具有最小聚集的可吸入噴霧乾燥4－螺旋束蛋白粉劑的製作方法

2023-10-24 22:23:17

專利名稱：具有最小聚集的可吸入噴霧乾燥4－螺旋束蛋白粉劑的製作方法
本申請要求對下列美國臨時專利申請有優先權專利申請序列號60/223,144，2000年8月7日提出申請；專利申請序列號60/228,634，2000年8月29日提出申請；和2000年10月13日提出申請的專利申請序列號60/240,487，這些申請的全部內容作為參考而引入本文。
肺部給藥是一個比用針給藥方法有幾個優點的可供選擇給藥途徑。這些優點包括病人自我給藥方便、可能減少藥物的副作用、吸入給藥容易、不用針等等。許多蛋白質、肽、DNA和小分子吸入療法的臨床前和臨床研究顯示在肺部和全身都有療效。然而，儘管有這樣的效果，但是近幾年來吸入療法在衛生保健領域沒有像預期那樣得到發展，部分是由於可吸入藥物製劑發展特有的一系列問題。特別是，肺部給藥的乾粉製劑，雖然與不方便的液體劑型和推進劑驅動製劑相比有一些獨特的優點，但是易於出現使乾粉基吸入療法效果顯著減小的聚集和低流動性現象。
最近幾年來，部分地由於受乾粉煙霧劑給藥的優點和眾所周知乾粉製備技術(例如，凍幹法、風乾和共沉澱)的一些不足之處影響，噴霧乾燥已經作為製備微米尺寸肺部給藥粉末的方法而採用(Platz，R.等，國際專利公開號WO96/32149)。噴霧乾燥採用熱氣流蒸發液體給料霧化形成的微分散霧滴以形成乾粉。雖然長期以來噴霧乾燥在食品和製藥工業已經被用於製備乾粉，但是由於擔心某些蛋白質在噴霧乾燥過程中被熱降解，其用於醫療蛋白受到相當程度的限制。然而，目前越來越多的證據支持噴霧乾燥大分子生物製劑以製備適合於吸入療法的生物活性粉末的一般用途(Foster，L.國際專利公開號WO98/16205；Platz，R.國際專利公開號WO97/41833；Eljamal，M.國際專利公開號WO96/32152；Eljamal，M.國際專利公開號96/32116；Eljamal，M.國際專利公開號95/24183；Bennett，D.國際專利公開號01/00312)，許多肽和蛋白質，當暴露於噴霧乾燥的嚴厲條件下，易於形成某種程度的聚集(伸展)。
某些蛋白質，特別是具有屬於4-α-螺旋束超家族(例如，hGH、INF-γ、INF-β、GM-CSF、M-CST、IL-2、IL-4、IL-5)特徵的蛋白質非常容易變性、伸展、聚集和沉澱，並失去生物活性。這些蛋白質在序列和結構(構象)上有很大的相似性，其特徵是蛋白質中心部位摺疊成向上、向上、向下、向下、逆平行、左手手性的具有雙反手環拓撲結構的α-螺旋束。於是，由於它們的不穩定性，噴霧乾燥和將這類蛋白質製備成吸入劑存在一系列獨特的挑戰。
對這類蛋白質的蛋白質伸展有影響的噴霧乾燥過程中的幾個方面，例如剪切力、高溫、霧滴中蛋白質暴露於液氣界面(表面效應)、液壁相互作用等等，能導致含不適合(或者至少非最佳)吸入尺寸範圍的聚集形式蛋白質程度高的乾燥顆粒的產生。關於4-α-螺旋束蛋白加工處理過程中不穩定性有無數的實例。由於噴氣霧化重組複合α-幹擾素(rConIFN)變得不穩定，導致不溶性非共價聚集快速形成，霧化25分鐘後只保留了大約25％的初始單體蛋白(Ip，A.Y.等，J.PharmSci.，84(10)，19951210-1214)。在一項噴霧乾燥蛋白如hGH的可行性考察中，發現25％的蛋白質在加工處理中被降解，雖然添加0.1％(w/v)聚山梨醇酯20使噴霧乾燥中不溶性和可溶性聚集的形成減少大約70-85％(Mumenthaler，M.等，Pharm.Research，11(1)，199412)。在二價鋅離子存在情況下，發現添加聚山梨醇酯20進一步抑制噴霧乾燥中hGH降解(Maa，Y-F.等，J.Pharm.Sci.，87(2)，1998152-159)。在一項連續注射白介素-2的生物活性和物理穩定性研究中，IL-2與導管的管形材料形成的暫時性表面結合被確定是造成觀察到的大多數生物活性降低(降低～90％)的原因(Tzannis，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，935460(1996)。
4-α-螺旋束蛋白中，生長激素特別不穩定，至今許多方法已經被採用以獲得穩定的藥物治療劑。生長激素的降解產物包括脫醯氨基或次硫酸鹽產物和二聚體或聚合體形式。具體地，生長激素的佔主導地位的降解反應是(i)直接水解脫去醯氨基或通過環琥珀醯亞胺中間體以形成各種各樣數量的L-asp-hGH、L-iso-asp-hGH、D-asp-hGH和D-iso-asp-hGH，和(ii)蛋氨酸殘基位點14和25的氧化。人生長激素位點14和25也容易氧化。更重要地，人生長激素聚集的形成是不利的，因為其能夠導致生物活性降低和免疫原性升高(Becker等，Biochem.，9478-487(1987)；Leppert，P.，Moore，W.V.，J.Clin.Endocrinol.，51691-697(1980))。
因此，蛋白質變性、聚集形成及流動性和分散性差粉末的產生繼續困擾製備用於吸入療法的4-螺旋束蛋白粉末的進展。而且，至今所採用的許多方法不合要求或不適合吸入療法粉末製劑，如表面活性劑的使用，其被認為幹擾肺部病理和上皮刺激劑，或預噴霧乾燥溶液的蛋白質固體濃度增加，其能導致微粒太大以致不能有效地輸送到肺部深處。
因此，存在這樣一個需要去改善4-螺旋束蛋白肺部給藥可吸入粉末煙霧劑，和具體地，需要煙霧劑特性極好和聚集減少的噴霧乾燥粉末。
在本發明的一項優選的實施方式中，4α-螺旋束蛋白包括人生長激素。
本發明中噴霧乾燥製劑，在某些特定實施方式中，與噴霧乾燥純製劑相比，包括有效地維持或降低粉末聚集水平(也就是，不溶性或可溶性聚集水平)的起穩定作用的賦形劑。具體地，起穩定作用的賦形劑包括糖、胺基酸和包括2至5個胺基酸的寡聚體。
在一實施方式中，起穩定作用的賦形劑是蔗糖或棉子糖。
在另一實施方式中，起穩定作用的賦形劑是亮氨酸、異亮氨酸或正亮氨酸。
然而在另一實施方式中，起穩定作用的賦形劑是三亮氨酸。
在本發明中一具體實施方式
中，噴霧乾燥微粒中穩定劑的量小於或等於大約重量的30％。
然而在另一具體實施方式
中，本發明的噴霧乾燥粉末包括至少大約重量50％的4α-螺旋束蛋白例如人生長激素。
本發明中噴霧乾燥粉末在貯藏過程也是穩定的，這樣以致在某些實施方式中，40℃貯藏1個月後，保持小於大約10％的總聚集量。
然而在本發明的另一實施方式中，在最佳噴霧乾燥條件下噴霧乾燥4α-螺旋束蛋白，以致於不需要添加穩定劑。使人吃驚地，純噴霧乾燥操作法可有效地產生含蛋白質聚集(可溶性和不溶性)量最少(也就是小於10％)、良好分散性(大於65％和優選70％的噴射劑量)和小空氣動力學微粒尺寸(MMAD小於大約4微米)的噴霧乾燥微粒。
在另一方面，本發明提供的製劑和噴霧乾燥條件使誘導4α-螺旋束蛋白二級結構變化減到最少，也就是α-螺旋很大程度上得到保持。特別地，本發明提供的噴霧乾燥粉劑通過FTIR或圓二色光譜(CD)測量，相對於噴霧乾燥前的天然結構，α-螺旋損失不超過大約50％、優選不超過40％、更優選不超過30％和甚至更優選不超過10-20％。本發明噴霧乾燥製劑使用的特別優選的構象穩定劑和溶劑是能使蛋白質α-螺旋和不受歡迎的β-摺疊保持穩定的那些試劑，包括醇類特別是乙醇。本發明在保持蛋白質α-螺旋性這個方面的一個實施方式中，預噴霧乾燥溶液的固體濃度小於2mg/ml。
結合後附的實施例，根據下列詳細描述本發明的這些和其他的目標和性質會變得更明顯。發明的詳細描述I.定義本文下列採用的術語有指定的含義。
正如本文所用，生長激素可能是來自任何來源如鳥、牛、馬、人、綿羊和豬的生長激素，最優選人生長激素。對於蛋白質活性劑，例如，本文所描述的任何4α-螺旋束蛋白，就它們保持與標準長度肽/蛋白質相關的治療活性的合理程度來說，本發明計劃使用天然和合成或重組衍生的蛋白質，以及它們的類似物。
正如本文所用，術語「類似物」指其中一個或多個胺基酸已經被取代、消除(也就是，片斷)、添加(例如，N-或C-末端延長的衍生物例如Met-hGH)或另外對天然(野生型)人類序列進行修飾並且顯示至少大約10、20、30或40％、優選至少50％、60％或70％和更優選至少80％、90％、95％、100％或超過100％天然(非-合成)、內源性肽生物活性的蛋白質。
「胺基酸」指同時含有氨基和羧基的任何化合物。雖然氨基最通常出現在鄰近羧基的位置，但是氨基可以位於分子內的任何位置。胺基酸也可以含有另外的官能團，例如，氨基、硫代、羧基、羧醯胺、咪唑等。胺基酸可以是合成的和自然存在的，也可以採用它的外消旋或旋光活性(D-或L-)形式，包括各種比例的立體異構體形式使用。
「亮氨酸」指包括D-亮氨酸、L-亮氨酸、外消旋亮氨酸和各種比例的這兩個對映體。
依照本發明，「純」製劑指含4α-螺旋蛋白和任選緩衝物(一般是乾粉重量的0-15％)的噴霧乾燥粉末，實質上不含額外賦形劑，也就是額外賦形劑含量小於大約重量1％。
「肽」是由每一個通過肽鍵相連少於大約100個胺基酸組成。肽可以是均-或雜-肽(也就是，由同一的或不同的如上面定義的胺基酸殘基組成)，並且其長度變化可以從2個胺基酸到大約100個胺基酸。
「二肽」，本文也指二聚體，指由2個通過肽鍵相連的胺基酸組成的肽。
「三肽」，本文也指三聚體，指由3個胺基酸組成的肽。
