一種霍亂弧菌o1群檢測試劑盒及其檢測方法

2023-05-03 08:27:41

專利名稱：：一種霍亂弧菌o1群檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及體外診斷試劑
技術領域：
，具體涉及一種霍亂弧菌01群檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：霍亂是一類以腹瀉為主要症狀的烈性傳染病，至今已發生7次世界大流行，1961年開始由埃爾託霍亂弧菌引起的霍亂第7次世界大流行，波及140個國家和地區，報告病例400萬以上。據WHO專家會議估計，全球每年約發生550萬例，其中以亞洲、非洲和拉丁美洲較為嚴重，引起亞洲10萬和非洲2萬人死亡。時至今日，霍亂仍然是最危險的烈性傳染病之一。因此，早期迅速和正確的診斷對治療和預防本病的蔓延有重大意義。目前霍亂弧菌已被分為200多個血清群，但只有01血清群和0139血清群能夠引起流行，準確、快速地檢測霍亂弧菌01群具有十分重要的意義傳統霍亂弧菌檢測方法，由於其檢測周期長、程序複雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求。以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實際應用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉汙染和操作過程煩瑣的缺點。而螢光實時定量聚合酶鏈式反應(realtimePCR)技術雖然較好地解決了交叉汙染的問題，並簡化了操作過程，但卻需要更複雜的定量測定儀器，因此不適用於現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中螢光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恆溫擴增(IsothermalAmplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已建立起來的環介導恆溫擴增技術(LAMP)具有很多的優越性。因此，需要一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的霍亂弧菌01群檢測試劑盒及檢測方法以解決上述問題。基於環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplicationofDNA,簡稱LAMP)是利用fetDNA聚合酶和根據靶基因序列設計的兩對特殊的內、外引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖_環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白色沉澱，即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恆溫(6365°C)條件下4590分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易汙染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利於建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恆溫基因擴增技術與PCR技術(包括螢光實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異性和檢測範圍等方法學指標上相當於或優於PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低於螢光定量PCR技術。目前國家標準中以微生物分離培養和形態學鑑定為主、結合生化分析和血清學分型鑑定的通行方法，初步鑑定需23天，完成鑑定報告需1015天；採用本發明的檢測試劑盒僅需2小時。並且，本發明的反應體系中加入了顯色液，鑑定結果更為直觀清晰。_
發明內容本發明所要解決的技術問題之一是克服現有技術中耗時長，漏檢率高的不足提供檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的霍亂弧菌01群檢測試劑盒。霍亂弧菌01群有多個重要抗原。本發明檢測的是基因，該基因為霍亂弧菌01群0抗原1型的編碼基因，可以特異地檢測出霍亂弧菌01群。與NCBI網站nt資料庫的BLAST比對結果顯示，除霍亂弧菌01群外，無其它菌帶有該基因。本發明所提供的霍亂弧菌01群檢測試劑盒包括下列組成以霍亂弧菌基因為靶基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的各兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3，Bstmk聚合酶，反應液，樣品預處理液，顯色液，穩定液和陽性對照。所述的兩對內外引物分別為外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTT(SEQIDN01)外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTG(SEQIDN02)內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCC(SEQIDN03)內引物BIP:AGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTT(SEQIDN04)或外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATA(SEQIDN05)外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGC(SEQIDN06)內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTC(SEQIDN07)內引物BIP:GCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGT(SEQIDN08)或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACG(SEQIDN09)外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGC(SEQIDN010)內引物FIP:AACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCT(SEQIDN011)內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGC(SEQIDN012)或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGA(SEQIDN013)外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGT(SEQIDN014)內引物FIP:GTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTC(SEQIDN015)內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTG(SEQIDN016)。所述的內引物FIP/BIP各為0.20.25iimol/L，外引物F3/B3的濃度各為1.22.0umol/L；優選內引物FIP/BIP的濃度為0.2umol/L,外引物F3/B3的濃度為1.6umol/L。