一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法

2023-05-03 05:54:21

一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法【專利摘要】本發明公開了一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法，利用病毒誘導基因沉默技術與辣椒離體果實果色變化相結合的方法對辣椒果實果色發育相關基因和辣椒果色發育無關基因進行功能鑑定，主要包括：構建基因沉默表達載體，經農桿菌GV3101介導侵染辣椒離體果實並觀察果色表型的變化。產生沉默效果的離體辣椒果實表現出明顯地橙色或黃色症狀，說明被檢測基因與辣椒果實果色發育相關；相反，果實的果皮顏色轉色正常，或果皮顏色沒有出現明顯變化的，則說明被鑑定基因與辣椒果實果色發育無關，或是無功能基因。該方法為快速驗證大量與辣椒果實果色發育相關基因功能提供了方便，可極大地加快辣椒果實品質分子育種進程。【專利說明】一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬於植物分子育種領域，具體涉及一種利用病毒誘導的基因沉默技術鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法。【
背景技術：
】[0002]辣椒(CapsicumannuumL.)屬於爺科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum),—年或多年生草本植物，原產於中南美洲熱帶亞熱帶地區，現在世界各地普遍栽培，也是我國種植面積最大的蔬菜作物之一。[0003]隨著基因組時代和轉錄組時代的到來，大量的基因功能需要快速鑑定，而傳統轉基因技術操作複雜、周期長、轉化率不高，嚴重製約著基因功能的鑑定。為此，本發明採用VIGS技術，利用離體辣椒果實，實現對辣椒果實果色發育相關基因的快速鑑定，該方法不影響辣椒植株的其它性狀的研究，是一種較為理想的快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法。[0004]辣椒果實中含有葉綠素、類胡蘿蔔素、花青苷及類黃酮等多種色素，其中類胡蘿蔔素與辣椒果實顏色關係緊密，類胡蘿蔔素各組分相對含量的差異造成了辣椒果實顏色多樣性。辣椒果色的形成與眾多色素合成相關酶基因有關，但是，面對大量的果色相關的基因，如何鑑定基因功能成為一個亟待解決的問題。隨著分子生物學技術的快速發展，很多與辣椒果實果色發育相關的基因被克隆出來(GuzmanI,HamblyS,RomeroJ,BoslandP,O』ConnellM.VariabilityofcarotenoidbiosynthesisinorangecolouredCapsicumspp[J].PlantSci，(2010)179,49-59.)，並採用傳統的遺傳轉化方法對其功能分析。然而，這種常規遺傳轉化技術存在著許多的局限性，其主要表現在於操作程序複雜、周期長、轉化條件要求苛刻、轉化效率低且受辣椒品種影響，甚至對某些生物體具有致死效應，嚴重地制約著分子育種的進程。因此，需要尋找一種快速高效的基因功能鑑定方法。[0005]病毒誘導的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)是從研究病毒和寄主之間的相互作用發展而來。在這個系統中，帶有目的基因片段的病毒載體被傳遞到植物細胞，植物細胞識別入侵病毒的威脅並且利用保護性防衛機制來摧毀病毒和病毒載體上所攜帶的任何外源基因，從而影響植物本身目的基因的轉錄過程，導致目的基因mRNA發生特異性降解。即指攜帶與植物內源功能基因同源序列的病毒在侵染植物之後，能夠使植物發生基因沉默從而出現表型突變，可以通過植物表型上的變化來反映該基因的功能。[0006]Fu等(2005)通過VIGS技術對生長在植株上的番茄果實注射攜帶目的基因片段的菸草脆裂病毒(TRV)獲得成功，檢驗了控制番茄果實的乙烯基因的功能，同時他也對離體番茄果實採用真空滲透法進行VIGS實驗，但真空滲透法浸染效率低，且大部分果實在浸染後爛掉，他們認為真空滲透不適合研究與果實成熟相關基因的功能。Jia(2011)和Sun(2013)利用VIGS技術研究果實相關基因的方法也都集中在植株上生長的活體果實，但活體注射最大的缺陷是病毒會浸染植株的其它部位，不利於對植株的其它性狀的研究。本發明克服了真空浸透浸染及活體注射的不足，實現了在離體辣椒果實上快速鑑定與辣椒果實果色發育相關基因功能的目的。[0007]病毒誘導的基因沉默是近年來發展起來的一種快速鑑定植物基因功能的方法，它能最大限度地克服傳統方法的局限性，具有操作簡單、周期短、沉默效率高，且可以在不同遺傳背景下生效等優點。因此，適用於大規模的基因功能篩選。[0008]以下是相關參考文獻:[0009]1、WangHM,YinWC,WangCK,andToKY.1solationoffunctionalRNAfromdifferenttissuesoftomatosuitablefordevelopmentalprofilingbymicroarrayanalysis[J].BotStud，2009，(50):115~125。[0010]2λWangJE,LiuKK,LiDW,ZhangYLjZhaoQ，HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.2013,(14):3158~3177。[0011]3、AndreC.Velasquez,SumaChakravarthyjGregoryB.Martin.Virus-1nducedGeneSilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandTomato[J].JournalofVisualizedExperiments,2009，(28):el292，DO1:10.3791/1292。[0012]4、劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].西北農林科技大學博士學位論文(導師:鞏振輝)，2009，p32。[0013]5>GuzmanI,HambyS,RomeroJ,BoslandPW，0，ConnellMA.VariabilityofcarotenoidbiosynthesisinorangecoloredCapsicumspp[J].PlantSci,2010,(179):49~59。[0014]6、FuDQ,ZhuBZ,LiangZH,JiangWB,LuoYB.Virus-1nducedgenesilencingintomatofruit[J].ThePlantJournal,2005,(43):299~308。[0015]7、JiaHF,ChaiYM,LiCL,QinL,ShenYY.CloningandCharacterizationoftheHSubunitofaMagnesiumChelataseGene(PpCHLH)inPeach[J].JPlantGrowthRegul,2011,(30):445~455。[0016]8、SunJH，LuoJJ,TianL，LiCL，XingY，ShenYY.NewEvidencefortheRoleofEthyleneinStrawberryFruitRipening[J].JPlantGrowthRegul,2013,(32):461~470。【