「蛋白質」是由100個或更多胺基酸組成的大分子。
「總蛋白聚集」指相對於100％單體4α-螺旋蛋白，可溶性和不溶性蛋白聚集物的百分比，分別用尺寸排阻色譜法和紫外光譜法測定。
「聚集水平」指可溶性或不溶性聚集物，除非另有說明。
「表面活性」材料指有表面活性(測量，例如表面張力測量法)、和以具有能減少其所溶入液體的表面張力為特徵的材料。與液體和另一相之間界面相關的表面張力是液體的特性，這是由於表層分子有向內的吸引力。
「快速作用」乾粉指當吸入給藥時粉末不具有控釋或緩釋特性。
正如本文所用，「含水溶劑」指水或包括水和一種或多種可與水混溶共溶劑的混合溶劑系統。
「乾粉」指一般含有少於大約10％水分、優選少於7％水分、更優選含有少於大約5-6％水分、甚至更優選含有少於大約3％水分和最優選含有少於2％水分的粉末製劑，根據粉末製劑中活性劑類型來確定。
「適合肺部給藥」的「可吸入」於粉指包括能夠(i)容易分散於或通過吸入器容易分散，和(ii)受試者吸入後至少部分微粒到達肺部以允許其滲透至肺泡的固體(也就是非溶液)微粒的製劑。這種粉末被認為是「適於呼吸的」或「可吸入的」。
「成煙霧狀散開的」微粒指當該微粒通過被動或自動吸入器分散入氣流時能保持在氣流中懸浮一段足夠長的時間以使至少部分微粒被病人吸入，從而使吸入微粒的一部分可到達肺部的微粒。
「噴射劑量」或「ED」提供在起動或分散動作發生後來自合適吸入器的藥物製劑的輸送指標。更具體地，對於乾粉製劑，ED是從單位劑量包裝和吸入器管口出來粉劑百分比的測量標準。ED被定義為吸入器輸送劑量與額定劑量(也就是，起動前置入適當吸入器的每單位劑量粉劑的質量)的比例。ED是一個實驗測定的參數，一般使用模擬病人給藥的體外儀器測定。為了測定ED值，乾粉額定劑量，一般以單位劑量形式，放入合適的、隨後驅動和分散粉末的乾粉吸入器(例如美國專利No.5,785,049描述的那樣，轉讓給吸入治療系統公司)。所產生的煙霧雲被儀器的真空吸入，在這裡它被貼近儀器管口的配衡過濾器捕獲。到達過濾器的粉末量組成噴射劑量。例如，對於放入吸入器的含5mg乾粉劑型，如果粉末分散導致如上所描述的配衡過濾器回收4mg粉末，於是乾粉製劑的噴射劑量是4mg(釋放劑量)/5mg(額定劑量)×100＝80％。對於非-均質粉末，ED值提供自起動後吸入器藥物的輸送指標而不是乾粉的輸送指標，是以藥物的量而不是粉末總重量為基礎。同樣地對於MDI劑型，ED相應於從劑量形式和吸入器管口噴射出藥物的百分比。
本發明上下文中的「無表面活性劑」指包括少於大約重量0.1％表面活性劑的噴霧乾燥粉末。
「細粒量」(FPD＜3.3μm)提供了煙霧劑質量的測量標準，並定義為階式碰撞法在3.3微米(FPD＜3.3μm)測定的粉末量。當以1cfm(28.3L/min)流速操作時，這個參數與安德森撞擊器3級時的總量相關，並提供體外估算輸送給病人3.3微米以下的劑量。
「細粒百分率」(FPF＜3.μm)提供從單位劑量形式(例如，起泡包裝)至肺部深處的煙霧化粉末輸送效率的測量標準，並且用以每分鐘28.3升真空操作短排氣道安德森階式撞擊取樣器的實驗方法來檢測。FPF用百分比表示，定義為相對於單位劑量形式中含有的粉末量(毫克)，小於3.3微米微粒尺寸的煙霧化粉末的總量(毫克)。
「可分散的」或「可成煙霧狀散開的」粉末指ED值至少大約30％、更優選40-50％、甚至更優選至少大約50-60％或更大的粉末。具有優良成煙霧狀散開性的粉末，其ED值至少大約65％或更大。
「質量中位直徑(mass median diameter)」或「MMD」是平均微粒尺寸測量標準，因為本發明的粉劑一般是多分散的(也就是，由一定範圍內尺寸的微粒組成)。本文報告的MMD值通過離心沉降法檢測，雖然許多通常採用的技術(例如，電子顯微鏡、光散射、雷射衍射)也能夠用來測量平均微粒尺寸。
「質量中位空氣動力學直徑(mass median aerodynamic diameter)」或「MMAD」是分散微粒的空氣動力學粒徑測量標準。根據其沉澱行為，空氣動力學直徑用於描述成煙霧狀散開的粉末，而且是在空氣中具有相同沉澱速度的單位密度微球的微粒的直徑。空氣動力學直徑包括微粒形狀、密度和微粒的實際尺寸。正如本文所用，MMAD指用階式碰撞法測定的成煙霧狀散開粉末的空氣動力學微粒尺寸分布範圍的中點或中值，除非另有說明。
「可藥用鹽」包括，但不限制於，用無機酸製備的鹽，例如氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、溴化物和硝酸鹽，或用有機酸製備的鹽，例如蘋果酸鹽、馬來酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、乙基琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、對甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、水楊酸鹽和硬脂酸鹽，及依託酸鹽(estolate)、葡庚糖酸鹽和乳糖酸鹽。同樣地，含可藥用陽離子包括，但是不限於，鋰、鈉、鉀、鋇、鈣、鋁和銨(包括烷基取代銨)。
「可藥用賦形劑或載體」指可以任選地包含於本發明製劑中並且被吸入肺部後對受試者特別是對受試者的肺部沒有顯著的毒副作用的賦形劑。
「藥理有效量」或「生理有效量」指如本文所描述的微粒狀乾燥粉末製劑含有的4-α螺旋束蛋白量是當這樣的製劑被給予肺部時需要在受試者血流中能提供理想的蛋白質水平以產生預期生理應答。精確的劑量依賴許多因素，例如，4-α螺旋束蛋白、製劑的活性、使用的特定吸入器、粉末的物理特性、擬定病人的使用量(也就是，每天給藥量的劑量)、病人的顧慮等等，根據本文提供的信息，本領域技術人員能容易地確定。II.製劑組分本發明部分地基於申請者發現噴霧乾燥分子特別是蛋白質如4-α螺旋束蛋白以製備穩定的、非聚集的適於呼吸應用的乾粉的最佳條件。發明者面臨的挑戰是使影響蛋白質聚集、脫醯胺(降解)和變性的各種因素與那些影響空氣動力學微粒尺寸和微粒分散性及貯藏穩定性的因素保持平衡。這些因素經常在相反的方向起作用，以致使蛋白質聚集最小化的條件經常導致微粒具有不適合吸入療法的特性(例如，大的微粒尺寸、低分散性)。
下面描述的是優選的起穩定作用的賦形劑和製劑組分，當結合下面更詳細描述的特殊噴霧乾燥操作參數使用時，其有效地為蛋白質掩蔽/防護噴霧乾燥的苛刻條件，以致這些本來導致蛋白質很大程度上聚集的條件適合，並且通常是形成適於呼吸微粒的最佳條件。不受任何特殊理論的束縛，穩定劑可以通過多種途徑起作用，例如，通過降低表面張力、增加擴散、與防止伸展起穩定作用的蛋白質憎水/離子聯合、緩衝等。因而，採用這些穩定劑不但使蛋白質聚集最小化，而且提高所得噴霧乾燥製劑的煙霧劑性能，並且在一些情況下，在先前不知道的或做不到的可成氣霧劑，特別是可成煙霧狀散開的4-α螺旋束蛋白製劑的情況下提供可成煙霧狀散開的製劑。
現在描述本發明中噴霧乾燥組合物的組分。A.4-α螺旋束蛋白本發明涉及但不限於蛋白質藥用劑，特別是4α-螺旋束蛋白。屬於這個結構家族的蛋白質包括G-CSF、生長激素，IFN-γ、IFN-β、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5和M-CSF。雖然在序列水平上，具有限制性同源，這些生長因子和細胞因子共享4個以反手連接環的螺旋拓撲結構(A-D)。更具體地，這些蛋白質在構象結構上共享共同的摺疊，以具有上-上-下-下、反向平行、左手手性、帶雙反手環拓撲結構的4-α螺旋束為特徵。一個說明性的4α-螺旋蛋白，IL-2，在其天然結構中，具有大約42-63％的α螺旋，帶有很少或無β-摺疊(Tzannis，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，935460(1996))。本發明的目標之一就是為了在噴霧乾燥過程中保持蛋白質α-螺旋二級結構，同時抑制β-摺疊構造，以製備適於呼吸的蛋白質粉末。
本文所描述的方法和製劑特別適合用於生長因子如生長激素，特別是人生長激素。人生長激素(hGH)是由垂體前葉腺以脈衝方式分泌的蛋白質，其對生長的調節來說必不可少。hGH是由191個胺基酸組成的，分子量大約22 kDa以及pI接近5.3的單鏈多肽。在整個生命過程中hGH刺激骨骼生長，並且對體內營養物、碳水化合物、蛋白質和脂類的正常代謝來說必不可少。其在蛋白質的代謝中扮演重要角色，因為其通過使用脂肪作為更有效的能源而趨向於增加蛋白質合成(合成代謝)和減少蛋白質破壞(分解代謝)。在兒童時期天然hGH分泌量很高，在青少年時期達到最高水平，然後在成年期降低到其最低水平。本發明製劑中使用的人生長激素一般通過重組製備(例如，通過大腸桿菌)或來自垂體。
製劑中4α-螺旋蛋白的量將是為獲得理想結果每單位劑量輸送治療有效量蛋白質的必須量。實際上，根據特殊的藥劑、其活性、被治療疾病的嚴重程度、病人的種群、劑量要求和期待的治療效果，這將會有很大的變化。無論何處，製劑一般含有從大約重量的1％至大約重量99％的活性蛋白質，典型的是從大約重量的2％至大約重量95％的活性蛋白質，更典型的是從大約重量5％至85％的4α-螺旋束蛋白，並且也取決於製劑中含有的賦形劑/添加劑的相對量。更具體地，噴霧乾燥製劑通常含有至少大約為下述百分數的下列活性物質之一10％、20％、30％、40％、50％或更高重量比的4α-螺旋束蛋白。優選地，噴霧乾燥粉末含有至少大約50％，例如大約重量50-100％的4α-螺旋束蛋白如人生長激素。在本發明的具體實施方式