所述的聚合酶酶濃度4-10U/iiL，優選酶濃度為8U/iiL。所述的反應液含1.62mmol/LdNTPs、2025mmol/LTris_HCl、1012.5mmol/LKC1U012.5mmol/L(NH4)2S04、810mmol/LMgS04、0.10.125體積％TritonX-100、0.8lmol/L甜菜鹼；優選2mmol/LdNTPs、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125體積％TritonX-100、lmol/L甜菜鹼。所述的顯色液為SYBRGreenI或EvaGreen，優選SYBRGreenI。所述穩定液為石蠟油。所述的陽性對照為霍亂弧菌01群基因組DNA。本發明所要解決的另一技術問題是提供一種霍亂弧菌01群檢測方法，包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉澱；(2)將步驟(1)的沉澱加入本發明檢測試劑盒中的樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活後冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA；(3)在反應容器中加入本發明試劑盒中的BstDNA聚合酶0.91.8體積份數、反應液3840體積份數、穩定液5254.5體積份數、樣品模板DNA4.59體積份數、內引物FIP/BIP各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恆溫反應；(4)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；步驟(3)中所述的恆溫反應的反應條件為溫度6365°C，反應時間4590min。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明的檢測試劑盒只需一個恆定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；2.本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性；3.本發明的檢測試劑盒擴增快速且高效，在不到1小時即可完成擴增，且產率高；4.本發明的檢測試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發明的基因快速診斷試劑盒鑑定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂沉澱，可通過肉眼觀察鑑定，並且加入顯色液後，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；6.由於選擇了高保守性的基因作為靶基因設計引物，使得本發明的檢測試劑盒檢測霍亂弧菌01群的準確率更高。_具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例1試劑盒的製備(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTT(SEQIDN01)外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTG(SEQIDN02)內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCC(SEQIDN03)內引物BIP:AGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTT(SEQIDN04)。(2)購置DNA聚合酶聚合酶置於容器；(3)配製反應液和引物反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125體積％TritonX-100、lmol/L甜菜鹼、內引物FIP/BIP各0.2iimol/L和外引物F3/B3各0.25iimol/L,置於容器；(4)配製樣品預處理液樣品預處理液含有20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2體積%TritonX-100,置於容器；(5)購置穩定液石蠟油，置於容器；(6)購置顯色液SYBRGreenI，置於容器；(7)提取陽性對照提取霍亂弧菌01群基因組DNA，置於容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。製備工藝簡述如下1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化後，定量配製，濃度檢測，抽樣質檢；2、將上述(2廣(4)步驟配製的液體無菌分裝，並按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；3、將穩定液分裝，抽樣質檢；4、將陽性對照標本製備，分裝，抽樣質檢；5、組裝試劑盒。在本發明霍亂弧菌01群檢測試劑盒的其他實施例中，所採用的引物還可以是外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACG(SEQIDN09)外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGC(SEQIDN010)內引物FIP:AACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCT(SEQIDN011)內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGC(SEQIDN012)實施例2試劑盒的製備(1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATA(SEQIDN05)外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGC(SEQIDN06)內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTC(SEQIDN07)內引物BIP:GCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGT(SEQIDN08)(2)購置DNA聚合酶-.Bstrnk聚合酶置於容器；(3)配製反應液和引物反應液含有1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-Cl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2S04、8mmol/LMgS04、0.1體積％TritonX-100,0.8mol/L甜菜鹼、內引物FIP/BIP各0.25umol/L和外引物F3/B3各1.2iimol/L，置於容器；(4)配製樣品預處理液樣品預處理液含有10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、lmmol/LEDTA和1.0體積%TritonX-100,置於容器；(5)購置穩定液石蠟油，置於容器；(6)購置顯色液EVAGreenI，置於容器；(7)提取陽性對照提取霍亂弧菌01群基因組DNA，置於容器；(8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。其他同實施例1。