具有接觸侵入能力的rna病毒載體的製作方法

2023-05-03 03:21:16

專利名稱：具有接觸侵入能力的rna病毒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種能用於基因治療的病毒載體，更具體地說，涉及一種滅活的負鏈RNA((-)RNA)病毒載體。
背景技術：
在人和動物的基因治療中，有效性和安全性非常重要。特別是，在使用了通過病毒基因重組得到的「病毒載體」的療法中，當難以判斷非特異性染色體整合、重組或病原性病毒洩露到自然界，以及導入基因的失控表達等情況的概率時，即使療法很有效也必須非常小心地進行治療。
病毒載體主要用於藉助病毒的感染性將目的基因導入靶細胞。已經通過基因工程攜帶上基因插入片段的重組病毒載體表面含有病毒的包膜蛋白。由於包膜蛋白維持著病毒的感染性，就有可能使它內在的重組基因插入片段導入到細胞中。這些載體可以用於基因治療，也可以用於製備表達目的基因的細胞以及產生轉基因動物。
病毒載體分為三類逆轉錄病毒載體、DNA病毒載體和RNA病毒載體。其中，就安全性而言，那些不會整合到染色體中的RNA病毒載體較有利。根據這一技術背景，已有人提供了來源於非分節段的(-)RNA病毒比如仙臺病毒的病毒載體(D.Yu等，基因到細胞(Genes to Cells)2:457-466,1997；M.Hasan等，普通病毒學雜誌78:2813-2820,1997)。本發明人建立了一種(-)RNA病毒載體，它有感染性和自主的RNA複製能力，但沒有散布能力(WO97/16538)。
發明公開本發明的一個目的是提供一種能用於基因治療的RNA病毒載體。
利用仙臺病毒(一種代表性(-)RNA病毒，被認為是就安全性和便利性來說，最適合工業應用的載體)的核酸，本發明人成功地獲得了多種缺陷突變體，它們是利用已知方法實驗重建的。結果本發明人發現由攜帶M基因缺陷的突變體重建的複合體能形成噬斑，這些噬斑比野生型病毒所形成的小，但不能在雞胚中增殖。因此，發明人認定所述突變體能感染細胞、自主複製RNA和接觸侵入，但不能散布。此外，M基因帶有缺陷的缺陷型突變體所形成的噬斑能被抗仙臺病毒的抗體染色，不能被抗M的單克隆抗體染色。從這個結果發明人確定由M突變體形成的噬斑缺少完整的M蛋白，這樣就實現了本發明。
因此，本發明提供了這樣一種RNA，該RNA包含參與接觸侵入和自主RNA複製的基因，但沒有參與散布的基因或該基因失活。
本發明還提供了一種細胞，它包含上面描述的RNA，能讓所述RNA在其中複製並通過接觸侵入將該RNA傳遞到另一個細胞中。
此外，本發明提供了一種複合體，它能感染細胞、接觸侵入和自主RNA複製，但不能散布；還提供了製備該複合體的方法、製備該複合體的試劑盒和宿主。
再次，本發明提供了一種DNA，它包含體外或細胞內轉錄以上描述的RNA的模板DNA。
文中病毒載體的「細胞感染性」意味著「病毒載體發生細胞粘附和膜融合以便將內源核酸導入細胞的能力」。「散布能力」意味著「核酸具有的藉助人工或者感染導入細胞以便該核酸在細胞內複製後形成感染顆粒或與此相當的複合體，並向另一細胞傳遞的一種能力」。「接觸侵入能力」意味著「攜帶病毒載體基因的細胞將該基因通過接觸轉移給另一個細胞的能力」。
