一種基於聚苯胺納米金複合膜免疫傳感器的製備方法及其應用的製作方法

2023-05-03 08:21:46

專利名稱：一種基於聚苯胺納米金複合膜免疫傳感器的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基於聚苯胺納米金複合膜免疫傳感器的製備方法及其應用，本發明屬於乳品質量檢測技術領域。
背景技術：
金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是一種廣泛存在於自然界的革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌的致病能力主要取決於其產腸毒素和酶的能力。金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin簡稱SE)，是金黃色葡萄球菌分泌的一種細胞外毒素，是一組結構相關，毒力相近的單肽鏈毒性蛋白質。按血清學分類，主要有A、B、Cs、D、 E等血清型，主要存在於肉類，乳類等蛋白質含量較高的食物中。Ses熱穩定性高，在70 80°C 30min內不會被完全破壞，仍有致病性，並且不被胰蛋白酶所降解。
金黃色葡萄球菌腸毒素最初採用的檢測方法就是動物學試驗方法，但是由於實驗動物的來源較困難，而靈敏度又比較低，致使檢測結果不是很理想。酶聯免疫法的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。由於酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的靈敏度。酶聯免疫法靈敏、簡單、快速，並且，技術人員不需要特別訓練，適用於葡萄球菌食物中毒的檢測和鑑定。研究的比較多的是雙抗體夾心法和間接競爭法，其最低檢測量能夠達到lng/ml，且線性範圍良好。酶聯免疫方法效果的優劣很大部分取決於抗體的製備。
90年代以來，以生物傳感器技術為基礎的各類生物檢測系統迅速興起，一些快速和採用現代技術的檢測方法不斷出現，並日趨成熟，不斷的應用於各類毒素的檢測中去。利用表面等離子體共振(SPR)傳感技術針對葡萄球菌腸毒素的檢測最為常見的監測對象是抗原/抗體的相互識別過程，抗原抗體反應特異性強，靈敏度高，重複性好，響應時間往往在十幾分鐘左右。利用Sra技術對葡萄球菌腸毒素B進行測定，其檢出限可達到ng/ml級， 響應時間IOmin左右。發明內容
本發明的目的是提供一種用於檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的免疫傳感器的製備方法。
本發明提供如下技術方案將聚苯胺納米金液體滴塗於經過清潔的金電極表面， 室溫下靜置，待修飾完全後，在修飾好的電極表面上滴加金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，孵育20 lOOmin，以BSA-PBS封閉20 140Min，製得基於聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。
所述金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體為市場上購買或製備得到，製備方法見 Jeremy Μ. Yarwood, John K.McCormick，Michael L Paustian，Vivek Kapur, and Patrick M.Schlievert， Repression of the Staphylococcus aureus Accessory Gene Regulatorin Serum and In Vivo, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb. 2002,p.1095-1101。所述聚苯胺納米金液體是將HAuCl4溶解於水中，待其沸騰，加入檸檬酸鈉溶液，反應5-15min後，依次加入氫氧化鈉溶液、苯胺溶液、過硫酸鈉溶液，攪拌條件下沸騰 20-50min,停止加熱，攪拌至室溫。優選地，所述聚苯胺納米金液體製備方法如下將250 μ L 4%的HAuCl4溶解於 IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應8min後，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL"1的苯胺溶液1000 μ L、0. ImoIL"1的過硫酸鈉溶液1500 μ L， 攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至室溫。優選地，金電極清潔方法如下將金電極(φ = 2mm)置於Piranha溶液中浸泡 15Min,依次用0. 3，0. 05 μ m的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1 (體積比) 的硝酸、無水乙醇、超純水超聲清洗5min，氮氣吹乾，4°C備用；優選地，在修飾好的電極表面上滴加IOul 200 900ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育20 lOOmin，以1 % BSA_PBS37°C下封閉20 140Min，製得基於聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。上述抗體濃度為700ug/ml時，材料所結合的抗體達到飽和狀態，若抗體濃度過高，則會造成抗體的浪費；上述抗體孵育時間為60min，當抗體濃度為60min時，抗體能夠最大程度的結合在材料上；所述的封閉時間為120min，當封閉時間達到120min時，1 % BSA-PBS能夠較好的封閉住抗體的未結合位點。本發明還提供了一種所述免疫傳感器的應用，步驟如下取出已修飾完成的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫電極，依次滴加10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品37°C孵育5 30min後，採用循環伏安法和交流阻抗法考察工作電極界面的變化，並對電極表進行表徵。CV測試條件電壓0. 2-0. 6V，掃描速率0. lV/s ；EIS測試條件初幅0. 05V，頻率為 1 100kHz，靜置時間2s。反應介質液為2. 5mmolFe (CN)63^溶液(所有測試均在室溫下進行)。所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品孵育時間為5 30min，優選地，所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品孵育時間為25min，當孵育時間達到25min時，金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體能夠充分與金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品反應。所述依次滴加的不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品的濃度為0. 1、0.5、 l、2、3、4、5、6、7、8ng/ml，模擬電路得到阻抗值，以金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品濃度為橫坐標，阻抗值的大小為縱坐標作圖，得到金黃色葡萄球菌腸毒素B自組裝免疫電極檢測的標準曲線。