在本發明霍亂弧菌01群檢測試劑盒的其他實施例中，所採用的引物還可以是外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGA(SEQIDN013)外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGT(SEQIDN014)內引物FIP:GTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTC(SEQIDN015)內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTG(SEQIDN016)。實施例3霍亂弧菌01群檢測試劑盒的應用1材料與方法1.1材料1.1.1菌株本發明採用菌株有17株，主要來源於中國疾病預防控制中心、上海市疾病預防控制中心、浦東新區疾病預防控制中心。詳見表1。tableseeoriginaldocumentpage91.2分離菌株的鑑定1.2.1將標本接種至TCBS瓊脂、雙洗平板上，TCBS上出現黃色菌落，雙洗平板上出現灰黑色中心的菌落均為可疑菌落。在顯微鏡下菌體為稍彎的桿菌，菌體短，逗點狀，菌體單端有一根鞭毛，運動活潑呈穿梭狀，革蘭氏染色陰性。生化反應氧化酶+蔗糖+靛基質_硫化氫-動力+V-P+。血清學反應與霍亂弧菌01群多價診斷血清發生凝集，生理鹽水不凝集。1.3樣品處理(模板DNA提取)1.3.1取lmL液體培養的菌液樣品，lOOOOrpm離心2分鐘，獲得菌體沉澱；1.3.2在上述菌體沉澱中加入100yL樣品預處理液混合均勻，沸水中煮20分鐘後立即置於冰上冷卻10分鐘，lOOOOrpm離心2分鐘，上清即為樣品模板DNA。1.4、採用實施例1或實施例2的試劑盒進行環介導等溫擴增技術的反應過程1.4.1在200uL反應管配製反應體系反應液和引物共22uL，BstDNA聚合酶0.5yL(4U)，穩定液30uL，模板DNA2.5yL。1.4.2將配製好的反應管於65°C恆溫反應1小時。1.5反應後處理向上述反應產物中加入2uLSYBRGreenI，混勻，同時也向陽性對照管(霍亂弧菌01群基因組DNA)和陰性對照管(去離子水)中加入SYBRGreenI混勻，若反應管與陽性對照管一樣顯現綠色則為陽性，若反應管與陰性對照管一樣顯現橙色則為陰性。1.6電泳配製0.2%瓊脂糖凝膠電泳。以SYBRGreenI作為染料進行顯色反應觀察結果。1.7特異度試驗1.7.1純菌株LAMP檢測用LAMP方法對25株細菌進行擴增，根據顯色反應觀察結果，綠色為陽性，橙色陰性，驗證方法特異性。1.7.2幾種菌株混合DNA檢測用LAMP對霍亂弧菌01群及沙門氏、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌的DNA等體積混合液取2.5ul作LAMP檢測。1.8靈敏度試驗將霍亂弧菌01群於普通營養瓊脂平板上純培養18-24小時後，挑兩滿環菌落混懸於5mL無菌生理鹽水中，用生理鹽水10倍倍比稀釋至10-10。選擇適宜的3個濃度級取100ul平鋪於普通營養瓊脂平板上，分別作3個平板，37°C培養48h，取菌落數在30300之間的平板作平板計數，該濃度級的3個平板的菌落數的均數推算細菌濃度，為菌落平均數X稀釋倍數X10；同時，各濃度級取lmL，提取DNA，作LAMP檢測。1.8重複性試驗特異度試驗和靈敏度試驗分別重複2次。2結果2.1霍亂弧菌01群LAMP檢測方法的建立2.2特異度試驗霍亂弧菌01群(編號N16961)檢測結果陽性，11株非霍亂弧菌01群均陰性，霍亂弧菌01群的5例樣品及霍亂弧菌01群、沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌4種細菌DNA混合液為陽性，如表2所示。結果顯示試劑盒具有高特異性。tableseeoriginaldocumentpage11擬■靈._2.3靈敏度試驗經菌落平板計數，選擇第9個稀釋度進行讀數，平均菌落數為126cfu，推算細菌原液濃度為1.26X1011cfu/mL,LAMP方法可檢測到第4個稀釋度，為1.26X107cfu/mL。電泳結果也符合上述結果。2.4重複性試驗特異度試驗重複兩次，結果一致。靈敏度試驗重複兩次，數量級一致。SEQUENCELISTING廣州華峰生物科技有限公司，中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局一種霍亂弧菌01群檢測試劑盒及其檢測方法16PatentInversion3.5118DNA人工序列1acatcaccacagcctctt18219DNA人工序列2tcgaacctagaagtgtgtg19347DNA人工序列3agtctttgtgagtgtggtaaagctttttctgctttttttgctcgtcc47451DNA人工序列4aggtcatctgtaagtacaacattccttttgtaaagtaggcttacttgagtt51519DNA人工序列5acccaatactgaggcgata19618DNA人工序列6cacttgcgagtgaagagc18754DNA人工序列7tcaggttattcatattggtggttggtttttaaaggtaattttatccaccttctc54850DNA人工序列8gcaattgaaacgagatccccttgttttgctcataatttttggattcacgt50923DNA人工序列9gagctatggctaatatctttacg231020DNA人工序列10gctaaccaaccattagaagc201151DNA人工序列11aacccaatcgtttgaaaaacctgcttttaaaattatccaaaaaagctcgct511248DNA人工序列12gctaggaagttcaatccagtatgttttttggtttaatcaatgaagcgc481319DNA人工序列13gctcgtccaatgactttga191423DNA人工序列14cctattctgacgtaattattcgt231549DNA人工序列15gttgtacttacagatgaccttggtgtttttttccagctttaccacactc491647DNA人工序列16ccggatatgaatgcggtagtggttttgatgaatcgaacctagaagtg4權利要求一種霍亂弧菌O1群檢測試劑盒，包括BstDNA聚合酶，反應液，樣品預處理液，顯色液，穩定液和陽性對照，其特徵在於還包括以以霍亂弧菌RfbN基因為靶基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的各兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。2.