中，噴霧乾燥粉末包括至少大約重量60％的4α-螺旋束蛋白，甚至更優選至少大約重量70％的4α-螺旋束蛋白(例如，大約70％-100％活性蛋白)，更優選至少大約重量80％或更多的4α-螺旋束蛋白(重量80-100％的活性蛋白)，或者大約重量90-100％的4α-螺旋束蛋白。一般而言，期望微粒有高蛋白質含量。本發明的噴霧乾燥製劑對輸送劑量從0.001mg/天至100mg/天、優選劑量從0.01mg/天至75mg/天、更優選劑量從0.10mg/天至50mg/天的蛋白質例如4α-螺旋束蛋白特別有用。B.增強穩定性的賦形劑在一些實例中，本發明的製劑包括一種或多種起保護作用或穩定作用的賦形劑。正如上面所討論的，本發明的一個方面是基於申請人發現，當結合最佳噴霧乾燥條件使用時，某些賦形劑或添加劑(例如，胺基酸如亮氨酸，寡聚體如三亮氨酸，糖如蔗糖、甘露醇和棉子糖，和鹽類如氯化鈉、氯化鉀等等)不但在使蛋白質聚集最小化方面，而且在減小所得粉末製劑空氣動力學尺寸和增加所得粉末製劑分散性方面是優異的，正如使用示範蛋白質、人生長激素(hGH)的實施例所顯示的那樣。而且，本發明示範製劑中的幾個在延長的儲藏中是穩定的，也就是，聚集水平在貯藏時不會有大地增加。
穩定劑的實例包括胺基酸，肽，特別是包括2-9個胺基酸的寡聚體、更優選2-5聚體和多肽，所有這些可以是同種或雜種。作為4α-螺旋束蛋白穩定劑使用的胺基酸包括甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、纈氨酸(val)、正纈氨酸(2-氨基戊酸)、2-氨基庚酸、亮氨酸(leu)、異亮氨酸(ile)、蛋氨酸(met)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、絲氨酸(ser)、蘇氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬醯胺(asp)、穀氨酸(glu)、賴氨酸(lys)、精氨酸(arg)、組氨酸(his)、正亮氨酸(nor)及其修飾的形式。優選的胺基酸如亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、2-氨基庚酸、苯丙氨酸和色氨酸。特別優選起穩定作用的胺基酸/賦形劑是亮氨酸、異亮氨酸和正亮氨酸。
在考慮到優選胺基酸穩定劑的特徵，優選那些水中溶解性相對低胺基酸，例如，從大約10mg/ml至75mg/ml。不受任何理論的束縛，降低的水溶性導致減少所得噴霧乾燥粉末的水分吸附和延遲析晶，對於本發明中適合呼吸的粉末而言，這兩個都是理想的特徵(例如，在這點上，亮氨酸比組氨酸優選，組氨酸比丙氨酸優選，丙氨酸比甘氨酸優選)。也優選具有稍大範德瓦爾斯體積例如大於大約100A3的胺基酸，例如，異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸。增大範德瓦爾斯體積往往是與所得噴霧乾燥藥粉Tg提高相關，因而預示更大貯藏穩定性。同樣優先疏水性胺基酸，如亮氨酸(leu)、纈氨酸(val)、異亮氨酸(isoleu)、色氨酸(try)、丙氨酸(ala)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、組氨酸(his)和脯氨酸(pro)。優選胺基酸穩定劑的另一個因素是降低水表面張力的能力，其與所得噴霧乾燥微粒的更低MMD和減少的蛋白質聚集相關；有效降低水表面張力的表面活性胺基酸包括天冬醯胺、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和纈氨酸。同時優選玻璃態轉變溫度大於40℃、更優選大於50℃、甚至更優選大於60℃、最優選70℃或更高的胺基酸。噴霧乾燥粉末中包含這些胺基酸通常可以改善煙霧劑性能，特別是MMAD和ED，大約為10-25％。一種特別優選的胺基酸是亮氨酸，由於其表面活性，其往往富集在噴霧乾燥微粒的表面，也就是，亮氨酸在噴霧乾燥蛋白微粒表面的濃度通常比其在粉末本體的濃度要高。其他能夠在噴霧乾燥蛋白微粒表面富集的表面活性胺基酸包括天冬醯胺、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸和纈氨酸。這代表本發明中穩定劑的另一個優選性質-在噴霧乾燥過程中保護或遮掩藥劑例如4α-螺旋蛋白的傾向。在這個特定的實施方案中，藥劑被穩定劑分子在霧滴表面屏蔽以防禦噴霧乾燥的惡劣條件。在這種情況下，穩定劑不是封裝劑，也不形成離散的塗層，而只是簡單地以較大濃度形式積聚在噴霧乾燥過程霧滴的表面，產生具有穩定劑濃度提高表面的微粒。
同樣，優選作為穩定劑使用的是含有2個和多個亮氨醯殘基的二肽和三肽，如吸入治療系統公司的國際專利公布WO01/32144所描述，其全文作為參考而引入本文。這類穩定劑的代表是二亮氨酸和三亮氨酸。含二-亮氨醯的三聚體含有2個相鄰的亮氨醯殘基(在位點1和2)，或者他們能夠形成三聚體的末端(佔據位點1和3)。三聚體含有的其餘胺基酸可以是上面章節I所定義的任何胺基酸。合適的胺基酸例如甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、纈氨酸(val)、亮氨酸(leu)、異亮氨酸(ile)、蛋氨酸(met)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、絲氨酸(ser)、蘇氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬醯胺(asp)、穀氨酸(glu)、賴氨酸(lys)、精氨酸(arg)、組氨酸(his)、正亮氨酸(nor)及其修飾的形式。優選地，對於含有二-亮氨醯的三聚體，三聚體的第三個胺基酸成分是下列之一亮氨酸(leu)、纈氨酸(val)、異亮氨酸(isoleu)、色氨酸(try)、丙氨酸(ala)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、組氨酸(his)和脯氨酸(pro)。本發明採用的三聚體的實例包括但是不限於下列leu-leu-gly，leu-leu-ala，leu-leu-val，leu-leu-leu，leu-leu-ile，leu-leu-met，leu-leu-pro，leu-leu-phe，leu-leu-trp，leu-leu-ser，leu-leu-thr，leu-leu-cys，leu-leu-tyr，leu-leu-asp，leu-leu-glu，leu-leu-lys，leu-leu-arg，leu-leu-his，leu-leu-nor，leu-gly-leu，leu-ala-leu，leu-val-leu，leu-ile-leu，leu-met-leu，leu-pro-leu，leu-phe-leu，leu-trp-leu，leu-ser-leu，leu-thr-leu，leu-cys-leu，leu-try-leu，leu-asp-leu，leu-glu-leu，leu-lys-leu，leu-arg-leu，leu-his-leu，和leu-nor-leu。
由以上描述胺基酸任何組合組成的二聚體和三聚體也適合在本發明使用。最優選含有至少下列胺基酸中的兩個的二聚體和三聚體亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
雖然由於它們在水中有限的溶解性而成為非優選，本發明另外採用的穩定性和成煙霧狀散開性能增強肽是含有如上所述胺基酸的任何組合的4-聚體和5-聚體。更優選地，4-聚體或5-聚體將包括2個或多個亮氨酸殘基。這些亮氨酸殘基可以出現在肽內的任何位點，而其餘(也就是非-亮氨醯)胺基酸的位點被如上所述任何胺基酸佔據，條件是所得4-聚體或5-聚體在水中溶解度至少大約是1mg/ml。優選地，4-聚體或5-聚體中非-亮氨醯胺基酸是親水性胺基酸例如賴氨酸，因此增加了肽在水中的溶解度。
也優選其玻璃態轉變溫度大於40℃、更優選大於50℃、甚至更優選大於60℃、最優選70℃的二肽和三肽。
聚胺基酸，特別是包括本文所述任何胺基酸的那些，也適合作為穩定劑使用。優選聚胺基酸如聚-賴氨酸、聚-穀氨酸和聚(lys、ala)。
在噴霧乾燥中為保護蛋白質方面同樣適合使用的是糖類賦形劑，糖類(例如，糖、衍生糖例如糖醇、醛糖酸、酯化糖和糖多聚體)，特別是蔗糖。適合本發明使用的糖類賦形劑，例如，單糖如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等等；多糖如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、澱粉等等；和糖醇如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等等。優選非還原糖、在噴霧乾燥固體中能與蛋白質一起形成無定形或玻璃相的糖，和具有相對高Tg的糖(例如，Tg大於40℃，優選大於50℃，更優選大於60℃，甚至更優選大於70℃，最優選大於80℃和更高)。特別優選的起穩定作用的賦形劑是蔗糖、甘露糖和海藻糖，從實施例也能看出。