能接觸侵入但不能散布的病毒載體可以克服現有的散布和接觸侵入能力都不具備的病毒載體的一個重要缺點。換句話說，當細胞感染了病毒載體而表達該載體中的一個基因插入片段時，現有病毒載體只能在被直接感染的細胞中表達蛋白質。在使用細胞培養物體系時這不成問題，這種情況中細胞長成單層，可以用病毒載體直接感染。但是，當用病毒載體感染那些立體地存在於多層中的體內細胞時，被現有載體直接感染的細胞區域和數量就很有限。例如，要用病毒載體直接感染腫瘤部位所有的腫瘤形成細胞非常困難。
相反，利用本發明所述能夠接觸侵入的病毒載體來感染腫瘤部位的腫瘤細胞，即使只有部分細胞被直接感染，鄰近感染細胞的那些未感染細胞也可以通過接觸侵入感染上載體，使得所有腫瘤細胞被感染。由於載體不是散布性的，它不可能通過血流感染體內的其它細胞。
因此，本發明的病毒載體具有這樣的新特點，即它能感染有限區域或特定器官中的所有細胞，而不感染身體其它部分。
此外，攜帶本發明所述能感染細胞、自主RNA複製和接觸侵入，但不能散布的病毒載體的細胞可以用於細胞移植。由於攜帶能自主複製並接觸侵入的病毒載體的細胞能將所述載體轉移給另一個細胞，即有可能以最小劑量將帶有所述載體的細胞移植到患病部位，從而治療該處。
有報導說M基因中有缺陷的麻疹病毒感染顆粒的形成受到抑制時，細胞融合會提高(T.Cathomen等，EMBO雜誌17:3899-3908,1998)。但是，它沒有暗示利用該病毒作為載體的可能性。
本發明所述(-)RNA病毒的來源包括仙臺病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒以及副粘病毒科的犬瘟病毒；正粘病毒科的流感病毒，水皰S和棒狀病毒科的狂犬病毒。也可以使用不完全病毒比如DI顆粒(病毒學雜誌68:8413-8417,1994)和合成性寡核苷酸。
衍生自以上描述的任何病毒的重組(-)RNA病毒也可以作為載體來源。例如，所述重組(-)RNA病毒可以是抗原性基因失活的病毒或者某些基因被改變，RNA轉錄或複製效率得以提高的病毒。
可以通過在體外或細胞內轉錄一個來源於以上描述的任何病毒或重組病毒的改變的cDNA獲得本發明的RNA。在得到的RNA中，原始病毒散布能力所涉及的基因至少有一個必須被缺失或失活，但參與自主複製和接觸侵入的基因不應被缺失或失活。另外，還可以使用帝有人工序列的RNA分子，它是通過在體外或細胞內轉錄這樣一個DNA製備的，通過將自主複製基因插入含有病毒基因組(比如DI分子)兩端結構的cDNA中可以得到該DNA。
在仙臺病毒中，「參與自主複製的基因」是NP、P/C或L基因，「參與傳播的基因」是M、F或HN基因。只將M基因缺失或失活時，將失去「散布能力」，但會保留「接觸侵入能力」因為不能形成將含有基因組RNA之複合體釋放到胞外的病毒體或病毒樣顆粒。因此，例如，只在M基因中有缺陷的仙臺病毒Z株的RNA和含有該RNA的核糖核蛋白(RNP)適用於本發明。所述基因不必與原始的病毒序列相同。可以將它們突變或者用其它病毒的相應基因來取代，只要所得基因的轉錄和複製活性與野生型的相當或更高。
本發明的RNA可以含有插入適當位點的外來基因。為了表達所需蛋白質，插入編碼該蛋白質的外來基因。就仙臺病毒RNA(GenBank登錄號M30202)而言，是在R1和R2序列之間有多個6鹼基片段的序列(病毒學雜誌67(8),1993,4822-4830)。R1和R2的共有序列分別是5』-AGGGWBAAWGD-3』和5』-DTAAGAAAAA-3』。可以通過插入位置或者所插入外來基因的旁側RNA核苷酸序列來調節所述插入基因的表達水平。例如，已知對於仙臺病毒RNA，插入位置越接近NP基因，插入基因的表達水平越高。