發明內容】[0017]針對上述現有技術中關於辣椒果實果色發育相關基因功能鑑定中存在的問題，本發明的目的在於，提供一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法。[0018]為了實現上述任務，本發明採用如下的技術解決方案:[0019]一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因的方法，其特徵在於，該方法利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體果實果色變化相結合的方法，對辣椒果實果色發育相關基因的功能分析，具體步驟如下:[0020]I)辣椒材料的準備:[0021]選擇籽粒飽滿的成熟辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8~10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射；[0022]2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:[0023]將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20V,16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養15d左右，觀察辣椒離體果實果色表型變化；[0024]3)重組病毒載體的構建:[0025](1)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:[0026]採用Trizol法提取辣椒果實總RNA，按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成；[0027](2)目的基因片段的克隆:[0028]用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150_500bp之間；根據GenBank公布的或已克隆的與辣椒果實果色發育相關基因，以及與果色發育無關基因序列，設計合適的引物序列；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒回收目的基因；利用T4DNA連接酶將回收產物連接到克隆載體PMD19-T上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體；[0029](3)重組載體構建:[0030]選擇病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2;選擇合適的酶切位點對病毒載體PTRV2和步驟(2)經過測序驗證含有目的基因序列的克隆載體進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒回收，利用T4DNA連接酶將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜，轉化DH5a，用菌落PCR和酶切方法檢測出目的基因片段，證明目的基因已經成功轉入病毒載體中；[0031](4)轉化農桿菌:[0032]利用凍融法將pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的重組病毒載體分別導入農桿菌菌株GV3101中，經PCR檢測確定為目的基因，保存菌液以備用；[0033]4)農桿菌菌液注射:[0034](1)農桿菌菌液準備:[0035]將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；[0036](2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈照射30min備用；[0037]果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟(將盛有固體石蠟的燒杯放置於75°C烘箱中約20min，固體石蠟即可熔化成液體)中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。[0038]消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器(一次性使用無菌注射器:規格.0.6X25，容量1ml)針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處(注意不要扎穿果柄，否則將會漏液，影響注射效果)，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液(注射量:約0.5ml)，可見整個果柄出現水潰狀；[0039]將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中。18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化；[0040]5)基因沉默效果檢測:[0041](I)沉默表型觀察:[0042]辣椒果實農桿菌注射接種8d~15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內；[0043](2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:[0044]鑑定方法是，與正常對照相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色呈現橙色或黃色，說明被檢測基因與辣椒果色發育相關；相反，果實顏色正常轉紅或與對照相比果皮紅色沒有明顯差異的，則說明被檢定基因與辣椒果色發育無關，或是無功能基因。[0045]本發明的快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因功能的方法，具有操作簡單、無需進行植物遺傳轉化，在不影響辣椒植株的其它性狀研究情況下，實現對辣椒果實果色發育相關基因的快速鑑定，且可以在不同遺傳背景下進行鑑定等優點，是一種快速、有效鑑定植物基因功能的方法。【專利附圖】【附圖說明】[0046]圖1為辣椒果色CaLCYB基因沉默的表型圖片。其中，左圖為:pTRV_00(空載體，不含目的基因)(果色為紅色)；右圖為:pTRV-LCYB(重組載體，攜帶目的基因)(果色為黃色)。[0047]圖2為辣椒果色CaCRTZ基因沉默的表型圖片。其中，左圖為:pTRV_00(空載體，不含目的基因)(果色為紅色)；右圖為:pTRV-CRTZ(重組載體，攜帶目的基因)(果色為黃色)。[0048]圖3為辣椒疫病CaPOD基因沉默的表型圖片(該基因與果實果色發育無關)。其中，左圖為:pTRV-00(空載體，不含目的基因)(果色為紅色);右圖為:pTRV-P0D(重組載體，攜帶目的基因)(果色為紅色)。[0049]圖4為辣椒果色CaPSY基因沉默的表型圖片。其中，左圖為:pTRV_00(空載體，不含目的基因)(果色為紅色);右圖為:pTRV-PSY(重組載體，攜帶目的基因)(果色為橙黃色)。[0050]圖5為辣椒果色CaCCS基因沉默的表型圖片。其中，左圖為:pTRV_00(空載體，不含目的基因)(果色為紅色)；右圖為=PTRV-CCS(重組載體，攜帶目的基因)(果色為黃色)。[0051]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的詳細說明。【具體實施方式】[0052]按照本發明的技術方案，發明人給出以下具體的應用實施例，需要說明的是，以下實施例僅是說明性的，本發明並不限於這些實施例。