一種微流控紙晶片及化學發光免疫檢測方法與流程
2023-05-02 21:19:17 2
本發明涉及免疫檢測領域，特別是涉及一種微流控紙晶片及化學發光免疫檢測方法。
背景技術：
微流控紙晶片是近年來備受關注的一種快速檢測、即時診斷分析器件，具有廣闊的應用前景。微流控紙晶片是以紙作為製作材料，用一定的技術手段在紙上形成親水和疏水相間的區域，併集成了進樣、反應、檢測等基本操作單元。由於它具有重量輕、成本低廉、生物相容性好、一次性可攜式分析、操作簡便、所需樣品的體積小、分析速度快、可以進行多種物質同時檢測等優點，己經被越來越多地應用於臨床檢測、環境監控、食品安全分析等領域。
微流控紙晶片的研究工作主要集中於晶片製作方法和晶片檢測技術上。常見的微流控紙晶片製作方法包括光刻法、蠟印法、噴墨列印法、繪圖法、等離子蝕刻法、柔印等。微流控紙晶片上生物大分子通常利用免疫反應進行檢測，靠抗原與抗體特異性結合而建立的高選擇性生物化學方法，而化學發光免疫分析技術最新發展起來的一項免疫測定技術，具有高靈敏性和高特異性的特點。將微流控紙晶片實驗室與化學發光免疫分析方法結合後，具有成本低、操作簡單、特異性強、靈敏度高、線性範圍寬、檢測快速等特點。
現有的微流控紙晶片用於免疫反應檢測時，需要在每個測試點上分別進行多步洗滌分離操作，繁瑣費時。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種微流控紙晶片，通過進樣層和吸水層圍繞各自轉軸旋轉，進而與檢測層對齊形成親水通道，化學發光免疫分析檢測時，在進樣層進樣口上統一滴加緩衝溶液和顯色液，通過不同的旋轉及操作，可以完成紙晶片上免疫分析檢測，減少滴加時的繁複操作，以解決現有微流控紙晶片免疫分析檢測時每個測試點上分別進行多步洗滌分離操作，繁瑣費時的問題。
為實現上述目的，本發明提供了如下方案：
一種微流控紙晶片，所述微流控紙晶片包括：進樣層、檢測層、吸水層、轉軸和轉軸孔；所述進樣層包括進樣口、通道和交換口；所述檢測層包括第一進樣觀察孔和反應池；所述吸水層包括第二進樣觀察孔和吸水區；所述進樣口、所述第一進樣觀察孔和所述第二進樣觀察孔直徑相同；當所述進樣口、所述第一進樣觀察孔和所述第二進樣觀察孔重合時，所述交換口、所述反應池和所述吸水區位置對應重合；所述進樣層包括第一進樣層和第二進樣層；所述轉軸包括第一轉軸和第二轉軸，所述進樣層的轉軸孔位於所述進樣層的一端，所述檢測層的轉軸孔位於所述檢測層的兩端，所述吸水層的轉軸孔位於所述吸水層的一端；所述第一轉軸通過轉軸孔從上至下依次連接所述第一進樣層的一端、所述檢測層的一端和所述第二進樣層的一端；所述第二轉軸通過轉軸孔從上至下依次連接所述檢測層的另一端和所述吸水層的一端，所述吸水層位於所述第二進樣層的下方。
可選的，所述進樣層包括疏水區和親水區，所述疏水區由蠟列印後融化形成，所述親水區由所述進樣口、所述通道和所述交換口組成。
可選的，所述檢測層包括疏水區和親水區，所述疏水區由蠟列印後融化形成，所述親水區由所述第一進樣觀察孔和所述反應池組成。
可選的，所述檢測區的反應池個數大於1。
可選的，所述吸水層包括疏水區和親水區，所述疏水區由蠟列印後融化形成，所述親水區由所述第二進樣觀察孔和吸水區組成。
可選的，所述轉軸採用雞眼鉚釘。
一種化學發光免疫檢測方法，所述方法包括：