本發明的複合體包含一個不帶有以上描述的RNA和核酸的病毒結構。「沒有核酸的病毒結構」是，例如，這樣一個病毒，只去掉其RNA，但補充本發明所述RNA的感染性和自主複製能力，不使其具備形成病毒顆粒(它能將複合體釋放到胞外，並自由移動)的能力，換句話說，不補充散布能力。在仙臺病毒中，只缺失M基因的RNA與去除了RNA和M蛋白的病毒結構形成的複合體(RNP)具有感染性和自主複製能力，但沒有散布能力。所述複合體可以含有其它成分，只要它們不表現出散布能力。例如，包膜表面上可以包含能結合特定細胞的分子，比如粘附分子、配體或受體。
此外，本發明涉及一種試劑盒，它包含a)以上描述的本發明的RNA，所述RNA的cRNA，或者能生物合成所述RNA或cRNA的單位，以及b)複製所述RNA或cRNA所需的一組酶，或者能生物合成這些酶的單位。可以通過將a)和b)單位導入適當的宿主來製備本發明所述能感染細胞、自主複製RNA和接觸侵入，但不能散布的複合體。製備本發明所述複合體意味著重建一個具有自主複製能力的RNP。當來源於仙臺病毒的RNA用於a)時，b)優選來自仙臺病毒的所有NP、P/C和L蛋白或能生物合成所述蛋白質的單位。
宿主沒有限制，只要它能保證所用病毒RNA在其中進行表達。當使用來源於仙臺病毒的RNA時，可以用容易被仙臺病毒感染的任何細胞，包括培養的哺乳動物細胞、培養的鳥類細胞和雞胚。培養細胞的例子是LLCMK2、MDCK、MDBK、CV-1、Hela、HepG2、P19、F9、CHO、PC12、293細胞、BAF3、Jerkat、人PBMC、MT-4、Molt-4、NIH3T3、L929、雞胚成纖維細胞等。
本發明人已證明要導入細胞的仙臺病毒cDNA是線形時，比環形能更有效地重建病毒顆粒，(+)RNA在細胞中能比(-)RNA更成功地形成病毒顆粒(A.Kato等，基因到細胞1:569-579,1996)。雖然這些情況並非適合所有其它(-)RNA病毒的重建，但根據本說明書的描述和常規技術，有可能確定重建其它(-)RNA病毒的合適條件。
可以通過常規方法從宿主，例如培養細胞或雞胚中回收所製備的複合體。
可以通過用所述複合體感染細胞來表達構成該複合體的RNA所編碼的外源基因。即，可以通過將所述複合體或帶有複合體的細胞接種到宿主(比如雞胚或動物體內的合適組織)中來原位表達外來基因。替代的作法是，轉化由活體收穫的細胞以使所述複合體能自主複製，將轉化的細胞送回活體使細胞表達外來基因。
作為本發明的一個實施方案，圖9顯示了用其M基因被缺失或失活的仙臺病毒複合體感染靶細胞，以及經接觸侵入使本發明所述RNA侵入到周圍未被感染的細胞中的過程。
附圖簡述

圖1示意質粒pUC18/T7(+)HVJRz的結構。
圖2示意仙臺病毒cDNA中帶有M基因的區域以及該區域的亞克隆或突變步驟。在該圖中，E代表轉錄終止序列；I，間插序列；S，轉錄起始序列。盒子指示用於質粒構建的限制位點。
圖3示意向仙臺病毒cDNA的M基因區引入突變的步驟。A中上面顯示仙臺病毒基因組的結構，NP、P(P/C)、M、F、HN和L基因各自的位置。下面顯示M基因的結構，限制位點以及用於構建M缺陷型的引物M1和M2的位置。B和C分別示意了M缺陷型和M缺失型的構建過程。劃叉的限制位點表明它們被突變，不能被酶消化。D顯示M缺陷和野生型M基因在核苷酸和胺基酸序列方面的比較。M缺陷序列中的點表示這些鹼基或胺基酸與相應野生型序列相同。[Ter]表示一個終止密碼子。編號表示M基因序列中的鹼基/胺基酸位置。