[0053]應用實施例1:[0054]本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體果實果色變化相結合的方法，進行辣椒果實果色發育相關基因的功能分析，具體步驟如下:[0055]I)辣椒材料的準備:[0056]供試材料為成熟果色紅色辣椒品種R15。[0057]選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8-10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射；[0058]2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:[0059]將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X條件下進行培養(15d左右)，觀察辣椒離體果實果色表型變化；[0060]3)重組病毒載體的構建:[0061](I)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:[0062]米用Trizol法(WangHM,YinWC,WangCK,andToKY.1solationoffunctionalRNAfromdifferenttissuesoftomatosuitablefordevelopmentalprofilingbymicroarrayanalysis[J].BotStud,(2009)50,115~125)提取辣椒果實總RNA,按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒(TaKaRacode:DRRO37A,Primescript?RTreagentkitPerfectRealTime,200reactions)操作說明進行cDNA第一鏈合成。[0063](2)目的基因片段的克隆:[0064]用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150_500bp之間；根據GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)公布的辣椒果色相關基因CaLCYB序列(GenBank:X86221.1)設計合成一對帶有BamHI和KpnI雙酶切位點的引物序列1:其中:[0065]正向引物:5，-CGCGGATCCCATTGCCCTTTAATCATTTATT-3』；[0066]反向引物:5』-CGGGGTACCTTCACAGAGCTAAAGGCACTAAC-3；[0067]片段大小為320bp；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(天根大量瓊脂糖凝膠回收試劑盒DP210)回收目的基因；利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A，25000units)將回收產物連接到克隆載體pMD19_T(TaKaRaCode:6013，1.0μg)上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158~3177),菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體。[0068](3)重組載體構建:[0069]用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2。選用KpnI和BamHI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的T-LCYB進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158~3177),用菌落PCR和雙酶切方法檢測出320bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-LCYB已經構建成功，可用於下一步農桿菌侵染。[0070](4)轉化農桿菌:[0071]利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-LCTB分別導入農桿菌菌株GV3101中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL，ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158~3177)，PCR檢測確定擴增出320bp的目的條帶，保存菌液以備用。[0072]4)農桿菌菌液注射:[0073](I)農桿菌菌液準備:[0074]將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；具體參考(Andr6C.Veldsquez,SumaChakravarthy,GregoryB.Martin.Virus-1nducedGeneSilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandTomato[J].JournalofVisualizedExperiments,.2009,(28):el292,DOI:10.3791/1292)的方法。[0075](2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌(滅菌條件:121°C，2Imin)，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈(20w)照射30min備用。[0076]果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟(將盛有固體石蠟的燒杯放置於75°C烘箱中約20min，固體石蠟即可熔化成液體)中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。[0077]消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器(一次性使用無菌注射器:規格:0.6X25，容量Iml)針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處(注意不要扎穿果柄，否則將會漏液，影響注射效果)，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液(注射量:約0.5ml)，可見整個果柄出現水潰狀。[0078]將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中。18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化。[0079]5)基因沉默效果檢測:[0080](I)沉默表型觀察:[0081]辣椒果實農桿菌注射接種8d~15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內。[0082](2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:[0083]鑑定方法是，與正常對照(空載體，不含目的基因，同樣環境條件下處理的離體果實)相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色呈現黃色(圖1)，這一結果說明CaLCYB基因與辣椒果實果色發育相關。