鴨性別鑑定用pcr引物、鑑定方法及試劑盒的製作方法
2023-05-03 05:55:11 2
專利名稱：鴨性別鑑定用pcr引物、鑑定方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測鑑定技術領域，具體涉及一種鴨性別鑑定用PCR引物、鑑定方法及試劑盒。
背景技術：
目前，鴨子性別的鑑定方法一般為外形鑑別法、鳴管鑑別法、摸肛鑑別法和翻肛鑑別法。外形鑑別法和鳴管鑑別法雖然簡單方便，但準確率較低，容易出現鑑別錯誤；而摸肛鑑別法和翻肛鑑別法必須在鴨子出殼後12h內進行操作，在此時間內，雌雄雛雞生殖隆起的性狀最顯著，孵出後24小時以上，肛門發緊，難於翻開，而且生殖突起萎縮，甚至陷入洩殖腔深處，不便觀察。因此，需要開發一種簡單方便，能夠快速、準確鑑別鴨子性別的方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於針對上述現有技術的不足，提供一種設計合理，可用於胚胎期及出雛後鴨性別快速鑑定的PCR引物。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種鴨性別鑑定用PCR引物PF(SEQ ID NO. I) PR(SEQ ID NO. 2)，其特徵在於，所述引物的核苷酸序列為上遊引物PF:5' -AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3'；下遊引物PR :5' -GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3'。本發明還提供了一種利用上述鴨性別鑑定用PCR引物鑑定鴨性別的方法，其特徵在於，該方法為以待測鴨的總DNA為模板，採用鴨性別鑑定用PCR引物進行PCR擴增，然後採用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，當擴增產物只出現495bp的特異性擴增條帶時判定為雄性鴨，當擴增產物出現495bp的特異性擴增條和351bp的特異性擴增條時判定為雌性鴨。上述的方法，所述PCR擴增的反應體系由以下成分組成模板DNA45ng 55ng,2XPCR擴增緩衝液12. L，5iimol/L上遊引物2 y L，5 y mol/L下遊引物2 y L，加水至25 u L0上述的方法，所述PCR擴增的反應程序為94°C預變性5min，然後經94°C變性30s，55。。復性30s，72。。延伸30s，35個循環，最後72°C延伸7min。上述的方法，所述495bp的特異性擴增條帶的核苷酸序列(SEQ ID NO. 3)為AGTGCATTGC AGAAACAATA TTACAAGTAA CTATTTTCTT TAAATTTCAT CGTTTTAATT 60ATATGTCTGC ATACAAATTA CTGGTTTAAT ATTTTTCATA ATGCAGTCTG AATTTGGGGC 120AAAATAGTAA AAATCAAGCA CCTTTTTAGG ATTTCATAAC AGTAAAGTTC TGTGAAGCAG 180AGGTTTATTG GTCTAATCTG TCTATTTTGC TTCTGTTGTT TGGCGTATTT GTATATTTTC 240ACTAGGACTT GCTTTTTTTT TTTTTTTTTA GTTTGTTTAT ATTTTGAGAG CTTGTCTTGC 300CTCCACATAT GGTTATTTAC ACCATGTCTT ATGTCATAGG TGGATTTTAA CAAGGAATTA 360
TAAAGCCCTC AGTAAAGGTT CAAAAGGCAG TACCTCTGGC TTTCTGAACA TTATGATGGA 420ACTCAAAAAG TGTTGTAACC ATTGCTACCT CATTAAACCA CCAGATGATA ATGAATTCTA 480TAATAAACAG GAGGC495