阻抗值的大小與金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品的濃度分別在0. 1 Sng/ ml之間存在良好的線性關係，線性方程分別為Y = 1262. 2x+1540. 8，相關係數分別為R2 = 0. 9932，最低檢測限為0. 033ng/ml。金黃色葡萄球菌腸毒素B的分析方法如下電化學工作站CHI760在初幅0. 05V, 頻率為1 IOOkHz的條件下，在反應介質液為2. 5mm0lFe(CN)63-/4-溶液中進行測量，採用 EIS法，並通過最佳等效電路計算，以工作電極經BSA封閉後的阻抗值作為空白交流阻抗值 Ret(Ab)，以此電極與含有不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品中反應後在同一電解液中所測阻抗值為Rrt (Ab-Ag)，求出在不同金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品濃度中Rrt的變化值 ARrt:Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)Ret (Ab)空白交流阻抗值；Ret(Ab-Ag)與金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品反應後的電極電子傳遞電阻值；ARet 反應前後極電子傳遞電阻的變化值；以電子傳遞電阻的變化值和金黃色葡萄球菌腸毒素B標準溶液濃度的關係作圖， 即得金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫傳感器的檢測標準曲線。金黃色葡萄球菌腸毒素B的回收率將樣品以PBS(PH = 7. 4)稀釋至一定濃度後，應用自組裝免疫傳感器對樣品進行加標回收測定。本發明的方法具有下述有益效果(1)聚苯胺納米金複合膜結構改善了納米金離子的分散性，有效的阻止了金的聚合，從而使其分散的更為均勻。(2)聚苯胺納米金複合膜結構有效的促進了電子的轉移，進而有效的提高材料本身的傳導性，大大降低了檢測限。(3)自組裝免疫傳感器能夠結合多種材料的優點，充分發揮抗原抗體特異性結合的優勢，極大的降低檢測限。


圖1表示自組裝免疫傳感器的組裝示意圖。
具體實施例方式實施例1 免疫傳感器的製備方法步驟A:將250yL 4%的HAuCl4溶解於IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應8min後，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL—1的苯胺溶液1000 μ L、0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至
室溫；步驟B 將金電極(Φ = 2mm)置於Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3， 0.05μπι的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1(體積比)的硝酸、無水乙醇、 超純水超聲清洗5min，氮氣吹乾，4°C備用；步驟C 將步驟A得到的聚苯胺納米金液體滴塗於步驟B中徹底清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全後，在修飾好的電極表面上滴加IOul 700ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育60min，以1 % BSA_PBS37°C下封閉120Min，製得基於聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。實施例2 免疫傳感器的製備方法步驟A:將250yL 4%的HAuCl4溶解於IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應8min後，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL—1的苯胺溶液1000 μ L、0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至
室溫；
步驟B 將金電極(Φ = 2mm)置於Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3， 0.05μπι的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1(體積比)的硝酸、無水乙醇、 超純水超聲清洗5min，氮氣吹乾，4°C備用；步驟C 將步驟A得到的聚苯胺納米金液體滴塗於步驟B中徹底清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全後，在修飾好的電極表面上滴加IOul 200ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育20min，以1 % BSA_PBS37°C下封閉20Min，製得基於聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。實施例3 免疫傳感器的製備方法步驟A:將250yL 4%的HAuCl4溶解於IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應8min後，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL—1的苯胺溶液1000 μ L、0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至
室溫；步驟B 將金電極(Φ = 2mm)置於Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3，
0.05μπι的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1(體積比)的硝酸、無水乙醇、 超純水超聲清洗5min，氮氣吹乾，4°C備用；步驟C 將步驟A得到的聚苯胺納米金液體滴塗於步驟B中徹底清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全後，在修飾好的電極表面上滴加IOul 900ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育lOOmin，以BSA_PBS37°C下封閉140Min，製得基於聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。實施例4 取出已修飾完成的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫電極，依次滴加10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品37°C孵育5 30min後，採用循環伏安法和交流阻抗法考察工作電極界面的變化，並對電極表進行表徵。CV測試條件電壓0. 2-0. 6V，掃描速率0. lV/s ；EIS測試條件初幅0. 05V，頻率為 1 100kHz，靜置時間2s。反應介質液為2. 5mmolFe (CN)63^溶液(所有測試均在室溫下進行)。所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品孵育時間為5 30min，優選地，所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品孵育時間為25min，當孵育時間達到25min時，金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體能夠充分與金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品反應。所述依次滴加的不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品的濃度為0. 1、0.5、