這一研究結果與前人研究結論CaLCYB是辣椒果實果色發育相關基因一致(GuzmanI,HambyS,RomeroJ,BoslandPW,O，ConnellMA.VariabilityofcarotenoidbiosynthesisinorangecoloredCapsicumspp[J].PlantSci,(2010)179,49~59)。[0084]應用實施例2:[0085]本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒果實果色變化相結合的方法，進行辣椒果實果色發育相關基因的功能分析，具體如下:[0086]I)辣椒材料的準備:[0087]供試材料為成熟果色紅色辣椒品種R15。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8~10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射。[0088]2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:[0089]將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X條件下進行培養(15d左右)，觀察辣椒離體果實果色表型變化。[0090]3)重組病毒載體的構建:[0091](I)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:[0092]米用Trizol法(WangHM,YinWC,WangCK,andToKY.1solationoffunctionalRNAfromdifferenttissuesoftomatosuitablefordevelopmentalprofilingbymicroarrayanalysis[J].BotStud,(2009)50,115-125)提取辣椒果實總RNA,按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒(TaKaRacode:DRR037A,Primescript?RTreagentkitPerfectRealTime,200reactions)操作說明進行cDNA第一鏈合成。[0093](2)目的基因片段的克隆:[0094]用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150_500bp之間；根據GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)公布的辣椒果色相關基因CaCRTZ序列(GenBank:Y09225.1)設計合成一對帶有BamHI和KpnI雙酶切位點的引物序列II，其中:[0095]正向引物:5，-CGCGGATCCTCCTTCACCGTACCGTACA-3』；[0096]反向引物:5』-CGGGGTACCTAATAAACTGAAATAACCGCCAT-3，；[0097]片段大小為416bp；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(天根大量瓊脂糖凝膠回收試劑盒DP210)回收目的基因；利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收產物連接到克隆載體pMD19_T(TaKaRaCode:6013，1.0μg)上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158~3177),菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體；[0098](3)重組載體構建:[0099]用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2。選用KpnI和BamHI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的T-CRTZ進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a(WangJE,LiuKK,LiDW，ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158~3177)，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出416bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-CRTZ已經構建成功，可用於下一步農桿菌侵染。[0100](4)轉化農桿菌:[0101]利用凍融法將攜帶pTRVl載體、PTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-CRTZ分別導入農桿菌菌株GV3101中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL，ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158~3177)，PCR檢測確定擴增出416bp的目的條帶，保存菌液以備用。[0102]4)農桿菌菌液注射:[0103](I)農桿菌菌液準備:[0104]將攜帶pTRVl載體、`pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；具體參考(Andr6C.Veldsquez,SumaChakravarthy,GregoryB.Martin.Virus-1nducedGeneSilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandTomato[J].JournalofVisualizedExperiments,2009,(28):el292,DO1:10.3791/1292)的方法。[0105](2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌(滅菌條件:121°C，2Imin)，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈(20w)照射30min備用。[0106]果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟(將盛有固體石蠟的燒杯放置於75°C烘箱中約20min，固體石蠟即可熔化成液體)中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。[0107]消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器(一次性使用無菌注射器:規格:0.6X25，容量Iml)針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處(注意不要扎穿果柄，否則將會漏液，影響注射效果)，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液(注射量:約0.5ml)，可見整個果柄出現水潰狀；[0108]將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化；[0109]5)基因沉默效果檢測:[0110](I)沉默表型觀察:[0111]辣椒果實農桿菌注射接種8d-15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內；[0112](2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:[0113]鑑定方法是，與正常對照(空載體，不含目的基因，同樣環境條件下處理的離體果實)相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色呈現黃色(圖2)，這一結果說明CaCRTZ基因與辣椒果實果色發育相關。