將微流控紙晶片的進樣層和吸水層旋轉至檢測層兩側，使所述進樣層和所述檢測層不重疊、所述檢測層和所述吸水層不重疊，所述微流控紙晶片包括：進樣層、檢測層、吸水層、轉軸和轉軸孔；所述進樣層包括進樣口、通道和交換口；所述檢測層包括第一進樣觀察孔和反應池；所述吸水層包括第二進樣觀察孔和吸水區；所述進樣口、所述第一進樣觀察孔和所述第二進樣觀察孔直徑相同；當所述進樣口、所述第一進樣觀察孔和所述第二進樣觀察孔重合時，所述交換口、所述反應池和所述吸水區位置對應重合；所述進樣層包括第一進樣層和第二進樣層；所述轉軸包括第一轉軸和第二轉軸，所述進樣層的轉軸孔位於所述進樣層的一端，所述檢測層的轉軸孔位於所述檢測層的兩端，所述吸水層的轉軸孔位於所述吸水層的一端；所述第一轉軸通過轉軸孔從上至下依次連接所述第一進樣層的一端、所述檢測層的一端和所述第二進樣層的一端；所述第二轉軸通過轉軸孔從上至下依次連接所述檢測層的另一端和所述吸水層的一端，所述吸水層位於所述第二進樣層的下方；
向所述檢測層的反應池滴加抗原；
將所述第一進樣層旋轉至與所述檢測層重合，並將所述吸水層旋轉至與所述檢測層重合，使得所述第一進樣層的進樣口與所述檢測層的第一進樣觀察孔和所述吸水層的第二進樣觀察孔重合；
向所述第一進樣層的進樣口滴加緩衝液進行衝洗；
將微流控紙晶片的進樣層旋轉至所述檢測層一側，使所述進樣層和所述檢測層不重疊；
向所述檢測層的反應池滴加抗體；
將所述第一進樣層旋轉至與所述檢測層重合，並將所述吸水層旋轉至與所述檢測層重合，使得所述第一進樣層的進樣口與所述檢測層的第一進樣觀察孔和所述吸水層的第二進樣觀察孔重合；
向所述第一進樣層的進樣口滴加緩衝液進行衝洗；
將所述第一進樣層旋轉至所述檢測層一側，使得所述第一進樣層的進樣口與所述檢測層的第一進樣觀察孔不重合；並將所述第二進樣層旋轉至與所述檢測層重合，使得所述第二進樣層的進樣口與所述檢測層的第一進樣觀察孔重合；
通過所述第一進樣觀察孔向所述第二進樣層的進樣口滴加顯色液；
在暗室拍攝所述檢測層圖片並分析所述圖片的灰度；
根據所述圖片的灰度計算所述抗原的濃度。
可選的，所述向所述檢測層的反應池滴加抗原具體包括：
向第一反應池分別滴加已知不同濃度的標準抗原，向第二反應池滴加待檢測抗原，所述第一反應池個數大於1，所述第二反應池個數大於等於1。
可選的，所述根據所述圖片的灰度計算所述抗原的濃度具體包括：
首先根據所述已知不同濃度的標準抗原濃度與相應灰度關係得到標準曲線；
然後根據待檢測抗原的灰度利用所述標準曲線計算出待檢測抗原濃度。
以上方法步驟不固定於一種執行順序，可根據實驗需要調換順序。
根據本發明提供的具體實施例，本發明的有益效果為：
通過微流控紙晶片的結構設計，進樣層和吸水層圍繞各自轉軸旋轉，進而與檢測層對齊形成親水通道，化學發光免疫分析檢測時，在進樣層進樣口上統一滴加緩衝溶液和顯色液，通過不同的旋轉及操作，可以完成紙晶片上免疫分析檢測，減少了滴加時的繁複操作。在檢測層上設置多個反應池，可以分別滴加抗原標品和檢測樣品，實現同時檢測以便製作標準曲線，增加了檢測的準確性。本發明應用於生物分子(如腫瘤、心梗、肝炎指標標誌物等)的免疫反應檢測中，能夠更快速準確完成相關指標檢測。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發明微流控紙晶片結構圖；
圖2為本發明化學發光免疫檢測實施例1得到的檢測結果圖；