圖4示意了亞克隆仙臺病毒cDNA中M基因區的步驟。劃叉的限制位點表明它們被突變，不能被酶消化。
圖5示意通過突變亞克隆的仙臺病毒M基因區以及用突變的M基因區代替仙臺病毒cDNA中的全長M基因區來構建M缺失型cDNA。劃叉的限制位點表明它們被突變，不能被酶消化。
圖6示意通過突變亞克隆的仙臺病毒M基因區以及用突變的M基因區代替仙臺病毒cDNA中的全長M基因區來構建M缺陷型cDNA。劃叉的限制位點表明它們被突變，不能被酶消化。
圖7顯示野生型(WT1和WT2)、M缺陷型(dM)和M缺失型(dMEA2-1和dMEA2-2)仙臺病毒cDNA的噬斑。
圖8顯示野生型(WT)、M缺陷型(dM)和M缺失型(dMEA)仙臺病毒cDNA的噬斑，它們用抗仙臺病毒抗體染色。
圖9闡述了野生型仙臺病毒基因組(上面)和帶有突變的M基因或不帶M基因的突變體(下面)的仙臺病毒基因組接觸侵入的過程。野生型形成感染性病毒顆粒，導致接觸侵入，而突變體不能形成感染性顆粒但能通過接觸侵入將其基因組導入未被感染的周圍細胞中。
實施發明的最佳方式以下將參照實施例詳細闡述本發明，但不應理解為對發明的限制。
實施例1仙臺痛毒M基因的亞克隆所有以下連接、鈍化和去磷酸化分別用Takara連接試劑盒2代(TakaraShuzo,Kyoto,Japan)、Takara鈍化試劑盒(Takara Shuzo)和CIAP(TakaraShuzo)，按照產品所附製造商的實驗方案進行操作。通過Sanger法(Sanger，科學214:1205-1210,1981)確定核苷酸序列。
利用野生型cDNA、pUC18/T7(+)HVJRz(A.Kato等，基因到細胞1:569-579,1996)，如下構建M基因缺失的互補DNA(圖1)。M基因和它附近的DNA序列如圖2所示，構建方案如圖3所示。
首先，從pUC18/T7(+)HVJRz中切下含有M基因的ClaⅠ片段，插入pHSG396(Takara Shuzo)中的ClaⅠ位點從而得到pHSG-M-CC(圖4)。另外，用ApaLⅠ消化pHSG396，鈍化並自連接得到缺少ApaLⅠ位點的pHSG396-dA(圖4)。將pHSG-M-CC中帶有M基因的EcoRⅠ-BamHⅠ片段插入去磷酸化的EcoRⅠ-BamHⅠ消化過的pHSG396-dA從而得到pHSG396-dA-M-BE(圖4)。
實施例2．M缺失型載體的構建將49-mer的合成寡核苷酸5』-ggcgatatctatagattccctaagttctcatagtagatgtgcaccggca-3』(EA接頭F)(SEQ ID NO:1)和5』-tgccggtgcacatctactatgagaacttagggaatctatagatatcgcc-3』(EA接頭R)(SEQ ID NO:2)退火併插入pCR2.1(Invitrogen)從而產生pCR-EAL。核實插入片段的核苷酸序列是否與設計相同。
用EcoRⅤ和ApaLⅠ消化pCR-EAL，並切下接頭片段。另外，用EcoRⅤ和ApaLⅠ消化pHSG396-dA-M-BE，將上面的接頭片段插入得到pHSG-dA-dM-EA-EB。
用EcoRⅠ消化pHSG396，鈍化，並自連接得到缺少EcoRⅠ位點的質粒，後者再用BamHⅠ消化，鈍化並自連接得到pHSG-dE-dB，該質粒缺少EcoRⅠ和BamHⅠ位點。