這一研究結果與前人研究結論CaCRTZ是辣椒果色發育相關基因一致(GuzmanI,HambyS,RomeroJ,BoslandPff,O，ConnellMA.VariabilityofcarotenoidbiosynthesisinorangecoloredCapsicumspp[J].PlantSci,(2010)179,49~59)。[0114]應用實施例3:[0115]本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒果實果色變化相結合的方法，進行與辣椒果實果色發育無關基因的表型驗證，具體如下:[0116]I)辣椒材料的準備:[0117]供試材料為成熟果色紅色辣椒品種R15。[0118]選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8~10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射；[0119]2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:[0120]將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X條件下進行培養(15d左右)，觀察辣椒離體果實果色表型變化；[0121]3)重組病毒載體的構建:[0122](I)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:[0123]米用Trizol法(WangHM,YinWC,WangCK,andToKY.1solationoffunctionalRNAfromdifferenttissuesoftomatosuitablefordevelopmentalprofilingbymicroarrayanalysis[J].BotStud,(2009)50,115~125)提取辣椒果實總RNA,按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒(TaKaRacode:DRR037A,Primescript?RTreagentkitPerfectRealTime,200reactions)操作說明進行cDNA第一鏈合成。[0124](2)目的基因片段的克隆:[0125]用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150~500bp之間；根據申請人:課題組克隆的辣椒過氧化物酶(CaPOD)基因序列(NCBIGenBank登錄號:FJ596178)(劉珂珂，辣椒對疫病的抗性及其機理研究[D].2009)，設計合成一對帶有XbaI和BamHI雙酶切位點的引物序列III，其中:[0126]正向引物:5』-GGGTCTAGAGTGCTCAACACACACTTTATTCTTCTC-3』；[0127]反向引物:5』-GGGGGATCCCCAAGAATGACAACAGAGTCCCTA-3>；[0128]片段大小為480bp；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(天根大量瓊脂糖凝膠回收試劑盒DP210)回收目的基因；利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收產物連接到克隆載體pMD19_T(TaKaRaCode:6013,1.0μg)上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158-3177),菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體；[0129](3)重組載體構建:[0130]用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2。選用XbaI和BamHI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的T-POD進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A，25000units)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a(WangJE,LiuKK,LiDW，ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14，3158-3177)，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出480bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體PTRV-POD已經構建成功，可用於下一步農桿菌侵染。[0131](4)轉化農桿菌:[0132]利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV`2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-POD分別導入農桿菌菌株GV3101中(WangJE,LiuKK,，LiDff,ZhangYL，ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158-3177),PCR檢測確定擴增出480bp的目的條帶，保存菌液以備用。[0133]4)農桿菌菌液注射:[0134](I)農桿菌菌液準備:[0135]將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；具體參考(Andr6C.Veldsquez,SumaChakravarthy,GregoryB.Martin.Virus-1nducedGeneSilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandTomato[J].JournalofVisualizedExperiments,.2009,(28):el292,DO1:10.3791/1292)的方法。[0136](2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌(滅菌條件:12rC，21min)，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈(20w)照射30min備用。[0137]果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟(將盛有固體石蠟的燒杯放置於75°C烘箱中約20min，固體石蠟即可熔化成液體)中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。