在噴霧乾燥中有利的4α-螺旋蛋白是電解液，優選強電解液。在申請者進行的初步研究中，發現向含4α-螺旋蛋白液體製劑摻入調節溶液離子強度的電解液(例如，許多可藥用無機鹽中任何一種，例如氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硝酸鉀等等)，也有效地「屏蔽」噴霧乾燥中的蛋白質。不受任何理論的束縛，假定由於溶液中電解質濃度的增加，在噴霧乾燥過程，離子趨向於在霧滴表面富集，因此，在噴霧乾燥過程，可以保護或屏蔽霧滴中心的活性蛋白質。
本製劑和方法中有用的另外賦形劑和添加劑在吸入治療系統公司的國際專利公布No.WO96/32096和《藥用賦形劑手冊》(「Handbookof Pharmaceutical Excipients」)第三版，Kibbe，A.H.主編(2000)中提供。優選玻璃態轉變溫度(Tg)高於大約35℃、優選高於大約40℃、更優選高於45℃和最優選高於大約55℃的賦形劑。
蛋白質賦形劑的實例包括白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、重組人類白蛋白(rHA)、凝膠、酪蛋白、血紅蛋白等等。本發明的製劑也包括緩衝劑或pH調節劑，通常但不是必需為用有機酸或鹼製備的鹽。代表性的緩衝劑包括檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二甲酸的有機酸鹽。其他合適的緩衝劑包括三羥甲基氨基甲烷(Tris)、氨基丁三醇鹽酸化物、硼酸鹽、磷酸甘油和磷酸鹽。胺基酸如甘氨酸也是合適的。
本發明的噴霧乾燥製劑通常被認為是快速作用，也就是當吸入給藥時，它們不顯示控釋或緩釋特徵。一般而言，本發明的製劑是非微球和非脂質體，並且其微粒趨向於非中空。而且，本發明的噴霧乾燥的人生長激素微粒不含表面活性劑，在模型蛋白，乳酸脫氫酶中表面活性劑對噴霧乾燥產品的貯藏穩定性產生不利影響(Adler，M.；Lee，G.，J.Pharm SciFeb 88(2)199-208(1999))。令人驚訝地，申請人已經在沒有表面活性劑存在情況下製備出人生長激素非聚集噴霧乾燥粉劑，而以往的研究顯示表面活性劑對於防止噴霧中蛋白質的聚集是必不可少的(Maa，Y-F.等，J.Pharm Sci.，87(2)152-159(1998))。
本發明的製劑可以還包括矯臭劑、氣味掩飾劑、無機鹽(例如氯化鈉)、抗菌劑(氯化苯甲烴銨)、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如聚山梨醇酯如「吐溫20」和「吐溫80」和普流羅尼(pluronics)如F68和F88，購自BASF，雖然其濃度低於大約重量的0.1％)、山梨聚糖酯、脂質體(例如，磷脂如卵磷脂和其他卵磷脂、磷脂醯乙醇胺，雖然不優選脂質形式)、脂肪酸和脂肪酯、類固醇(例如膽固醇)和螯合劑(例如EDTA、鋅和其他這類合適的陽離子)。當使用4α-螺旋蛋白粉時，普流羅尼通常的百分率低於大約重量的1％，更優選百分率低於大約重量的0.1％。本發明優選的賦形劑組合包括pluronic如F68和三亮氨酸。本發明的製劑和方法所採用優選的陽離子包括鋁、錳、鋅和鎂。當存在時，這些陽離子通常以從大約50∶1陽離子(mol)/蛋白質(mol)至大約1∶1、更優選在大約20∶1和2∶1之間變化的相對摩爾量存在。特別優選含有陽離子與蛋白質的摩爾比為大約2∶1、7∶1、10∶1、15∶1、和20∶1的製劑。這些比率中特別優選的是陽離子、鋅，雖然在即使與缺乏鋅或其他二價陽離子條件下也可獲得無顯著水平可溶性聚集物的噴霧乾燥製劑。優選地，該製劑缺乏滲透增強劑，或如果有，這些增強劑通常以小劑量形式出現，例如，少於大約乾燥固體重量的10％左右，更優選少於大約5％。其他適合本發明製劑使用的藥用賦形劑和/或添加劑列於「Remington∶TheScience Practice of Pharmacy」，第19版，Williams Williams，(1995)，和「Physician’s Desk Reference」，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)。
通常，本發明藥劑含有大約重量的1％至大約99％穩定劑，優選大約重量5％-98％穩定劑，更優選大約重量的15-95％穩定劑。甚至更優選的，噴霧乾燥製劑含有大約重量的0-40％穩定劑，更優選大約重量的0-30％穩定劑，例如，優選的製劑將含有下列的任何量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30重量％穩定劑。通常，期望噴霧乾燥微粒中蛋白質濃度高，特別是噴霧乾燥人生長激素。因此，本發明的穩定劑在噴霧乾燥過程中通常非常有效地保護蛋白質，因為它們以少於大約重量(固體)30％的理想濃度存在。通常，穩定劑最佳量通過實驗來確定，也就是通過製備含有不同劑量穩定劑(從低到高變化)的製劑，檢測所得將噴霧乾燥製劑的蛋白質聚集、MMADs和分散性，然後進一步研究獲得最佳煙霧劑性能而對蛋白質聚集和貯藏穩定性無顯著副作用的範圍。III.製備乾粉本發明乾粉製劑通過在使蛋白質聚集度最小化的條件下通過噴霧乾燥製備。例如，製劑的噴霧乾燥通常按照「Spray Dry Handbook」，第5版，K.Masters，John WileySons，Inc.，NY，NY(1991)和Platz，R.，等，國際專利公開號WO97/41833(1997)和WO96/32149(1996)的描述進行，這些內容作為參考而引入本文。
藥劑，優選4α-螺旋蛋白如生長激素，通常由水溶液和懸浮液噴霧乾燥，根據活性蛋白在所用pH範圍的溶解性。採用這種方法，4α-螺旋蛋白首先在水裡溶解或懸浮，任選地含有生理可接受的緩衝劑。在一優選的實施方案中，蛋白質(例如，hGH)溶解在水溶液中。含活性劑溶液的pH範圍通常在大約3至11之間，更通常在大約3.5-9，在一些實例中，優選接近中性pH(5.5-7.8)，因為此pH有助於粉末在肺部分散後保持生理相容性。因此在蛋白質的pI、其上或下的pH配製溶液。也就是說，液體製劑在大約3-4、4-5、5-6、6-7、7-8或8-9範圍的pH被噴霧乾燥。正如本文實施例顯示，令人驚訝地在低pH條件下，也就是，在低於大約4(3.5-4)pH條件下，噴霧乾燥hGH粉末獲得了優良煙霧劑性能。然而，當在接近中性pH(7-8)條件下噴霧乾燥時，也獲得合適的粉末。在本發明的一項實施方式中，4-α-螺旋蛋白如hGH的懸浮液在大約等於其pI(等電點)的pH條件下被噴霧乾燥，在hGH的情況下，其等電點是5.3。在本發明一個特別優選的實施方式中，在pH5.3時包括三亮氨酸溶液和懸浮的4α-螺旋蛋白，hGH的懸浮液被噴霧乾燥。
水性製劑可任選地含有另外可與水混溶的溶劑，如丙酮、醇類等等。代表性的醇類是低級醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇等等。這些混合溶劑系統通常含有大約0-80％與水易混溶的溶劑，更優選大約20-40％，最優選大約10-30％與水易混溶的溶劑。噴霧乾燥溶液一般含有0.01％(重量/體積)至大約20％(重量/體積)，通常0.05％至10％(重量/體積，例如，mg/ml)，優選大約0.1至2％(重量/體積，也就是說，1-20mg/ml)濃度的溶解固體。具體地，噴霧乾燥前製劑通常具有下列固體濃度之一0.1mg/ml或更大，0.5mg/ml或更大，1mg/ml或更大，1.5mg/ml或更大，2mg/ml或更大，3mg/ml或更大，4mg/ml或更大，或5mg/ml或更大。優選固體濃度為大約10-15mg/ml。在本發明的一項實施方式中，蛋白質在固體濃度為0.1mg/ml時被噴霧乾燥，其有效地提供蛋白質天然構象得到保持的噴霧乾燥固體。因此本發明優選的實施方式是在噴霧乾燥過程採用最佳固體濃度，任選地使用1個或多個穩定劑，以提供具有最小蛋白質聚集和優良煙霧劑特性的適於呼吸的粉末。
同樣，當在維持蛋白質α螺旋性(如上所述)的固體濃度操作時，優選在優選蛋白質濃度範圍的高端(也就是，較高的固體含量)噴霧乾燥，因為更高的蛋白質濃度相當於霧滴中蛋白質含量高，其將減少霧滴表面上由於與氣-水界面接觸而變性的蛋白質相對百分率。因此，如果假設只有一部分蛋白質分子位於霧滴表面，並且只有這些分子易於(或至少最易於)變性，於是其餘處於非表面的蛋白質分子代表「受保護的有效載荷」。
然後，在常規的噴霧乾燥器，例如購自供應商如Niro A/S(Denmark)、Buchi(Switzerland)等等的那些，將溶液噴霧乾燥獲得分散的乾粉。噴霧乾燥溶液的最佳條件根據製劑組分變化，並且通常由實驗來確定。用於噴霧乾燥物質的氣體通常是空氣，雖然惰性氣體例如氮或氬也是合適的。而且，用於乾燥噴霧物質氣體的入口和出口溫度是不會引起噴霧物質中活性劑分解的溫度。這個溫度通常通過實驗來確定，雖然通常入口溫度從約50℃變化至約200℃，而出口溫度從約30℃變化至約150℃。優選參數包括在大約20-150psi範圍的霧化壓力，優選大約30-40至100psi。通常採用的霧化壓力為下列之一(psi)20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120或更高。噴霧乾燥粉末在物理性質上與其他蒸發乾燥方法製備的粉末截然不同，通常顯示在與通過其他乾燥方法如凍幹法製備的粉末不同的形態和熱史(包括玻璃態轉變溫度、玻璃態轉變寬度和焓弛豫曲線)。