上述的方法，所述351bp的特異性擴增條帶的核苷酸序列(SEQ ID NO. 4)為AGTGCATTGC AGAAGCAATA TTACAAGTAA GTAATGACAC TTTTAAAATC GCACTATTTT 60AATTAGATGT CTGTATGAAA AGTAATGAAG TGTAATAGTT TTCATGATGC AATTTGAAAT 120GATATTTTGA GAGCTTACCA TTTGTGGAAA TATGACATGT TAGAAATTAC TTCCACTACA 180CGTTTTATAT CATAGGTGGA TTTTAACCAG GAATTATAAA GCCCTGAGTA AAGGTTCAAA 240AGGCAGTACC TCAGGCTTTT TGAACATCAT GATGGAACTC AAGAAGTGTT GTAACCATTG 300CTACCTCATT AAACCACCAGATGATAATGAATTCTATAATAAACAGGAGGC 351另外，本發明還提供了一種鴨性別鑑定用試劑盒，其特徵在於，包含上述鴨性別鑑定用PCR引物。本發明與現有技術相比具有以下優點本發明利用同時存在於鴨性染色體W染色體和Z染色體上的CHDl基因序列合理設計PCR引物，然後結合PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳技術，根據PCR擴增片段的長度檢測個體鴨是否含有W染色體，從而確定個體鴨的性別，具有操作簡單方便，鑑別快速，結果準確等優點，避免了採用傳統方法耗時、耗力，易出錯的缺點。下面結合附圖和實施例對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
圖I為本發明實施例2的PCR擴增產物的部分電泳圖譜。
具體實施例方式實施例I利用同時存在於鴨性染色體W染色體和Z染色體上的CHDl基因序列設計一對PCR引物PF(SEQ ID NO. I) PR (SEQ ID NO. 2);所述引物的序列為上遊引物PF:5' -AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3'；下遊引物PR :5' -GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3'。本發明的鴨性別鑑定方法通過以下實施例2和實施例3進行描述實施例2步驟一、將102隻高郵鴨的抗凝血液經常規裂解和消化處理後，應用傳統的苯酚/氯仿法提取總DNA，並將總DNA濃度稀釋至50ng/ u L作為模板DNA ；步驟二、採用含有PCR引物PF (SEQ ID NO. I)和PR (SEQ ID NO. 2)的試劑盒對步驟一中所述模板DNA中的CHDl基因進行PCR擴增，PCR擴增反應體系(25 y L體系)為模板DNA 45ng 55ng，2XPCR 擴增緩衝液 12. 5 u L, 5 u mol/L 上遊引物 2u L,5u mol/L 下遊引物L，加水至25ii L ;PCR擴增反應條件為94°C預變性5min，然後經94°C變性30s，55°C復性30s，72。。延伸30s，35個循環，最後72°C延伸7min ；步驟三、取5 ii L步驟二中所得PCR擴增產物，使用2 %的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行鑑定，部分電泳圖譜見圖1，圖中從左至右，其中泳道1-8為高郵鴨樣品，泳道9為Marker,結果顯示第一泳道、第二泳道、第六泳道和第七泳道均顯示兩條條帶,兩條條帶分別為核苷酸序列見SEQ ID NO. 3的495bp的特異性擴增條帶和核苷酸序列見SEQ IDNO. 4的351bp的特異性擴增條帶和核苷酸序列，命名為ZW型，屬雌性鴨；第三泳道、第四泳道、第五泳道和第八泳道均顯示一條核苷酸序列見SEQ ID NO. 3的495bp的特異性擴增條帶，命名為ZZ型，屬雄性鴨；鑑定結果與高郵鴨個體性別記錄結果一致，見表I。表I高郵鴨鑑定結果
權利要求
1.一種鴨性別鑑定用PCR引物，其特徵在於，所述引物的核苷酸序列為 上遊引物 PF : 5' -AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3'； 下遊引物 PR : 5' -GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3'。
2.一種利用如權利要求I所述鴨性別鑑定用PCR引物鑑定鴨性別的方法，其特徵在於，該方法為以待測鴨的總DNA為模板，採用鴨性別鑑定用PCR引物進行PCR擴增，然後採用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，當擴增產物只出現495bp的特異性擴增條帶時判定為雄性鴨，當擴增產物出現495bp的特異性擴增條和351bp的特異性擴增條時判定為雌性鴨。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於 ，所述PCR擴增的反應體系由以下成分組成模板 DNA 45ng 55ng，2XPCR 擴增緩衝液 12. 5 u L, 5 u mol/L 上遊引物 2u L,5u mol/L下遊引物2uL,加水至25 u L0