[0138]消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器(一次性使用無菌注射器:規格0.6X25，容量Iml)針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處(注意不要扎穿果柄，否則將會漏液，影響注射效果)，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液(注射量:約0.5ml)，可見整個果柄出現水潰狀；[0139]將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中。18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化；[0140]5)基因沉默效果檢測:[0141](I)沉默表型觀察:[0142]辣椒果實農桿菌注射接種8d~15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內；[0143](2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:[0144]鑑定方法是，與正常對照(空載體，不含目的基因，同樣環境條件下處理的離體果實)相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色與正常對照基本一致(圖3)，這一結果說明CaPOD基因與辣椒果實果色發育無關。[0145]應用實施例4:[0146]本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒果實果色變化相結合的方法，進行辣椒果實果色發育相關基因的功能分析，具體如下:[0147]I)辣椒材料的準備:[0148]供試材料為成熟果色紅色辣椒品種R15。[0149]選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8-10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射；[0150]2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:[0151]將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X條件下進行培養(15d左右)，觀察辣椒離體果實果色表型變化；[0152]3)重組病毒載體的構建:[0153](I)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:[0154]米用Trizol法(WangHM,YinWC,WangCK,andToKY.1solationoffunctionalRNAfromdifferenttissuesoftomatosuitablefordevelopmentalprofilingbymicroarrayanalysis[J].BotStud,(2009)50，115-125)提取辣椒果實總RNA，按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒(TaKaRacode:DRR037A，Primescripl'KRTreagentkitPerfectRealTime,200reactions)操作說明進行cDNA第一鏈合成；[0155](2)目的基因片段的克隆:[0156]用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150_500bp之間；根據GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)公布的辣椒果色相關基因CaPSY序列(GenBank:X68017.1)設計合成一對帶有BamHI和KpnI雙酶切位點的引物序列IV，其中:[0157]正向引物:5』-CGCGGATCCTGCCTTGTTATGGGTTGTTT-3』；[0158]反向引物:5』-CGGGGTACCCCTTCTTCACATCTAACTCATCG-3』；[0159]片段大小為347bp；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(天根大量瓊脂糖凝膠回收試劑盒DP210)回收目的基因；利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收產物連接到克隆載體pMD19_T(TaKaRaCode:6013，1.0μg)上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158-3177),菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體；[0160](3)重組載體構建:[0161]用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2。選用KpnI和BamHI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的T-PSY進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A，25000units)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a(WangJE,LiuKK1LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14，3158-3177)，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出347bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體PTRV-PSY已經構建成功，可用於下一步農桿菌侵染。[0162](4)轉化農桿菌:[0163]利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-PSY分別導入農桿菌菌株GV3101中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158-3177),PCR檢測確定擴增出347bp的目的條帶，保存菌液以備用。[0164]4)農桿菌菌液注射:[0165](I)農桿菌菌液準備:[0166]將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；具體參考(Andr6C.Velasquez,SumaChakravarthy,GregoryB.Martin.Virus-1nducedGeneSilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandTomato[J].JournalofVisualizedExperiments,2009,(28):el292,DO1:10.3791/1292)的方法。[0167](2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌(滅菌條件:121°C，2Imin)，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈(20w)照射30min備用。[0168]果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟(將盛有固體石蠟的燒杯放置於75°C烘箱中約20min，固體石蠟即可熔化成液體)中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。