一旦被製備，在製備、加工和貯藏過程中4α-螺旋蛋白乾粉製劑優選在乾燥(也就是說相對低的溼度)條件下進行。不考慮採用的特定的乾燥參數，噴霧乾燥操作優選獲得可吸入的、非-蛋白質聚集的、包括活性4α-螺旋束蛋白，優選人生長激素的高度分散微粒。V.乾粉製劑特徵本發明的粉劑還具有幾個性質的特徵，最值得注意的是(i)即使在貯藏階段也能保持始終如一的高度分散性，(ii)小空氣動力學微粒尺寸(MMADs)，(iii)改善的細粒劑量值，也就是，有尺寸小於3.3微米MMAD微粒更高百分率的粉劑，所有這些有助於改善蛋白質如hGH進行全身治療時粉末滲透入下呼吸道(也就是肺泡)組織的能力。本發明噴霧乾燥粉劑的這些物理性質，下面將更充分地描述，將這些粉末噴霧輸送至肺部深處的效率最大化是重要的。
本發明的乾粉劑由能有效滲透入肺部的可霧化微粒組成。本發明微粒的質量中位直徑小於大約20μm，優選小於大約10μm，更優選小於7.5μm，最優選小於大約4μm，甚至更優選小於大約3.5μm，通常在0.1μm至5μm直徑範圍。優選由大約0.2至4.0μm MMD微粒組成的粉劑。在某種條件下，粉劑也包括非適於呼吸的載體微粒如乳糖，這裡非適於呼吸的微粒尺寸通常大於40微米。
本發明粉劑還具有煙霧劑微粒尺寸分布小於大約10μm質量中位空氣動力學直徑(MMAD)的特徵，優選MMAD小於大約5μm，更優選小於大約4.0μm，甚至更優選小於大約3.5μm，最優選小於大約3μm。粉劑的特徵在於質量中位空氣動力學直徑範圍是大約0.1-10μm，優選大約0.2-5.0μm MMAD，更優選大約1.0-4.0μm MMAD，甚至更優選大約1.5至3.0μm。示範性噴霧乾燥hGH粉末的例證性MMAD值在實施例中提供。這些實施例中有幾個證明了通過最佳噴霧乾燥條件和選擇及穩定劑濃度聯合使用而獲得煙霧劑微粒尺寸分布的改善。
本發明粉劑還具有它們的密度特徵。該粉劑一般具有大約0.1至10g/立方釐米的堆集密度，優選大約0.1-2g/立方釐米，更優選大約0.15-1.5g/立方釐米。
該粉劑一般含水量低於大約重量的20％，通常低於大約重量的10％，優選低於大約重量6％。更優選地，噴霧乾燥粉末通常殘餘含水量低於大約3％，更優選低於大約2％，最優選在大約重量的0.5和2％之間。如此低含水量的固體傾向於更大的封裝和貯藏穩定性。通常，本發明的粉末是吸溼的，也就是，如果不貯藏在密封容器如起泡包裝，它們具有從空氣吸收水分的趨勢。
本發明製劑的最顯著特徵之一是它們的高度分散性，如ED值所顯示。本文描述的噴霧乾燥方法和穩定劑有效地提供比它們的非最佳相似物有更顯著改善分散性的製劑。通常，這些粉劑的噴射劑量(ED)大於30％，一般大於40％，更優選地，本發明粉劑的ED大於50％，經常大於55％。實際上，看看實施例，本發明的噴霧乾燥粉末通常具有超過65％的最佳ED值，通常在大約70-90％或更大的範圍。
另外用於描述乾粉總煙霧劑性能特徵的測量標準是描述空氣動力學直徑小於3.3微米粉末百分率的細粒百分率(FPF)。本發明粉劑特別適合肺部給藥，其FPF值在大約30％-64％或更多的範圍。優選含有至少大約30％、微粒尺寸低於3.3μm至大約0.5μm煙霧微粒的粉劑，並且當以煙霧劑形式給藥時，其非常有效地到達肺部的各部分，包括肺泡。
關於化學穩定性和物理穩定性，本文描述的製劑都具有良好的穩定性，也就是，隨著時間的過去煙霧劑性能不變。通常，關於化學穩定性，製劑中含有的4α-螺旋束蛋白在噴霧乾燥中降解不會多於大約10％。這就是說，粉劑具有至少大約90％完好的活性蛋白質，優選至少大約95％完好的活性蛋白質，甚至更優選含有至少大約97％或更多完好的活性蛋白質。優選地，噴霧乾燥操作產生具有少於大約10％的總蛋白聚集、優選少於大約7％總聚集、最優選少於5-6％總聚集的粉劑。更具體地，噴霧乾燥粉末通常有少於大約10％不溶性聚集物，優選少於大約7％不溶性聚集物，更優選含有少於大約5％不溶性聚集物。關於可溶性聚集物，噴霧乾燥粉末通常含有少於7％可溶性聚集物，優選少於6％可溶性聚集物，更優選少於5％可溶性聚集物，最優選少於4％、3％、2％或1％可溶性聚集物。噴霧乾燥微粒中單體總含量通常大於90％，更優選大於下列之一91％、92％、93％、94％或95％。而且，本發明製劑進一步顯示良好貯藏穩定性，其特徵是在40℃和環境相對溼度條件下貯藏1個月後總蛋白聚集量少於大約10％。換句話說，許多本發明示範生長激素製劑的總聚集含量在40℃貯藏1個月實質上保持不變，因而說明本發明獲得了可吸入生長激素製劑在噴霧乾燥和貯藏中的化學和物理穩定性的最佳平衡。
關於煙霧劑性能，本發明製劑的特徵在於在環境條件下貯藏3個月時噴射劑量減少不超過大約20％、優選不超過大約15％、更優選不超過10％。
本發明製劑對煙霧劑性能的改善和最小蛋白聚集能夠產生幾個相關優勢，例如(i)減少貴重藥物在吸入器中的損失，因為更多的粉末被煙霧化，所以使用者能夠吸入更多；(ii)減少每單位劑量所需乾粉的量，因為粉末煙霧化的高效率，(iii)減少每天吸入的次數，通過增加到達使用者肺部煙霧化藥量。VI.製劑給藥本文描述的製劑可以通過任何合適的乾粉吸入器(DPI)給藥，也就是，利用病人的吸入呼吸作為傳輸手段將藥物乾粉輸送至肺部的吸入器裝置。優選如Patton，J.S.等，美國專利No.5,458,135(1995)，Smith，A.E.，等，美國專利No.5,740,794(1998)；和Smith，A.E.等，美國專利No.5,785,049(1998)，Schuler，C.等，國際專利公開號WO01/00263所描述的吸入治療系統乾粉吸入裝置，作為參考而引入本文。
當使用這種類型裝置給藥時，粉末裝在一個帶有可穿孔蓋和其他入口表面的容器，優選起泡包裝或藥筒，其中容器可容納單次劑量單位或多次劑量單位。用可計量的乾粉藥物劑量填充於大量空腔(也就是，單位劑量包裝)的合適方法被描述，例如，在Parks，D.J.等，WO97/41031(1997)，作為參考而引入本文。
本文描述的同樣適合輸送粉劑的是在例如Cocozza，S.等美國專利No.3,906,950(1974)和Cocozza，S.等美國專利No.4,031,075(1997)所描述類型的乾粉吸入器，作為參考而引入本文，其中給予使用者的乾粉劑量按預定計量包含在硬膠囊。
其他肺部乾粉給藥的乾粉分散裝置包括下述文獻所述例如Newll，R.E.等，歐洲專利No.EP129985(1988)；Hodson，P.D.等，歐洲專利No.EP472598(1996)；Cocozza，S.等，歐洲專利No.EP467172(1994)，和Lloyd，L.J.等，美國專利No.5,522,385(1996)，以上作為參考而引入本文。同樣適合本發明乾粉給藥的是例如Astra-Draco「TURBUHALER」的吸入器。這種類型的裝置在Virtanen，R.，U.S.P4,668,281(1987)；Wetterlin，K.，等，U.S.P4,667,668(1987)；和Wetterlin，K.，等，U.S.P4,805,811(1989)有詳細的描述，所有這些作為參考而引入本文。其他合適的裝置包括例如Rotahaler_(Glaxo)，Discus_(Glaxo)，SpirosTM吸入器(Dura Pharmaceuticals)，和Spinhaler_(Fisons)的乾粉吸入器。同樣合適的裝置是採用使用活塞提供空氣以夾帶粉末藥物，由穿過篩子的經過空氣將藥物從推進器篩子噴出，或者在能隨後通過裝置管口將粉末給予病人的混合室裡混合空氣和粉末藥物，這些如Mulhauser，P.等，U.S.P5,388,572(1997)所描述，作為參考而引入本文。
乾粉也可以使用在藥用惰性液體推進物例如含氯氟烴或氟烴中含有藥物的溶液或懸浮液的，加壓、計量劑量吸入器(MDI)例如Ventolin_計量劑量吸入器來輸送，如Laube等，U.S.P5,320,094(1994)和Rubsamen，R.M.等，U.S.P5,672,581(1994)所描述，都是作為參考而引入本文。另外，本文描述的粉劑可以溶解或懸浮在例如水、乙醇或鹽水等溶劑中，並且通過噴霧給藥。用於輸送煙霧化溶液的噴霧器包括AERxTM(Aradigm)，Ultravent_(Mallinkrodt)，和Acorn II_(Marquest MedicalProducts)。
使用前，乾粉一般在環境條件下貯藏，優選在25℃或低於25℃的溫度下貯藏，並且相對溼度(RH)範圍在大約30至60％。更優選的相對溼度條件，例如低於大約30％，可以通過將乾燥劑放入劑型的二次包裝來完成。VII.應用本發明的製劑是有用的，當哺乳動物受試者肺部給予治療有效量，以治療或預防對如上面章節II.A所描述的與4α-螺旋束蛋白給藥相關的任何疾病。
具體地，示範性4α-螺旋束蛋白、hGH，當給予治療有效量，對於治療諸如兒童生長激素缺乏、成人生長激素缺乏、慢性腎功能不全和性功能延遲發育綜合症疾病是有用的。
本發明下列實施例是說明性的，並且不能被解釋為限制本發明的範圍。對於本領域技術人員而言，根據本文現有的公開、附圖