將帝有M基因的ClaⅠ片段插入pHSG-dE-dB中的ClaⅠ位點以便產生pHSG-dE-dB-M-CC。將從pHSG-dA-dM-EA-EB中切下的EcoRⅠ-BamHⅠ片段插入EcoRⅠ-BamHⅠ消化過的pHSG-dE-dB-M-CC中得到pHSG-dE-dB-dM-CC。
將pHSG-dE-dB-dM-CC的ClaⅠ片段插入pUC18/T7(+)HVJRz中的ClaⅠ位點得到pHVJ-dMEA。以上構建方案如圖5所示。
實施例3．構建M缺陷型載體以pUC18/T7(+)HVJRz作為模板與寡核苷酸引物M-1(5』-ttaaaggcctaaaccgatctcagaattacg-3』)(SEQ ID NO:3)和M2(5』-tatcattccctcactcagcctgcc-3』)(SEQ ID NO:4)作PCR。設計引物以便在M基因的BsgⅠ位點引入一個突變，從而使M基因讀框中出現一個終止密碼子。將PCR產物亞克隆到pCR2.1中得到pCR-M(圖6)。
確認pCR-M的核苷酸序列後，從膠中回收pCR-M的StuⅠ-XcmⅠ片段，並插入StuⅠ-XcmⅠ切割過的pHSG-M-CC中。所得質粒命名為pHSG-dM-CC。將pHSG-dM-CC的ClaⅠ片段插入pUC18/T7(+)HVJRz中的ClaⅠ位點得到pHVJ-dM。這個構建方案如圖6所示。
實施例4．由M缺失型和M缺陷型cDNA重建病毒體如下所述由野生型(WT)、M缺失型(dMEA)和M缺陷型(dM)cDNA來重建病毒體。
通過胰蛋白酶處理使培養的LLCMK2細胞(一種猴腎細胞系)從培養皿上脫落下來，將2×106個細胞鋪在一個直徑10cm的塑料培養皿中，在補充了10％FBS(Gibco BRL)的MEM培養基(Gibco BRL)中於37℃在5％CO2中溫育24小時。然後移去培養基，用PBS將細胞洗一次。將500μl vTF7-3溶液、能夠表達T7噬菌體RNA聚合酶的重組痘苗病毒載體(T.R.Fuerst等，美國科學院學報83:8122-8126,1986)滴加到培養皿中，所述載體已用PBS稀釋到8×106pfu/ml以使MOI(感染複數)達到2。將細胞感染1小時，每15分鐘搖動一次培養皿以便使病毒溶液鋪滿整個培養皿。
另外，如下製備含有cDNA溶液的培養基。首先，向聚苯乙烯試管中加入500μl不含FCS(胎牛血清)的Opti-MEM(Gibco BRL)，然後加入pUC18/T7(+)HVJRz、pHVJ-dMEA或pHVJ-dM(這些質粒均來源於仙臺病毒cDNA)之任一(20μg)、pGEM-NP(5μg)、pGEM-P(2.5μg)和pGEM-L(5μg)。再加入50μl SuperFect(QIAGEN)，讓混合體系於室溫保持20分鐘。然後加入10ml Opti-MEM。隨後，加入終濃度分別為100μg/ml和40μg/ml的利福平和阿糖胞苷(AraC)。
感染1小時後，從以上含有LLCMK2細胞的培養皿中移去病毒液，向培養物中傾注入含有上述cDNA溶液的培養基，將細胞於37℃在5％CO2中保溫48小時。用細胞刮刀刮下細胞，不要除去培養基，將細胞和培養基一起轉移到1個15ml的離心管中。於1200rpm離心5分鐘後，移去上清液，將沉澱的細胞重懸於200μl PBS中。
實施例5．向雞胚接種細胞懸液以及HA檢測為了評價病毒重建情況，作一個使用雞胚的檢測。將懸浮在200μl PBS中的實施例4所獲細胞調節為1×107細胞/ml，然後用PBS連續稀釋以便獲得1×106細胞/ml和1×105細胞/ml的細胞懸液。用24G針頭將懸液各100μl通過氣室一端接種10天齡的雞胚。