[0169]消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器(一次性使用無菌注射器:規格:0.6X25，容量Iml)針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處(注意不要扎穿果柄，否則將會漏液，影響注射效果)，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液(注射量:約0.5ml)，可見整個果柄出現水潰狀；[0170]將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中。18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化；[0171]5)基因沉默效果檢測:[0172](I)沉默表型觀察:[0173]辣椒果實農桿菌注射接種8d~15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內；[0174](2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:[0175]鑑定方法是，與正常對照(空載體，不含目的基因，同樣環境條件下處理的離體果實)相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色呈現橙黃色(圖4)，這一結果說明CaPSY基因與辣椒果實果色發育相關。這一研究結果與前人研究結論CaPSY是辣椒果色發育相關基因一致(GuzmanI,HambyS,RomeroJ,BoslandPff,O，ConnellMA.VariabilityofcarotenoidbiosynthesisinorangecoloredCapsicumspp[J].PlantSci,(2010)179,49-59)。[0176]應用實施例5:[0177]本實施例利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒果實果色變化相結合的方法，進行辣椒果實果色發育相關基因的功能分析，具體如下:[0178]I)辣椒材料的準備:[0179]供試材料為成熟果色紅色辣椒品種R15。[0180]選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8-10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射；[0181]2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:[0182]將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X條件下進行培養(15d左右)，觀察辣椒離體果實果色表型變化；[0183]3)重組病毒載體的構建:[0184](I)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:[0185]米用Trizol法(WangHM,YinWC,WangCK,andToKY.1solationoffunctionalRNAfromdifferenttissuesoftomatosuitablefordevelopmentalprofilingbymicroarrayanalysis[J].BotStud，(2009)50，115-125)提取辣椒果實總RNA，按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒(TaKaRacode:DRR037A,PriCQ6SCript?RTreagentkitPerfectRealTime,200reactions)操作說明進行cDNA第一鏈合成；[0186](2)目的基因片段的克隆:[0187]用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150_500bp之間；根據GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/genbank)公布的辣椒果色相關基因CaCCS序列(GenBank:X76165.1)設計合成一對帶有BamHI和KpnI雙酶切位點的引物序列V，其中:[0188]正向引物:5，-CGCGGATCCCCTTTTCCATCTCCTTTACTT-3，；[0189]反向引物:5』-CGGGGTACCCTGTCCAAATACTTAGTCTTGTGAT-3』；[0190]片段大小為458bp；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒(天根大量瓊脂糖凝膠回收試劑盒DP210)回收目的基因；利用T4DNA連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收產物連接到克隆載體pMD19_T(TaKaRaCode:6013，1.0μg)上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14,3158-3177),菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即可用於構建基因沉默表達載體；[0191](3)重組載體構建:[0192]用於本實施例的病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2。選用KpnI和BamHI內切酶對病毒載體pTRV2和經步驟(2)驗證過的T-CCS進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA`連接酶(TaKaRaCode:D2011A,25000units)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉化DH5a(WangJE,LiuKK,LiDW，ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14，3158-3177)，用菌落PCR和雙酶切方法檢測出458bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體PTRV-CCS已經構建成功，可用於下一步農桿菌侵染。[0193](4)轉化農桿菌:[0194]利用凍融法將攜帶pTRVl載體、PTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體pTRV-CCS分別導入農桿菌菌株GV3101中(WangJE,LiuKK,LiDff,ZhangYL,ZhaoQ,HeYMandGongZH.AnovelperoxidaseCaPODgeneofpepperisinvolvedindefenseresponsestophytophtoracapsiciInfectionaswellasabioticstresstolerance.1nt.J.Mol.Sc1.(2013)14，3158-3177)，PCR檢測確定擴增出458bp的目的條帶，保存菌液以備用。[0195]4)農桿菌菌液注射:[0196](I)農桿菌菌液準備:[0197]將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；具體參考(Andr6C.Velasquez,SumaChakravarthy,GregoryB.Martin.Virus-1nducedGeneSilencing(VIGS)inNicotianabenthamianaandTomato[J].JournalofVisualizedExperiments,.2009,(28):el292,DO1:10.3791/1292)的方法。