和權利要求書，這些實例的變化和相等物是顯而易見的。
本文參考的所有文章、書籍、專利和其他出版物的全文作為參考特此引入。
Des-phe人生長激素(Des-phe hGH)，BresaGen Limited，Adelaide，South Australia天然人生長激素，BresaGen Limited，Adelaide，South Australia
甲硫氨醯-人生長激素(met hGH)，BresaGen Limited，Adelaide，South AustraliaL-亮氨酸(Aldrich，St.Louis，MO)乙醇，2000標準強度(USP/NF，Spectrum Chemical Mfg.Corp.，New Brunswick，N.J.)甲醇(HPLC級，EM Industries，Gibbstown，N，J)三亮氨酸(Bachem California Inc，USA.Torrance，CA)磷酸鈉，二元，7-水合結晶J.T.Baker，批號M30150磷酸鈉，一元，單水合結晶J.T.Baker，批號M50156蔗糖J.T.Baker，批號N21593棉子糖，五水化物Pfanstiehl，批號25320A海藻糖，二水化物Spectum，批號OF0359IleSigma，98％，批號28H00462ValAldrich，99％，批號08311AUPheAldrich，99％，批號13022TSTrpAldrich，99％，批號12729HSB.方法.微粒尺寸測量(Horiba)粉劑的質量中位直徑(MMD)用Horiba CAPA-700微粒尺寸分析儀(Horiba Instruments inc.，Irvine，CA)測定。測量是基於懸浮介質中分散微粒的離心沉降。基於微粒Stokes』直徑的質量中位直徑通過微粒密度及懸浮介質密度和粘度來計算。
對於所有粉末，粉末密度設為1.5g/cm3。(這個標稱值被用於所有被分析粉末並且在通常噴霧乾燥粉末範圍內)。微粒尺寸測量通過將大約5-10mg粉末懸浮於5ml Sedisperse A-11(Micromeritics，Norcross，GA)並且用超聲波分散10分鐘的方法操作。微粒尺寸數據被收集的範圍被設為0.4至10.0μm。
微粒尺寸(VMD)微粒尺寸分布用2bar剪切力操作的SYMPATECHELOS微粒尺寸測定器來測量。與R2相對應的焦點距離結合1DR型檢測器使用。體積平均直徑(VMD)可從分布獲得。
化學穩定性通過反相HPLC(RP-HPLC)測定蛋白質純度/蛋白質降解程度。
含水量粉末殘存含水量通過使用Mitsubishi溼度測量計model#CA-06的Karl Fischer滴定分析技術測定。含水量也可以通過熱重量分析(TGA)測定。
可溶性聚集物測定可溶性聚集物通過使用裝有溶劑輸送系統、光電二級管陣列檢測器、溫度控制的自動進樣器和數據管理系統的Waters HPLC系統的尺寸排阻高壓液相色譜法或SEC來測定。
不溶性聚集物測定不溶性聚集物通過使用Shimadzu UV-2101 PC雙波長分光光度計的紫外光譜(UV)來測定。樣品被掃描波長範圍是360至240nm。通過測定溶液濁度對不溶性聚集物定量(Eckhardt，B.M.等，Pharm Res.，8(11)，1360-1364(1991)。空氣動力學微粒尺寸測定Andersen階式撞擊取樣器Andersen階式撞擊取樣器(帶有根據微粒尺寸大小通過慣性撞擊法捕獲板上微粒的一系列平臺的類似篩網的裝置)用於測定空氣流中煙霧化粉末製劑的MMAD和微粒尺寸分布。在測試前和測試後稱量該板，測定每階的板上沉積的粉末質量。除非另作說明，使用傳統的有8階(從頂部到底部為0至7階)的Andersen階式撞擊取樣器進行研究，當以28.3L/min流速操作時，其具有9.0至0.4μm範圍的截留尺寸和捕獲＜0.4μm微粒的最終過濾平臺。該裝置測試的設置與ED測試的結構相似，除了階式撞擊取樣器和美國藥典(USP)入口(USP23，章節601)接在管口而不是濾器上。多分散通常對每一階式撞擊行為進行處理以獲得重量上精確的數據。
Andersen短排氣道(SS)方法在SS方法中，平臺放置的順序跟上面所描述傳統Andersen階式撞擊取樣器的結構相比有所改變。從頂部，平臺0用於將入口錐體接在入口。緊接著在平臺0的下面安置平臺3，接下去是濾器平臺(平臺F)。含有粉末的氣流只穿過平臺0和3；空氣(而不是粉末)流過其他放在平臺F下適當位置以收集總體的剩餘。預稱量的濾器放置在平臺F上面並且捕獲＜3.3μm微粒。第二個濾器放置在平臺3下面的反向板層上面並且捕獲＞3.3μm微粒。對於本文所描述的研究，一個含有2mg粉末製劑的BP(起泡包裝)分散於煙霧劑給藥裝置，按照USP方法以28.3L/ml速率推進形成真空。每次6mg目標質量，重複此操作2次。然後，濾器被移開並稱重以測定沉積粉末的量。實施例1肺部給藥的純hGH製劑天然全長hGH(n-Hgh，BresaGen天然全長，目錄號hST-3，批號H057)在不加其他物質情況下(也就是，沒有賦形劑/穩定劑)被噴霧乾燥。所得粉末的物理和化學穩定性及煙霧劑性能在噴霧乾燥後和在3種不同溫度貯藏1個月後立即進行評價。
溶液製備噴霧乾燥之前，用帶YM-10膜的Amicon(微孔)超濾池將蛋白質透析過濾以除去工業製劑中含有的甘露醇和甘氨酸。含hGH(725mg)和5mM硫酸鈉的pH7.8溶液被製備。該液體製劑每毫升含有10mg固體(也就是說，1％總固體含量)。總固體的6.9％是緩衝物，總固體的93.1％是[hGH]，或是9.31mg/ml。
噴霧乾燥用帶有改進型旋風器(Platz，R.等，吸入治療系統公司，國際專利公開號WO97/41833，1997年11月13日)、霧化噴嘴和粉末收集器的Buchi 190小型噴霧乾燥器(Buchi Labortechnik AG，Meierseggstrasse，Switizerland)將純製劑噴霧乾燥。收集率大於70％；通常收集率在大約75-95％範圍。
粉末包裝和特徵描述在相對溼度低於5％的手套式操作箱裡將所得粉末手工填入5mg單位劑量包裝(起泡包裝，BP)。把BP裝入有乾燥劑的袋中，並且在3個不同溫度，4℃、25℃、40℃下貯藏1個月。然後用上面通常描述的方法評價粉末的物理(煙霧劑性能)和化學特性。
表1.噴霧乾燥的純hGH的特徵描述t＝0t＝1個月，4℃t＝1個月，25℃t＝1個月，40℃ED，％ 72 76 74 73MMAD，μ 3.53.83.4 3.6FPF 45％ 40％ 47％41％含水量 1.9％ 2.0％ 2.0％ 2.2％不溶性聚集物(UV) 1.4％ 1.8％ 2.0％ 1.8％可溶性聚集物(SEC)5％2％4％ 6％蛋白質純度97.0％ 96.8％ 96.0％ 94.7％以上數據表明，某些噴霧乾燥條件(固體濃度、霧化壓力、pH等等)能夠用於製備具有高度分散性(Ed大於70％)、良好空氣動力學尺寸範圍(MMAD平均為大約3.5微米)、蛋白質降解低(少於大約5％)和40℃貯藏時可溶性和不溶性總聚集物少於8％、在環境條件下貯藏少於大約6％、低溫貯藏時少於大約4％的hGH乾粉。實施例2不同操作條件下噴霧乾燥純hGH製備不含另外賦形劑/穩定劑的人生長激素水溶液，並用上面所描述方法在不同操作條件下噴霧乾燥以檢驗對所得粉末特性的影響。
相關操作參數和所得乾粉特性的總結在下表2提供。IA＝不溶性聚集物；SA＝可溶性聚集物。
表2噴霧乾燥的純hGH
以上數據進一步支持採用本文所描述優選用於製備噴霧乾燥中蛋白質聚集最少並且有優良煙霧劑特性(ED大於70％，MMAD平均為大約3微米)4α-螺旋束蛋白粉末的操作參數。實施例3含三亮氨酸的適於呼吸的噴霧乾燥hGH製劑本研究的目的是確定三亮氨酸對煙霧劑特性和噴霧乾燥Met-hGH一個月穩定性的影響。A.配方如下配製五種不同配方的溶液。濃度為7mg/ml(70％w/w)甲硫氨醯-人生長激素分別與濃度為1.5和3mg/ml三亮氨酸(L3)混合以製備分別含重量15％和30％三亮氨酸的粉末。調整這些溶液至pH3.6或7.8。類似地，製備含甲硫氨醯-人生長激素(10mg/ml)和硫酸鈉(5mM)的pH7.8水溶液。所有製劑在總固體含量為1％情況下被製備。B.噴霧乾燥上面所描述hGH溶液用如上面實施例1和2所描述的Buchi 190實驗室規模噴霧乾燥器噴霧乾燥；採用的霧化壓力是80psi。C.特徵描述噴霧乾燥Met-hGH粉末的煙霧劑特性和化學穩定性在下面提供表3.噴霧乾燥的hGH-三亮氨酸(L3)粉末15％L3 30％L3 0％L3 15％L3 30％L3PH 3.6PH 3.6 PH 7.8PH 7.8 PH 7.8ED 92％ 88％ 76％ 75％ 73％MMAD 2.63.1 3.3 3.33.1VMOD 2.32.5 1.9 1.72.0FPF 64％ 54％ 49％ 51％ 55％含水量0.9％ 0.9％1.0％ 1.3％ 1.3％不溶性聚集物可溶性聚集物1.0％ 1.8％2.5％ 0.4％ 0.5％蛋白質純度 95.3％ 95.8％ 95.2％95.9％ 95.7％以上數據顯示，當在噴霧乾燥代表性的4α-螺旋束蛋白如hGH時，三亮氨酸是一種有效的穩定劑。而且，噴霧乾燥採用的低pH條件似乎增強了分散性，特別是與三亮氨酸聯合使用時，產生了生長激素分子的協同穩定作用以製備具有最低程度蛋白質降解、優良ED(平均為大約90％)和小空氣動力學直徑(從大約2-6-3.1微米)的粉末。實施例4含糖適於呼吸的噴霧乾燥hGH製劑本研究的目的是研究糖作為穩定劑連同hGH噴霧乾燥製劑的最佳操作參數一起，以獲得令人滿意煙霧劑特性和良好hGH穩定曲線粉末的採用。
