C凍存。實施例5:抗人膀胱癌的導向藥物DTB-RA的鑑定採用細胞殺傷結晶紫染色法分別將人膀胱癌細胞E-J和人直腸癌Lovo細胞(中國協和醫科大學基礎醫學院細胞中心)接種於96孔板，細胞密度為1S個/ml，37。C培養過夜。在起始孔內加入終濃度為1(T6M的導向藥物DTB-RA,混勻，依次進行10倍梯度稀釋。將96孔板放入培養箱，37°C、5%C02,培養24-48小時；棄去上清，每孔加入50)il染色液(50mg結晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸餾水定溶至100ml結晶紫)，室溫放置30分鐘；流水衝去染色液，吸乾殘留水分，每孔加入lOOpl脫色液，室溫放置3-5分鐘；測定波長570nm，結果如圖3所示，對E-J細胞的半抑制濃度(IC5Q)為1.0x10—UM,而對Lovo細胞的半抑制濃度為1.2xl(T9M。實施例6:膀胱癌免疫診斷試劑的製備(1)膀胱癌細胞系E-J細胞裂解液酶標板的製備將107個新鮮培養的膀胱癌細胞E-J用1ml三去汙裂解液(50mMTris-HCl,pH8.0;150mMNaCl;0.02%疊氮鈉；0.1%SDS;100[ig/mlPMSF;l(ig/mlAprotinin;l%NP-40;0.5%脫氧膽酸鈉)裂解，提取總蛋白，用pH7.4的0.1M磷酸鹽緩衝液稀釋至10ml,按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜，甩幹，按200μl/孔加入含有1%明膠的0.1MpH7.4的磷酸鹽緩衝液，37℃封閉2小時，洗滌甩幹，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時，置乾燥室乾燥後，裝入含乾燥劑的包裝袋中保存。(2)膀胱癌抗原標準溶液的製備將1(f個新鮮培養的膀胱癌細胞E-J用lml三去汙裂解液裂解，提取總蛋白；用稀釋液(0.1MpH7.4的磷酸鹽緩沖液)按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128倍數進行梯度稀釋，加入1%BSA和50%甘油，-20℃保存備用。實施例7:膀胱癌免疫i貪斷試劑的應用(1)樣品4全測分別收集膀胱癌病人(I期、II期、III期)和健康人各50份新鮮尿液，每份50ml，離心後耳又細胞沉澱，加入100μl三去汙裂解液裂解細胞，提取總蛋白，並與lmg/mlDTB單抗等體積混合，室溫反應10分鐘；以100μl/孔的體積加樣，同時用膀胱癌抗原標準溶液作對照，37℃孵育1小時；甩去液體，用洗滌液(0.1MpH7.4的磷酸鹽緩衝液，0.05%Tween-20)洗滌5次；甩幹，加入辣才艮過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體(Sigma公司)，100μl/孔，37℃孵育1小時；甩去液體，用洗滌液洗滌5次；加入底物(四曱基聯苯胺，H202)100μl/孔，室溫避光孵育10-20分鐘；加入2MH2S0450μl中止反應；在酶標儀上測定OD值(450nm)。(2)結果分析標準溶液的OD最小值/OD臨界值-0.5,得到OD臨界值-OD最小值x2，根據OD臨界值，判斷其靈敏度為86%,特異性為92%,符合率為89%。結果如表2所示。表2膀胱癌免疫診斷試劑與膀胱癌病人和健康人的檢測結果complextableseeoriginaldocumentpage14權利要求1、一種產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤DTB，其特徵在於所述雜交瘤的親本細胞是以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫的小鼠的B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞。2、根據權利要求1所述的雜交瘤DTB,其特徵在於所述雜交瘤由下述方法製備而得以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫小鼠，將致敏的小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，用HAT培養基進行選擇性培養，用ELISA方法篩選陽性克隆後，用有限稀釋法進行克隆，經過2-3輪克隆化培養，獲得所述能夠產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細胞。3、權利要求1或2所述雜交瘤DTB用於製備抗人膀胱癌單克隆抗體DTB的用途。4、一種製備權利要求1或2所述雜交瘤的方法，其特徵在於所述製備方法包括下述步驟以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫小鼠，將致敏的小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，用HAT培養基進行選4奪性培養，用ELISA方法篩選陽性克隆後，用有限稀釋法進行克隆，經過2-3輪克隆化培養，獲得能夠產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤細胞。5、一種抗人膀胱癌的單克隆抗體DTB,其特徵在於所述單克隆抗體由權利要求1或2中任一權利要求所述的雜交瘤所產生。6、一種抗人膀胱癌的導向藥物，其特徵在於所述導向藥物的抗體部分是權利要求5所述的抗人膀胱癌的單克隆抗體DTB。7、根據權利要求6所述的抗人膀胱癌的導向藥物，其特徵在於所述導向藥物所述的抗人膀胱癌的單克隆抗體DTB和蓖麻毒素A鏈連接而成。8、一種製備權利要求7所述的導向藥物的方法，其特徵在於所述製備方法包括下述步驟完整的蓖麻毒素經還原及親和層析，分離純化得到具有酶活性蓖麻毒素A鏈(RA)。蓖麻毒素A鏈與摩爾比過量的交聯劑SPDP反應，透析。DTB單抗與摩爾比過量的交聯劑SPDP反應，攪拌，透析。分別將透析好的蓖麻毒素A鏈與DTB單抗以等摩爾比例混合，攪拌，過G-100凝膠過濾柱。上樣後收集的第一洗脫峰即為導向藥物DTB-RA,將DTB-RA過濾除菌，凍存。9、一種膀胱癌免疫診斷試劑，其特徵在於所述診斷試劑由包被在酶標板上的人膀胱癌細胞系E-J細胞裂解液和抗人膀胱癌單克隆抗體DTB組成，採用竟爭ELISA法檢測尿脫落細胞中的膀胱癌抗原。全文摘要本發明涉及產生抗人膀胱癌單克隆抗體的雜交瘤，所述雜交瘤的親本細胞是以人膀胱癌細胞系E-J細胞免疫的小鼠的B淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞。本發明還涉及所述雜交瘤的用途及製備方法，由所述雜交瘤所產生的單克隆抗體，抗膀胱癌的導向藥物及膀胱癌免疫診斷試劑，以及所述導向藥物的製備方法。其中，所述導向藥物的抗體部分是所述抗人膀胱癌的單克隆抗體。所述診斷試劑由包被在酶標板上的人膀胱癌細胞系E-J細胞裂解液和抗人膀胱癌單克隆抗體DTB組成，採用競爭ELISA法檢測尿脫落細胞中的膀胱癌抗原。本發明的抗體特異性強；本發明的導向藥物殺傷腫瘤的作用強，不會有耐藥性，特異性好；本發明的診斷試劑具有非損傷性，高靈敏度，高特異性，方便快捷的特點。文檔編號C12N5/20GK101343623SQ20081010013公開日2009年1月14日申請日期2008年5月26日優先權日2008年5月26日發明者強侯,翀李,剛慄,王德朋申請人:翀李