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述PCR擴增的反應程序為94°C預變性5min，然後經94°C變性30s，55。。復性30s，72。。延伸30s，35個循環，最後72°C延伸7min。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述495bp的特異性擴增條帶的核苷酸序列為 AGTGCATTGC AGAAACAATA TTACAAGTAA CTATTTTCTT TAAATTTCAT CGTTTTAATT 60 ATATGTCTGC ATACAAATTA CTGGTTTAAT ATTTTTCATA ATGCAGTCTG AATTTGGGGC 120 AAAATAGTAA AAATCAAGCA CCTTTTTAGG ATTTCATAAC AGTAAAGTTC TGTGAAGCAG 180 AGGTTTATTG GTCTAATCTG TCTATTTTGC TTCTGTTGTT TGGCGTATTT GTATATTTTC 240 ACTAGGACTT GCTTTTTTTT TTTTTTTTTA GTTTGTTTAT ATTTTGAGAG CTTGTCTTGC 300 CTCCACATAT GGTTATTTAC ACCATGTCTT ATGTCATAGG TGGATTTTAA CAAGGAATTA 360 TAAAGCCCTC AGTAAAGGTT CAAAAGGCAG TACCTCTGGC TTTCTGAACA TTATGATGGA 420 ACTCAAAAAG TGTTGTAACC ATTGCTACCT CATTAAACCA CCAGATGATA ATGAATTCTA 480 TAATAAACAG GAGGC495
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述351bp的特異性擴增條帶的核苷酸序列為 AGTGCATTGC AGAAGCAATA TTACAAGTAA GTAATGACAC TTTTAAAATC GCACTATTTT 60 AATTAGATGT CTGTATGAAA AGTAATGAAG TGTAATAGTT TTCATGATGC AATTTGAAAT 120 GATATTTTGA GAGCTTACCA TTTGTGGAAA TATGACATGT TAGAAATTAC TTCCACTACA 180 CGTTTTATAT CATAGGTGGA TTTTAACCAG GAATTATAAA GCCCTGAGTA AAGGTTCAAA 240 AGGCAGTACC TCAGGCTTTT TGAACATCAT GATGGAACTC AAGAAGTGTT GTAACCATTG 300 CTACCTCATT AAACCACCAG ATGATAATGA ATTCTATAAT AAACAGGAGG C351
7.—種鴨性別鑑定用試劑盒，其特徵在於，包含如權利要求I所述鴨性別鑑定用PCR弓丨物。
全文摘要
本發明公開了一種鴨性別鑑定用PCR引物，引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。另外，本發明還提供了一種利用鴨性別鑑定用PCR引物鑑定鴨性別的方法和包含所述鴨性別鑑定用PCR引物的試劑盒，該方法為以待測鴨的總DNA為模板，採用鴨性別鑑定用PCR引物進行PCR擴增，然後採用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，判定鴨性別。本發明利用同時存在於鴨性染色體W染色體和Z染色體上的CHD1基因序列合理設計PCR引物，然後結合PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳技術確定個體鴨的性別，具有操作簡單方便，鑑別快速，結果準確等優點，避免了採用傳統方法耗時、耗力，易出錯的缺點。
文檔編號C12N15/11GK102618659SQ201210114918
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者單豔菊, 宋衛濤, 宋遲, 朱文奇, 朱春紅, 李慧芳, 束婧婷, 湯青萍, 章雙傑, 章明, 胡豔, 陶志雲, 韓威 申請人:江蘇省家禽科學研究所