在眾多的糖中，優選非還原糖、當與乾燥固體中蛋白質結合時能夠形成非晶相的糖、具有高Tg的糖(例如，具有玻璃轉化態溫度大於30℃，優選大於40℃，更優選大於50℃，甚至更優選大於60℃，最優選大於70℃)。與這些優先選擇相一致，本研究採用蔗糖(Tg＝74℃)、棉子糖(Tg＝102℃)和海藻糖(Tg＝115℃)(Tg數據源於A.Saleki-Gerdt，Zografi，G.，Pharm Res.，11(8)，1166-1172(1994))。
A.製劑製備製備pH7.8的5mM磷酸鈉緩衝溶液。每個met-hGH凍幹小瓶用5ml HPLC水使其成原狀。總共使用18小瓶。在再製劑之前hGH溶液被透析過濾以除去賦形劑。用帶YM-10,000過濾器的Amicon(微孔)超過濾池進行透析過濾。採用pH7.8的5mM磷酸鈉緩衝溶液和4-5℃和氣壓37psig的條件透析過濾蛋白質溶液11小時。在透析過濾步驟後，用UV光譜在277nm下檢測蛋白質濃度，並且用pH7.8的5mM磷酸鈉緩衝溶液將其濃度調整為12.1mg/ml。
製備濃度分別為22.8、22.7和22.7mg/ml的蔗糖、棉子糖和海藻糖儲備液。這些儲備液用pH7.8的5mM磷酸鈉溶液製備。4個配方在分別貼有S5-01(蔗糖)、S5-02(海藻糖)、S5-03(棉子糖)和S5-04(只有緩衝液)標籤的離心管裡製備。S5-01在瓶子放入40ml 1.21mg/ml hGH，再加入10ml蔗糖儲備液，pH調至7.8。S5-02在瓶子放入40ml 1.21mg/ml hGH，再加入10ml棉子糖儲備液。pH調至7.8。S5-03在瓶子放入34ml 1.21mg/ml hGH，向其中加入8.5ml海藻糖儲備液。pH調至7.8。S5-04在瓶子放入40ml 1.21mg/ml hGH，向其中加入10ml pH7.8的5mM磷酸鈉緩衝溶液。pH調至7.8。製劑總結在下表4提供。
表4.製劑總結
B.噴霧乾燥上面所描述的製劑溶液用如上面實施例所描述的Buchi 190小型噴霧乾燥器噴霧乾燥。噴霧乾燥在60psi霧化壓力和60℃出口溫度條件下進行。收集粉末，其收率在大約60-85％範圍變動。
C.穩定性在相對溼度小於5％條件下將粉末轉移到手套式操作箱，並且轉移到用封口材料(lidstock)加熱密封的單位劑量包裝(每個起泡包裝裝入5.0mg)。每個製劑的起泡包裝被置於40℃溫度的倉庫。起泡包裝和乾燥劑一起密封在鋁袋中。在一個月的時間點將樣品從40℃溫度的倉庫取出。
煙霧劑性能、蛋白質聚集物、蛋白質純度和殘餘水分分析結果以列表形式出現在下面。
表5.初始和1個月時間點的噴射劑量
數據顯示所有被測試製劑的ED大於75％。當與純製劑相比時，用3種糖(30％)製備的hGH粉末不能提供更高的ED。關於已裝袋粉末40℃下1個月的貯藏，ED沒有顯著改變，雖然觀察到海藻糖和純製劑ED有稍微減少。
表6.初始和1個月時間點的MMAD、FPF
4個製劑所得粉末有相似MMAD(3.8-3.9μm)值。除蔗糖製劑(3.4μm)外，觀察到其他製劑MMAD值40℃貯藏一個月後保持在相同範圍。蔗糖製劑MMAD值減少可能由意外的實驗誤差所造成的，因為測量的CIE值為115％(超過100％)。其他製劑的微粒尺寸分布在初始時間點和1個月時間點之間非常一致。
表7.含水量
含水量在1至6％範圍變動。如預料的那樣，含水量水平在40℃，乾燥劑存在下貯藏一個月後沒有增加。
表8.RP-HPLC分析化學降解的特徵
數據顯示，40℃一個月貯藏後所有被測試製劑的hGH和早期洗脫峰(EE)的百分率保持在相似水平。RP-HPLC分析觀察到所有製劑之間hGH和EE量無顯著差異。
表9.SE-HPLC分析可溶性聚集物(SA)的特徵
所有製劑噴霧乾燥後其可溶性聚集物(SA)都稍微增加(至大約2％)。40℃，乾燥劑存在下貯藏一個月後，可溶性聚集物均稍微增加。純製劑的可溶性聚集物增加至4.7％。這也許表明，類似這些的糖具有抗聚集以穩定hGH蛋白的作用。在三個含糖製劑中，蔗糖製劑顯示在初始和1個月時間點其可溶性聚集物百分率值最低。
表10.UV光譜分析不溶性聚集物的特徵
所有被測試製劑不溶性聚集物低於3％。40℃一個月貯藏後觀察到不溶性聚集沒有增加。表9報告的一個月時間點SD和％RSD是從同一樣品三重掃描中獲得的。它反映同一樣品UV測量的變異，而不是樣品與樣品間的差異。
同樣，根據B.M.Eckhardt，J.Q.Oeswin，和T.A.Bewley，Pharm.Res.，8(11)1360-1364(1991)的描述計算總單體(TM)百分率。
表11.總單體百分率計算
與純製劑相比，本研究評價的糖沒有顯示煙霧劑性能(ED和MMAD)的提高。然而，似乎含糖製劑提供更好的穩定性曲線，例如，當hGH用糖製劑時，可溶性聚集水平低於純製劑；而且，蔗糖製劑提供最低量可溶性聚集物。實施例5噴霧乾燥參數優化本研究的目的是將4α-螺旋束蛋白粉末的MMAD進一步減小至小於3微米而不犧牲分散性或增加蛋白質降解。雖然採用了des-PhehGH，在天然全長hGH粉末特性方面認為不出現顯著性差異。
已經指出(Mumenthaler，M.等，Pharm Res.，1112-20(1994)和Maa，Y-F等，J Pharm Sci，87152-159(1998))，噴霧乾燥中hGH聚集是不可避免的，並且大多數聚集出現在霧化階段。申請人已經在40psi霧化壓力下將純天然hGH噴霧乾燥成乾粉(實施例1)。這批粉末的MMAD是3.5微米(VMOD＝2.7微米)，大於3微米。本研究目的是確定能進一步將空氣動力學微粒尺寸減少至小於3微米而不犧牲蛋白質聚集的低程度的最佳操作參數。
獲得減小的MMAD的一個途徑是減小被霧化乾燥的初始微粒尺寸，該尺寸受霧化壓力增大和噴霧乾燥溶液固體濃度減小的影響。兩個參數的調整被研究。實驗設計霧化壓力(40-60psi)和固體濃度(0.5-2.0％w/v)作為設計參數被採用。
1％固體(S6-02)時，霧化器壓力增加至60psi，其目的是製備更小微粒。固體濃度被減小(S6-03)至0.5％固體，目的是減小微粒尺寸。然而，應該注意到，在為了製備更小微粒尺寸而採用的條件(更低固體濃度和增加的霧化壓力)下，hGH聚集水平的增加以前已經被觀察到。換句話說，增加hGH濃度也許很可能產生更低的聚集。因此，決定將固體濃度增加至2％w/v。實驗S6-04的目的是，採用40psi霧化壓力將聚集保持在其最低水平。設計矩陣在下面提供。開始hGH材料高度不純，正如能夠從表13的蛋白質純度值看出。
表12.實驗設計
按照上面實施例所描述的方法進行溶液製備和噴霧乾燥。所得噴霧乾燥粉末的特徵描述以列表形式在下面提供。
表13.噴霧乾燥固體的特徵％同體濃度、霧化壓力0.5％，60psi1.0％，60psi1.0％，40psi2.0％，40psiED 83％ 77％ 72％ 72％MMAD 3.4 3.84.1 4.3FPF48％ 39％ 33％ 29％VMOD 2.0 2.2 2.5 3.0殘餘含水量 1.3％ 1.5％ 0.9％1.3％IA(UV) 0.3％ 0.1％ 0.5％0.6％SA(SEC)5.4％ 4.0％ 4.1％3.1％蛋白質純度 64.2％ 63.8％ 63.8％ 64.2％實施例6胺基酸穩定劑的使用噴霧乾燥過程中，胺基酸作為4α-螺旋束蛋白的潛在穩定劑被研究。根據數據的彙編，申請人已經發現關於含胺基酸粉末製劑的某些趨勢並進行觀察。通常，觀察到，降低的溶解性跟降低的水分吸附和延遲的析晶相關(Leu＞His＞Ala＞Gly)；增大的範德瓦爾斯體積跟增大的Tg相關(Leu＞His＞Ala＞Gly)；增大的表面富集因素跟增大的疏水性相關；減少的表面張力跟減小的MMD和聚集相關。
基於這些信息，某些胺基酸(Leu，Ile，Val，nLeu，Phe，和Trp)作為4α-螺旋束蛋白的潛在噴霧乾燥穩定劑被研究。在hGH-胺基酸製劑中，胺基酸百分率保持在總固體量30％以下。認為胺基酸的低百分率可能延遲/阻止析晶。
含水胺基酸-人生長激素製劑按照上面的描述被製備。製劑總結在下表14提供。
表14.hGH-胺基酸製劑的組成
按照上面實施例詳細描述的方法用80psi霧化壓力製備這些製劑；粉末回收率在55至66％範圍。
粉末特徵描述結果以列表形式在下面提供。
表15.噴射劑量
所有被測試製劑的Ed在75.3％至78.5％範圍內。
表16.MMAD、FPT、CIE和VMD結果
製劑粉末顯示MMAD值為3.0-3.6微米。含Trp和Val製劑具有更大的分別為3.6和3.4微米的MMAD值。含Leu、Ile和nLeu製劑的MMAD沒有顯著差異。純製劑的MMAD是3.3微米，其比先前實施例中純製劑的MMAD數據小得多。可能造成這種差異的一個因素是更高的霧化壓力(80psi)，因為80psi的霧化壓力比60psi的霧化壓力更能促成小微粒尺寸的形成。製劑的VDM趨勢與MMAD數據趨勢相一致。製劑微粒尺寸分布是相似的。似乎Leu、Ile和nLeu作為噴霧乾燥穩定劑具有稍微更好的特性，它們有助於小空氣動力學尺寸和高FPF微粒的形成。