雞卵於35.5℃振蕩保溫3天。然後切下氣室處的蛋殼，用一個帶有18G針頭的10ml注射器收集尿液。
通過HA檢測法來檢查收集到的尿液以便評價病毒在雞胚中的增殖情況。HA檢測如下進行。
將50μl PBS分加到96孔圓底培養板第2到12行的每個孔中。向第1行加入100μl尿樣。取第1行的50μl樣品與第2行的PBS混合製得1∶2稀釋液。50μl 1∶2稀釋液與第3行的PBS混合得到1∶4稀釋液。重複該步驟，製備兩倍倍比稀釋液。
向所有行中加入50μl用PBS稀釋過的1％儲存雞血液(Cosmo Bio)，將培養板於4℃保持1小時。肉眼觀察紅細胞凝集現象，產生凝集的最高稀釋度作為HA活性(表1)。
表1

所用病毒cDNA是病毒的野生型(pUC18/T7(+)HVJR；WT)、M缺陷型(pHVJ-dM；dM)和M缺失型(pHVJ-dMEA；dMEA)。對於M缺失型，顯示了兩個實驗的結果(dMEA2-1和dMEA2-2)。野生型病毒顯示出16以上的活性，而其他樣品沒有顯著活性。這個結果表明M基因缺失或缺陷的仙臺病毒cDNA在常規重建實驗中不產生具有散布能力的病毒。
實施例6．噬斑形成將CV-1細胞以5×105細胞/孔的濃度鋪在6孔培養板(Corning,6-孔微滴板)上，過夜培養。
用PBS將實施例4中得到的LLCMK2細胞稀釋到1×106細胞/ml，取100μl懸液分加到1.5ml微量管(Eppendorf)中。將部分懸液反覆凍融3次-80℃冷凍10分鐘，室溫在水中融化3分鐘。向所有細胞懸液中加入終濃度0.75μg/ml的胰蛋白酶，混合體系在37℃溫育30分鐘。
移去CV-1細胞培養板中的培養基，用PBS將細胞洗1次，然後覆蓋上100μl上述用胰蛋白酶處理過的稀釋細胞懸液。混合物保溫1小時，每15分鐘搖動一次以便使懸液鋪滿整板。用3ml含有1％瓊脂的1×MEM覆蓋培養板，該MEM補充了0.1％BSA、利福平100μg/ml、Ara C 40μg/ml和胰蛋白酶0.75μg/ml，並預熱到45℃左右。等瓊脂凝固後，將培養板反轉，於37℃在5％CO2中培養5天。
然後，向瓊脂上加入1ml固定液(乙醇∶乙酸=5∶1)，培養板在室溫保持90分鐘。然後除去瓊脂，加入200μl胺黑溶液(0.5％胺黑、乙醇∶乙酸∶水=45∶10∶45)。之後立即用水清洗細胞並染色，計噬斑數目，評價噬斑形狀。結果如表2和圖7所示。
表2M基因缺失或缺陷的仙臺病毒的重建效率

所用病毒cDNA是病毒的野生型(pUC18/T7(+)HVJR)、M缺陷型(pHVJ-dM)和M缺失型(pHVJ-dMEA)。對於M缺失型，顯示了兩個實驗的結果(dMEA2-1和dMEA2-2)。凍融過的和沒有冷凍的細胞懸液的噬斑數目均進行了計數。噬斑數目反映了在1×105個轉染的LLCMK2細胞中重建病毒的數目。使用凍融樣品的實驗進行了2次(第1和第2輪)。雖然有報導說仙臺病毒的重建效率在突變病毒(比如在基因組中插入了一個外來基因的附加型)中下降(Hansan等，普通病毒學雜誌78:2813-2820,1997),M缺失型顯示出與野生型相當的重建效率。M缺陷型呈現略低的效率。轉染細胞的凍融沒有顯著影響噬斑數目。
由表2和圖7清晰可見，能觀察到認為是來源於M缺失型和M缺陷型cDNA的噬斑。噬斑的大小比同時形成的野生型陽性對照(圖7,WT1和WT2)小得多。為了進一步檢驗噬斑的形狀，用抗仙臺病毒多克隆抗體將其染色，所述抗體是由已知方法通過以純化的滅活後作為抗原的仙臺病毒接種兔子製備來的。