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於所述的霍亂弧菌01群的兩對內外引物序列分別為外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTTSEQIDN01外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTGSEQIDN02內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCCSEQIDN03內引物BIPAGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTTSEQIDN04或外引物F3:ACCCAATACTGAGGCGATASEQIDN05外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGCSEQIDN06內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTCSEQIDN07內引物BIPGCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGTSEQIDN08或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACGSEQIDN09外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGCSEQIDN010內引物FIPAACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCTSEQIDN011內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGCSEQIDN012或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGASEQIDN013外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGTSEQIDN014內引物FIPGTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTCSEQIDN015內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTGSEQIDN016。3.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於所述的內引物FIP/BIP各為0.20.25μmol/L,外引物F3/B3的濃度各為1.22.0μmol/L。4.根據權利要求3所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於內引物FIP/BIP的濃度為0.2「11101/1，外引物？3/83的濃度為1.6μmol/L。5.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於所述的feiDNA聚合酶酶濃度4-10υ/μ1，所述的顯色液為SYBRGreenI或EvaGreen。6.根據權利要求5所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於所述的酶濃度為8υ/μL，所述的顯色液為SYBRGreenI。7.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於所述的反應液含1.62mmol/LdNTPs、2025mmol/LTris-HCl、1012.5mmol/LKCl、1012.5mmol/L(NH4)2S04、810mmol/LMgS04、0.10.125體積％TritonX_100、0.8lmol/L甜菜鹼。8.根據權利要求7所述的沙門氏菌與志賀氏菌聯合檢測試劑盒，其特徵在於所述的反應液含2mmol/LdNTPs、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125體積％TritonX-100、lmol/L甜菜鹼。9.根據權利要求1所述的霍亂弧菌01群檢測試劑盒，其特徵在於所述穩定液為石蠟油；所述的陽性對照為霍亂弧菌01群基因組DNA。10.一種根據權利要求1的試劑盒進行的霍亂弧菌01群檢測方法，其特徵在於包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉澱；(2)將步驟(1)的沉澱加入權利要求1檢測試劑盒中的樣品預處理液，混合均勻，沸水浴滅活後冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA；(3)在反應容器中加入權利要求1檢測試劑盒中的BstDNA聚合酶0.91.8體積份數、反應液3840體積份數、穩定液5254.5體積份數、樣品模板DNA4.59體積份數、內引物FIP/BIP各2體積份數、外引物F3/B3各4體積份數，恆溫反應；其中所述的內引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以霍亂弧菌基因為靶基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的各兩對引物，兩對內外引物序列分別為外引物F3:ACATCACCACAGCCTCTTSEQIDN01外引物B3TCGAACCTAGAAGTGTGTGSEQIDN02內引物FIP:AGTCTTTGTGAGTGTGGTAAAGCTTTTTCTGCTTTTTTTGCTCGTCCSEQIDN03內引物BIPAGGTCATCTGTAAGTACAACATTCCTTTTGTAAAGTAGGCTTACTTGAGTTSEQIDN04或外引物F3ACCCAATACTGAGGCGATASEQIDN05外引物B3:CACTTGCGAGTGAAGAGCSEQIDN06內引物FIPTCAGGTTATTCATATTGGTGGTTGGTTTTTAAAGGTAATTTTATCCACCTTCTCSEQIDN07內引物BIPGCAATTGAAACGAGATCCCCTTGTTTTGCTCATAATTTTTGGATTCACGTSEQIDN08或外引物F3GAGCTATGGCTAATATCTTTACGSEQIDN09外引物B3GCTAACCAACCATTAGAAGCSEQIDN010內引物FIPAACCCAATCGTTTGAAAAACCTGCTTTTAAAATTATCCAAAAAAGCTCGCTSEQIDN011內引物BIP:GCTAGGAAGTTCAATCCAGTATGTTTTTTGGTTTAATCAATGAAGCGCSEQIDN012或外引物F3GCTCGTCCAATGACTTTGASEQIDN013外引物B3CCTATTCTGACGTAATTATTCGTSEQIDN014內引物FIPGTTGTACTTACAGATGACCTTGGTGTTTTTTTCCAGCTTTACCACACTCSEQIDN015內引物BIP:CCGGATATGAATGCGGTAGTGGTTTTGATGAATCGAACCTAGAAGTGSEQIDN016；(4)在上述反應容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。11.根據權利要求10所述的霍亂弧菌01群檢測方法，其特徵在於步驟(3)中所述的恆溫反應的反應條件為溫度6365°C，反應時間4590min。全文摘要本發明涉及一種霍亂弧菌O1群檢測試劑盒，本發明的試劑盒包括BstDNA聚合酶，反應液，樣品預處理液，顯色液，穩定液和陽性對照，還包括以以霍亂弧菌RfbN基因為靶基因、基於環介導恆溫擴增技術設計的各兩對引物內引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發明的霍亂弧菌O1群檢測試劑盒檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低，適用於霍亂弧菌O1群的快速檢測。文檔編號C12Q1/68GK101824482SQ20101019322公開日2010年9月8日申請日期2010年6月7日優先權日2010年6月7日發明者何宇平,馮雪梅,張曉航,張琳,張繼倫,方筠,曹以誠,杜正平,柯佳佳,田楨幹,閻俊,陳洵,韓曉輝申請人:廣州華峰生物科技有限公司;中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局