所有粉末殘餘含水量在0.8％至1.5％範圍。
表17.RP-HPLC分析化學降解的特徵
數據顯示，所有被研究製劑的hGH和早期洗脫峰(EE)的百分率保持在相似水平。從RP-HPLC分析觀察到製劑之間hGH和EE的百分率無顯著差異。與非噴霧乾燥溶液相比，似乎所有製劑中任何一種的早期洗脫峰沒有增加。
表18.SE-HPLC分析可溶性聚集物(SA)的比較
表19.SE-HPLC分析可溶性聚集物(SA)的特徵
似乎，含Leu、Ile和Val製劑有更高的可溶性聚集物，而其他製劑具有相似的可溶性聚集物水平(～1％)。
表20.UV光譜分析不溶性聚集物的特徵
所有被測試製劑的不溶性聚集物在0.3至1.5％範圍。觀察到噴霧乾燥後IA沒有增加。所有製劑具有相似的IA水平。表11報告的SD和％RSD是從相同樣品的三重掃描中獲得的。
表21.總單體百分數計算
總的來說，所有製劑的ED大於73％，並且MMAD在大約3.0至3.6μm範圍。含Val和Trp製劑的粉末具有相對較大的MMAD(3.4和3.6μm)，而從化學穩定性觀點來看，各含30％水平Leu和Ile製劑的hGH與含其他胺基酸製劑相比有稍微更高的可溶性聚集物。實施例7.噴霧乾燥hGH製劑按照上面通常所描述的方法製備和噴霧乾燥des-phe hGH的4種製劑1個純hGH製劑，1個Zn2+/Tween20/hGH製劑，和2個含鋅量不同的製劑Zn2+∶hGH(7∶1和20∶1)。通過添加5mM磷酸鈉緩衝液調整蛋白質濃度。批量在500mg至550mg範圍，而粉末產率在80％至100％範圍。製劑相關數據的總結在下表提供。
表22.hGH製劑組成
噴霧乾燥粉末的物理和化學穩定性及煙霧劑性能被測定並且總結如下。
表23.噴霧乾燥hGH粉末的特徵
在環境條件和加速環境條件下1個月貯藏後，純製劑粉末的噴射劑量和MMAD分別保持在70％和3.5μm近似不變，顯示純製劑的堅固性。實施例8.hGH霧化研究進行下面的研究是為了確定當與一定量起穩定作用賦形劑聯合使用時配方和/或操作參數例如噴霧乾燥代表性4-α螺旋蛋白，hGH的最佳霧化壓力的影響。霧化研究在如先前所描述的Buchi 190裡進行，霧化溶液收集在Erlemeyer瓶中。除非另有說明，所有實驗在相同濃度在5mM磷酸緩衝液中的10mg/ml met-rHGH和80psi霧化條件下進行。所研究的賦形劑/溶劑是如下表24所示劑量的α磷酸甘油酯、亮氨酸、乙醇、三亮氨酸、三苯丙氨酸、F-68、rHA、鋅、鎂、鈣和羥乙基澱粉。所有霧化前和霧化後樣品用pH、UV和SE-HPLC分析。樣品的等分也被離心並用UV分析。測量所有霧化前樣品的表面張力。
表24.製劑成分
觀察上表結果，將噴霧乾燥後的值與噴霧乾燥前的值比較，當agphos以更高濃度出現時，agphos製劑顯示聚集稍微減少；含亮氨酸製劑沒有這種現象，但是總的結果良好。含乙醇製劑顯示聚集減少，特別是在更高濃度時候，雖然有沉澱從溶液析出，尤其是在更高濃度時。三亮氨酸製劑顯示在更高濃度時聚集減少，而Phe-3製劑在低濃度和高濃度聚集沒有變化-二者結果都很好。含F-68製劑顯示在更高濃度聚集減少，而對於含鋅製劑，鋅7∶1製劑表現最好(對於所有含鋅製劑，都有沉澱從溶液析出，最壞的是20∶1)。含陽離子製劑，鎂和鈣也表現良好，但是同樣地出現沉澱形成。(注意ppt級時溶液析出的問題)。含HES製劑顯示在更高HES濃度聚集稍微增加。
權利要求
1.噴霧乾燥的可吸入4-α-螺旋束蛋白粉劑，其具有優良的成煙霧性和蛋白質穩定性，其中包括4-α螺旋束蛋白，其中所述粉劑無表面活性劑，其特徵在於，(i)噴射劑量為至少大約65％，和(ii)總蛋白聚集量少於10％。
2.權利要求1的粉劑，其中所述4-α螺旋束蛋白包括生長激素。
3.權利要求2的粉劑，其中所述生長激素是人生長激素。
4.權利要求3的粉劑，基本上由人生長激素和緩衝劑組成。
5.權利要求4的粉劑，基本上由人生長激素和磷酸鹽緩衝劑組成。
6.權利要求4的粉劑，其特徵還在於，MMAD小於大約3.5微米。
7.權利要求1的粉劑，其中還包括起穩定作用的賦形劑，當噴霧乾燥中將該賦形劑與所述4-α螺旋束蛋白聯合使用時，與相應的純製劑相比，其有效地維持或降低粉劑的聚集水平。
8.權利要求7的粉劑，其中所述賦形劑選自糖、胺基酸和包括2-5個胺基酸的寡聚體。
9.權利要求7的粉劑，其中所述粉劑是快速作用的。
10.權利要求7的粉劑，該粉劑為水溶性的。
11.權利要求8的粉劑，其中所述賦形劑是糖。
12.權利要求11的粉劑，其中所述糖是蔗糖和棉子糖。
13.權利要求12的粉劑，其中所述蛋白質是人生長激素。
14.權利要求8的粉劑，其中所述賦形劑是胺基酸。
15.權利要求14的粉劑，其中所述胺基酸選自天冬醯胺、異亮氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、正亮氨酸和纈氨酸。
16.權利要求15的粉劑，其中所述胺基酸選自亮氨酸、異亮氨酸和正亮氨酸。
17.權利要求15的粉劑，其中所述蛋白質是人生長激素。
18.權利要求8的粉劑，其中所述賦形劑是包括2-5胺基酸的寡聚體。
19.權利要求18的粉劑，其中所述賦形劑是三亮氨酸。
20.權利要求19的粉劑，其中所述蛋白質是人生長激素。
21.權利要求20的粉劑，其特徵在於，MMAD小於3.0微米。
22.權利要求7的粉劑，其中包括小於大約30重量％的所述起穩定作用的賦形劑。
23.權利要求7的粉劑，其特徵還在於，40℃貯藏1個月後總聚集量少於大約10％。
24.權利要求7的粉劑，其中包括至少大約50重量％的4-α螺旋束蛋白。
25.噴霧乾燥製備可吸入4-α螺旋束蛋白粉劑的方法，所述粉劑具有優良的成煙霧性和蛋白質穩定性，所述方法包括(a)在無表面活性劑存在下將4-α螺旋束蛋白溶入含水溶劑形成溶液，和(b)在能夠製備具有(i)噴射劑量至少大約65％和(ii)總蛋白聚集量少於10％特徵粉劑的條件下噴霧乾燥所述溶液。
26.權利要求25的方法，其中所述4-α螺旋束蛋白包括生長激素。
27.權利要求26的方法，其中所述生長激素是人生長激素。
28.權利要求25的方法，其中步驟(a)形成的溶液的固體含量範圍為按重量計大約0.02到大約20％。
29.權利要求28的方法，其中步驟(a)形成的溶液的固體含量範圍為按重量計大約0.05到大約5％。
30.權利要求28的方法，其中步驟(a)形成的溶液的固體含量範圍為按重量計大約0.05到大約2％。
31.權利要求25的方法，其中步驟(a)形成的溶液基本上由4-α螺旋束蛋白和緩衝劑組成。
32.權利要求31的方法，其中所述緩衝劑是磷酸鹽。
33.權利要求31的方法，其中所述蛋白質包括生長激素。
34.權利要求25的方法，其中步驟(b)製備的粉劑具有小於大約3.5微米的MMAD。
35.權利要求25的方法，其中還包括向步驟(a)形成的蛋白質溶液添加與相應的純製劑相比能有效地維持或降低粉劑聚集水平的起穩定作用的賦形劑。
36.權利要求35的方法，其中起穩定作用的賦形劑選自糖、胺基酸和包括2-5個胺基酸的寡聚體。
37.權利要求36的方法，其中起穩定作用的賦形劑是糖。
38.權利要求37的方法，其中所述糖是蔗糖和棉子糖。
39.權利要求38的方法，其中所述蛋白質是人生長激素。
40權利要求36的方法，其中所述賦形劑是胺基酸。
41.權利要求40的方法，其中胺基酸選自天冬醯胺、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、正亮氨酸和纈氨酸。
42.權利要求41的方法，其中所述胺基酸選自亮氨酸、異亮氨酸和正亮氨酸。
43.權利要求42的方法，其中所述蛋白質是人生長激素。
44.權利要求36的方法，其中所述賦形劑是包括2-5胺基酸的寡聚體。
45.權利要求44的方法，其中所述賦形劑是三亮氨酸。
46.權利要求45的方法，其中所述蛋白質是人生長激素。
47.權利要求46的方法，其中步驟(b)製備的粉劑是以MMAD小於3.0微米為特徵的。
48.權利要求45的方法，其中步驟(a)還包括，將蛋白質溶液pH調整至小於大約4。
49.權利要求25的方法，其中溶解在所述含水溶劑中的4-α螺旋束蛋白包括在所述溶液中存在的總固體重量的至少大約50％。
50.權利要求25的方法，其中所述條件包括在大約30-100psi範圍的霧化壓力下噴霧乾燥所述溶液。
51.權利要求50的方法，其中所述條件包括在大約30-80psi範圍的霧化壓力下噴霧乾燥所述溶液。
52.噴霧乾燥的可吸入人生長激素粉劑，其具有優良的成煙霧性和蛋白質穩定性，其中包括人生長激素，其中所述粉劑無表面活性劑，並且其特徵在於(i)噴射劑量至少大約65％，和(ii)總蛋白聚集量少於10％。
全文摘要
本發明提供可高度分散的噴霧乾燥粉末組合物，特別是成煙霧狀輸送到肺部的可吸入乾粉製劑。本發明的粉劑在兩個條件(1)防止蛋白聚集和(2)提供適於吸入的微粒(也就是顯示出優良的煙霧劑性能)下通過噴霧乾燥4α－螺旋束蛋白而製備。
文檔編號A61K38/27GK1446077SQ01813796
公開日2003年10月1日 申請日期2001年8月6日 優先權日2000年8月7日
發明者辛西婭·史蒂文森, 傑恩·E·哈施泰特, S·魯斯·萊爾曼, 奇志·江, 戴維·B·貝內特, 戴維·萊西卡, 楊兵, 江德強, 柯爾斯藤·卡伯特 申請人:耐科塔醫藥公司