用抗仙臺病毒抗體與實施例6中描述的並已固定和用胺黑染色的噬斑進行雜交，接著用偶聯FITC的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗體雜交，然後在螢光顯微鏡下觀察。結果是，在野生型、M缺失型和M缺陷型cDNA形成的噬斑中檢測到信號，證實這些噬斑是仙臺病毒形成的噬斑(圖8)。
觀察到野生型cDNA的噬斑是接近圓形的，而M缺失和M缺陷型cDNA形成的噬斑小，並且不圓，具有不規則的形狀(圖8)。
實施例7．噬斑的抗體染色為了確定與野生型在大小和形狀上不同的噬斑來源於M缺失型或M缺陷型cDNA，檢查是否存在M蛋白。即，用抗M蛋白的單克隆抗體將這些噬斑染色，並在螢光顯微鏡下觀察。
如下進行噬斑的免疫螢光染色。
用胺黑將噬斑染色。肉眼檢查噬斑的位置並用記號筆標記。用1ml PBS將6孔培養板的每個孔洗一次，覆蓋上200μl 1∶40稀釋的抗M蛋白單克隆抗體，於37℃在CO2培養箱中保溫45分鐘。然後用1ml PBS將孔洗三次，覆蓋上200μl1∶100稀釋的偶聯FITC的抗小鼠IgG抗體(Cosmo Bio)，於37℃在培養箱中保溫45分鐘。最後，每個孔用1ml PBS洗三次，覆蓋上1ml PBS。然後在螢光顯微鏡下檢驗標記噬斑的染色情況。
在這之後，以抗仙臺病毒多克隆抗體作為一抗，偶聯FITC的抗兔IgG抗體(ICN Biomedicals)作為二抗重複與上面相同的步驟。然後再在螢光顯微鏡下觀察各孔。
抗仙臺病毒抗體和抗M蛋白單克隆抗體均能將來自野生型cDNA的噬斑染色。相反，來自M缺失或缺陷型cDNA的噬斑能被抗仙臺病毒抗體染色，但不被抗M蛋白的單克隆抗體染色。這表明後一類噬斑缺少完整M蛋白，確實來源於M缺失或缺陷型cDNA。
據此，獲得了來源於發生M基因缺失或缺陷的仙臺病毒基因的噬斑。由於形成噬斑的病毒不能在雞胚中增殖，可以認為病毒不能出芽，即不是散布性的。另外，因為病毒能形成噬斑，認為它能接觸侵入。
這種模式的增殖可能是由於F和HN蛋白介導的細胞融合造成的。即，在仙臺病毒編碼的蛋白質中，F和HN蛋白被表達為細胞表面的膜蛋白，M蛋白在病毒出芽中作為一個胞內的錨支撐F和HN蛋白。在M缺失和缺陷型的情況下，由於丟失了錨，不發生出芽。然而F和HN蛋白表達在細胞表面上，而細胞融合由這些蛋白質介導，因此病毒基因組能轉移到周圍的細胞中。這樣，就有可能實現病毒的增殖而不出芽(圖9)。
工業用途利用本發明能提供一種RNA病毒載體，它具有感染細胞、自主RNA複製和接觸侵入的能力，但不能散布。通過利用本發明所述RNA病毒載體，即可能在基因治療時實現更有效的基因導入和細胞移植。
序列表110DNAVEC ResearchInc.120具有接觸侵入能力的RNA病毒載體130D3-002PCT140141150JP1998-2273981511998-08-111604170PatentIn Ver.2.0210121149212DNA213人工序列220223人工序列的描述EcoRⅤ-ApaL1接頭4001ggcgatatct atagattccc taagttctca tagtagatgt gcaccggca 49210221149212DNA213人工序列220223人工序列的描述EcoRⅤ-ApaL1接頭4002tgccggtgca catctactat gagaacttag ggaatctata gatatcgcc 49210321130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於在SeV的M基因內產生一個終止密碼子的引物4003ttaaaggcct aaaccgatct cagaattacg30210421124212DNA213人工序列220