圖3為本發明化學發光免疫檢測實施例2得到的檢測結果圖。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
圖1為本發明微流控紙晶片結構圖。圖1(Ⅰ)為微流控紙晶片組裝圖，圖1(Ⅱ)為微流控紙晶片分解圖。微流控紙晶片由whatman 1號層析紙噴蠟列印後110℃烘乾0.5min後形成疏水區和親水區，進而組裝而成。如圖1所示，所述微流控紙晶片包括：進樣層101和103，檢測層102，吸水層104、105和106，轉軸107。其中進樣層101與進樣層103完全相同，吸水層104、105、106完全相同。
由於進樣層101與進樣層103完全相同，以進樣層103為例進行說明，進樣層103包括疏水區、親水區和轉軸孔，疏水區由蠟列印後融化形成，其親水區由進樣口1031、通道1032和交換口1033組成，進樣口直徑10-15mm，通道寬度2-4mm，通道長度5-20mm，交換口直徑5mm，可以在進樣口1031上統一滴加緩衝溶液或顯色液，減少滴加時的繁複操作，滴加後液體沿通道1032流動，並通過交換口1033到達檢測層102的檢測區，在進樣層103的一側有一個轉軸孔，在微流控紙晶片中用轉軸107，轉軸107可以採用雞眼鉚釘。
檢測層102包括疏水區、親水區、進樣觀察孔1021和轉軸孔，疏水區由蠟列印後融化形成，其親水區由多個反應池1022組成，反應池1022數量不定，一般大於5個，可以按需要設計，反應池1022直徑5mm，可以在其上滴加抗原和抗體，是化學發光免疫分析反應的區域，進樣觀察孔1021在進樣層上按設計剪裁得到，進樣觀察孔1021直徑10-15mm，與進樣層進樣孔1031直徑一致，轉軸孔在檢測層102兩側各有一個，在微流控紙晶片中轉軸通過一端轉軸孔固定進樣層101、103與檢測層102，通過另一端轉軸孔固定吸水層104、105、106與檢測層102。
由於吸水層104、105、106完全相同，以吸水層106為例進行說明。吸水層106包括疏水區、親水區和進樣觀察孔1061，疏水區由蠟列印後融化形成，疏水區的疏水壩可以阻擋來自不同檢測層反應池的廢液混合，避免幹擾汙染，其親水區為吸水區1063，轉軸孔1062在吸水層一側，洗滌分離時吸水層與檢測層102貼合對齊，吸水區1063吸收通過檢測層反應池1022的廢液，在微流控紙晶片中轉軸固定吸水層104、105、106與檢測層102。
微流控紙晶片組裝時，轉軸通過轉軸孔從上至下依次組裝進樣層101、檢測層102(通過檢測層其中一側轉軸孔)、進樣層103，檢測層102在中間，進樣層101、103可以圍繞轉軸旋轉，另一轉軸通過轉軸孔依次從上至下依次組裝檢測層102(通過檢測層另一側轉軸孔)和吸水層104、105、106，吸水層數量可以根據檢測操作步驟靈活增減，吸水層在進樣層103下方，並可以圍繞轉軸旋轉。當進樣層101、103的進樣口、檢測層102的進樣觀察孔1021和吸水層104、105、106的進樣觀察孔重合時，進樣層101、103的交換口、檢測層102的反應池1022和吸水層104、105、106的吸水區位置對應重合。其中轉軸可以採用雞眼鉚釘。
本發明化學發光免疫檢測方法，實施方式可以為：