1、2、3、4、5、6、7、8ng/ml，模擬電路得到阻抗值，以金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品濃度為橫坐標，阻抗值的大小為縱坐標作圖，得到金黃色葡萄球菌腸毒素B自組裝免疫電極檢測的標準曲線。阻抗值的大小與金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品的濃度分別在0. 1 Sng/ ml之間存在良好的線性關係，線性方程分別為Y = 1262. 2x+1540. 8，相關係數分別為R2 = 0. 9932，最低檢測限為0. 033ng/ml。金黃色葡萄球菌腸毒素B的分析方法如下電化學工作站CHI760在初幅0. 05V, 頻率為1 IOOkHz的條件下，在反應介質液為2. 5mm0lFe(CN)63-/4-溶液中進行測量，採用 EIS法，並通過最佳等效電路計算，以工作電極經BSA封閉後的阻抗值作為空白交流阻抗值 Ret(Ab)，以此電極與含有不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品中反應後在同一電解液中所測阻抗值為Rrt (Ab-Ag)，求出在不同金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品濃度中Rrt的變化值 ARrt:Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)Ret (Ab)空白交流阻抗值；Ret(Ab-Ag)與金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品反應後的電極電子傳遞電阻值；ARet 反應前後極電子傳遞電阻的變化值；以電子傳遞電阻的變化值和金黃色葡萄球菌腸毒素B標準溶液濃度的關係作圖， 即得金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫傳感器的檢測標準曲線。金黃色葡萄球菌腸毒素B的回收率將樣品以PBS(PH = 7. 4)稀釋至一定濃度後，應用自組裝免疫傳感器對樣品進行加標回收測定。根據上述測定方法與分析方法得到脫脂乳粉在^g/ml的加標濃度下的回收率為 92%。實施例5 根據實施例4測定方法與分析方法得到脫脂乳在0. 5ng/ml的加標濃度下的回收率為84%。實施例6 根據實施例4測定方法與分析方法得到鮮牛乳在^g/ml的加標濃度下的回收率為 111%。
權利要求
1.一種基於聚苯胺納米金複合膜免疫傳感器的製備方法，其特徵在於，將聚苯胺納米金液體滴塗於經過清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全後，在修飾好的電極表面上滴加金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，孵育20 lOOmin，以BSA-PBS封閉20 140Min，製得基於聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述聚苯胺納米金液體製備方法如下將 HAuCl4溶解於水中，待其沸騰，加入檸檬酸鈉溶液，反應5-15min後，依次加入氫氧化鈉溶液、苯胺溶液、過硫酸鈉溶液，攪拌條件下沸騰20-50min，停止加熱，攪拌至室溫。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述聚苯胺納米金液體製備方法如下將250 μ L 4%的HAuCl4溶解於IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應8min後，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. ImoIL"1的苯胺溶液1000 μ L、 0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至室溫。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，金電極清潔方法如下將金電極置於 Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3、0. 05 μ m的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用體積比1 1的硝酸、無水乙醇、超純水超聲清洗5min，氮氣吹乾，4°C備用。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體滴加量為 200 900ug/ml。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體滴加量為 700ug/ml。
7.—種權利要求1所述方法構建的免疫電極的應用，其特徵在於，步驟如下取出已修飾完成的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫電極，依次滴加10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品37°C孵育5 30min後，採用循環伏安法和交流阻抗法考察工作電極界面的變化，並對電極表進行表徵。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標準品孵育時間為25min。
全文摘要
本發明涉及一種基於聚苯胺納米金複合膜免疫傳感器的製備方法及其應用，通過製備聚苯胺納米金複合膜，提高了材料自身傳導性，並成功應用於免疫傳感器中，極大的降低了傳感器的檢測限並獲得了更好的穩定性，採用循環伏安法及交流阻抗法對傳感器進行表徵與測定，建立了金黃色葡萄球菌腸毒素B檢測標準曲線，線性範圍在0.1～8ng/ml之間，相關係數為R2＝0.9932，檢測限為0.033ng/ml(S/N＝3)。本發明特異性良好，乳品檢測回收率在84～111％之間，可再生使用，穩定性好，可應用於乳品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B快速檢測，具有非常廣泛的應用前景。
文檔編號G01N27/327GK102520187SQ20111037755
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月23日 優先權日2011年11月23日
發明者吳龍雲, 孫秀蘭, 張銀志, 李在均, 田秀梅, 高博 申請人:江南大學