[0198](2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌(滅菌條件:12rC，21min)，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈(20w)照射30min備用。[0199]果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟(將盛有固體石蠟的燒杯放置於75°C烘箱中約20min，固體石蠟即可熔化成液體)中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。[0200]消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器(一次性使用無菌注射器:規格0.6X25，容量Iml)針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處(注意不要扎穿果柄，否則將會漏液，影響注射效果)，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液(注射量:約0.5ml)，可見整個果柄出現水潰狀；[0201]將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中。18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化；[0202]5)基因沉默效果檢測:[0203](I)沉默表型觀察:[0204]辣椒果實農杆`菌注射接種8d-15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內；A[0205](2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:[0206]鑑定方法是，與正常對照(空載體，不含目的基因，同樣環境條件下處理的離體果實)相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色呈現黃色(圖5)，這一結果說明CaCCS基因與辣椒果實果色發育相關。這一研究結果與前人研究結論CaCCS是辣椒果色發育相關基因一致(GuzmanI,HambyS,RomeroJ,BoslandPff,O，ConnellMA.VariabilityofcarotenoidbiosynthesisinorangecoloredCapsicumspp[J].PlantSci,(2010)179,49-59)。【權利要求】1.一種快速鑑定辣椒果實果色發育相關基因的方法，其特徵在於，該方法利用病毒誘導的基因沉默技術與辣椒離體果實果色變化相結合的方法，對辣椒果實果色發育相關基因的功能分析，具體步驟如下:1)辣椒材料的準備:選擇籽粒飽滿的成熟辣椒種子，55°c溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進行催芽；經4d種子露白，播於穴盤中，當植株長出8~10片真葉時，移栽塑料大棚進行自然生長，待辣椒花後35天果實處於綠熟期時，採摘果齡一致的果實，帶回實驗室用於病毒誘導的基因沉默注射；2)病毒注射後辣椒離體果實的培養:將注射後的辣椒果實放入人工氣候箱，18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001x條件下進行培養15d，觀察辣椒離體果實果色表型變化；3)重組病毒載體的構建:(1)辣椒果實總RNA的提取與cDNA第一鏈合成:採用Trizol法提取辣椒果實總RNA，按TaKaRa公司的反轉錄試劑盒操作說明進行cDNA第一鏈合成；(2)目的基因片段的克隆:用於基因沉默表達載體構建的基因片段大小要求在150-500bp之間；根據GenBank公布的或已克隆的與辣椒果實果色發育相關基因，以及與辣椒果實果色發育無關基因序列，設計合適的引物序列；以步驟(1)合成的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒回收目的基因；利用T4DNA連接酶將回收產物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜，然後轉化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測初步確定連接成功後，進行測序，確認克隆基因片段序列與目的基因序列一致時，即用於構建基因沉默表達載體；(3)重組載體構建:選擇病毒載體為菸草脆裂病毒載體pTRVl和pTRV2;選擇合適的酶切位點對病毒載體PTRV2和步驟(2)經過測序驗證含有目的基因序列的克隆載體進行雙酶切，37°C過夜，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照並切膠，用DNA回收試劑盒回收，利用T4DNA連接酶將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜，轉化感受態DH5a，用菌落PCR和酶切方法檢測出目的基因片段，證明目的基因已經成功轉入病毒載體中；(4)轉化農桿菌:利用凍融法將PTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構建好的重組病毒載體分別導入農桿菌菌株GV3101中，經PCR檢測確定為目的基因，保存菌液以備用；4)農桿菌菌液注射:(1)農桿菌菌液準備:將攜帶PTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3)構建好的病毒載體的農桿菌菌液按已知的方法進行活化；(2)注射接種:在注射前將所需鑷子、不鏽鋼果盤、果盤內底部所襯濾紙進行高壓滅菌，烘乾後轉入超淨工作檯，紫外燈照射30min備用；果實注射前處理:將離體辣椒果實果面用自來水衝洗乾淨，再用蒸餾水衝洗2-3次，室內晾乾。然後將清洗過的辣椒果實的果柄在事先熔好的石蠟中快速蘸一下封住果柄頂端傷口，轉入超淨工作檯中。消毒及注射:將待注射的果實在75%酒精中快速浸蘸30秒後取出，再用無菌水清洗2-3次，然後在靠近辣椒果實的果柄基部先用注射器針頭扎個小洞，針頭刺入深度約為果柄直徑的1/2處，然後用去掉針頭的注射器在果柄針孔處注射菌液0.5ml，可見整個果柄出現水潰狀；將注射接種後的離體辣椒果實放入襯有滅菌濾紙的不鏽鋼果盤中，果實擺放整齊，用保鮮膜封好果盤後置於人工氣候箱中；18°C、暗培養2d後，轉為25°C/20°C、16h/8h、相對溼度35%，光照200001X，條件下進行培養，觀察並記錄辣椒離體果實果色的表型變化；5)基因沉默效果檢測:(1)沉默表型觀察:辣椒果實農桿菌注射接種8d~15d就會出現不同程度的病毒症狀，證明病毒載體已經成功導入植株體內；(2)鑑定辣椒果實待檢測基因功能:鑑定方法:與正常對照相比，注射攜帶目的基因病毒載體的果實果色呈現橙色或黃色，說明被檢測基因與辣椒果實果色發育相關；相反，果實顏色正常轉紅或與對照相比果皮紅色沒有明顯差異的，則說明被檢測基因與辣椒果實果色發育無關，或是無功能基因。【文檔編號】C12Q1/68GK103695537SQ201310636977【公開日】2014年4月2日申請日期:2013年11月29日優先權日:2013年11月29日【發明者】鞏振輝,田士林,李莉,賀玉梅,王軍娥,張震申請人:西北農林科技大學