223人工序列的描述用於在SeV的M基因內產生一個終止密碼子的引物4004tatcattccc tgtctcagcc tgcc 2權利要求
1．一種能形成具有細胞感染、自主RNA複製和接觸侵入能力但不能散布的複合體的RNA分子，其中所述RNA包含參與接觸侵入和自主RNA複製的基因，但沒有參與散布的基因或這些基因已失活。
2．權利要求1的RNA分子，其中所述編碼與包膜和病毒核心相互作用的蛋白質的基因被缺失或失活。
3．權利要求2的RNA分子，其中所述與包膜和病毒核心有相互作用的蛋白質是基質蛋白(M蛋白)。
4．權利要求1的RNA分子，其中所述RNA分子來源於非分節段的(-)RNA病毒。
5．權利要求1的RNA分子，其中所述RNA分子來源於仙臺病毒並且不包含或包含失活的編碼M蛋白的基因。
6．權利要求1到5任何一項的RNA分子，其中所述RNA分子包含一個外來基因。
7．一種包含權利要求1到6任何一項所述RNA分子的細胞，其中該細胞能保證所述RNA複製並將該RNA經接觸侵入轉移到另一個細胞中。
8．一種包含作為體外或在細胞內轉錄權利要求1到6任何一項所述RNA的模板DNA的DNA分子。
9．一種具有細胞感染、自主RNA複製和接觸侵入能力，但不能散布的複合體，其中該複合體包含權利要求1到6任何一項所述RNA分子和不含核酸的病毒結構。
10．一種試劑盒，它包含a)權利要求1到6任何一項所述的RNA、所述RNA的cRNA或者能生物合成該RNA或cRNA的單位，以及b)複製所述RNA或cRNA需要的一組酶，或者能生物合成這些酶的單位。
11．權利要求10的試劑盒，其中a)是權利要求5或6所述的RNA、所述RNA的cRNA，或者能生物合成該RNA或cRNA的單位，以及b)是仙臺病毒的NP、P/C、和L蛋白的全部，或能生物合成上述蛋白質的單位。
12．一種產生權利要求9的複合體的方法，其中所述方法包括向宿主中導入a)權利要求1到6任何一項所述的RNA、所述RNA的cRNA，或能生物合成該RNA或cRNA的單位，以及b)複製所述RNA或cRNA所需的一組酶，或者能生物合成這些酶的單位。
13．權利要求12的方法，其中a)是權利要求5或6所述的RNA、所述RNA的cRNA，或能生物合成該RNA或cRNA的單位，以及b)是仙臺病毒的NP、P/C、和L蛋白的全部，或是能生物合成這些蛋白質的單位。
14．一種表達外來基因的方法，其中該方法包括用權利要求7所述細胞接種非人的哺乳動物並使一種細胞與所述細胞接觸以便表達外來基因。
全文摘要
一種用於基因治療的RNA病毒載體。該RNA病毒載體具有感染細胞、自主複製RNA和接觸侵入能力但沒有傳染性。利用該RNA病毒載體即有可能比常規情況更有效地進行基因治療中的基因轉移和細胞移植。
文檔編號C12N15/86GK1321193SQ99811650
公開日2001年11月7日 申請日期1999年8月10日 優先權日1998年8月11日
發明者淺川誠, 長谷川護 申請人:株式會社載體研究所 被以下專利引用 (1),