當向檢測層滴加抗原或抗體時，將微流控紙晶片的進樣層和吸水層旋轉至檢測層兩側，使進樣層和檢測層不重疊、檢測層和吸水層不重疊，進樣層包括第一進樣層和第二進樣層，第一進樣層位於所述檢測層上方，第二進樣層位於檢測層下方，吸水層位於第二進樣層下方；吸水層的數量根據實驗需要可增減；然後向檢測層的反應池根據使用要求滴加抗原或抗體，檢測層的反應池有多個，一般大於5個，其中一部分用來添加不同濃度的標準抗原，另一部分用來添加待檢測抗原，抗體可以採用辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標記的抗體。
當洗滌分離時，將第一進樣層(緩衝液進樣層)旋轉至與檢測層重合，並將吸水層旋轉至與檢測層重合，使得第一進樣層(緩衝液進樣層)的進樣口與檢測層的進樣觀察孔和吸水層的進樣觀察孔重合；然後向緩衝液進樣層的進樣口滴加緩衝液進行衝洗，衝洗後撕掉用過的所述吸水層。
當發光反應測定時，將緩衝液進樣層旋轉至檢測層一側，使得緩衝液進樣層的進樣口與檢測層的進樣觀察孔不重合；並將第二進樣層(顯色液進樣層)旋轉至與檢測層重合，將另一吸水層旋轉至與檢測層重合，使得顯色液進樣層的進樣口與檢測層的進樣觀察孔和吸水層的進樣觀察孔重合；通過檢測層的進樣觀察孔向顯色液進樣層的進樣口滴加顯色液。
然後在暗室拍攝檢測層圖片並分析圖片的灰度，根據圖片的灰度計算所述抗原的濃度。
本發明免疫檢測實施例1：CRP間接法ELISA實驗
(CRP：C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)；ELISA：酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA))
按圖1(Ⅰ)微流控紙晶片結構圖噴蠟列印whatman 1號層析紙後110℃烘乾0.5min，剪裁後按圖1(Ⅱ)所示組裝微流控紙晶片。
首先將進樣層與吸水層全部旋轉至檢測層兩側，向預先包被捕獲抗體和用封閉緩衝液封閉好的檢測層6個反應池各滴加5μl CRP不同濃度的標準樣品(100ng/ml、50ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、0ng/ml)，其中100ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、0ng/ml為CRP標線濃度，50ng/ml、50ng/ml為檢測樣品濃度，室溫放置10min；
旋轉檢測層上面的進樣層(稱之為緩衝液進樣層)與檢測層對齊，旋轉檢測層下部的吸水層與檢測層對齊，向進樣層進樣口每次滴加200μl緩衝液衝洗兩次，衝洗後撕掉用過的吸水層，旋轉緩衝液進樣層至檢測層一側，；
向檢測層各反應池滴加5μl生物素標記的檢測抗體，室溫放置5min；
旋轉檢測層上面的緩衝液進樣層與檢測層對齊，旋轉另一個吸水層至與檢測層下層對齊，向進樣層進樣口每次滴加200μl緩衝液衝洗兩次，衝洗後撕掉用過的吸水層，旋轉緩衝液進樣層至檢測層一側；
向檢測層各反應池滴加5μl HRP標記的親和素，室溫放置5min；
旋轉檢測層上面的緩衝液進樣層與檢測層對齊，旋轉一個吸水層至於檢測層下層對齊，向進樣層進樣口每次滴加200μl緩衝液衝洗兩次，衝洗後撕掉用過的吸水層和緩衝液進樣層；
最後檢測層下方進樣層(稱之為發光液進樣層)與檢測層對齊，並通過檢測層進樣觀察口向發光液進樣層進樣口滴加500μl顯色液，1min後，在暗室用CCD拍攝圖片並分析灰度，首先根據標準樣品濃度與灰度關係得到標準曲線；然後根據檢測樣品的灰度利用所述標準曲線計算出檢測樣品濃度。
圖2為本發明免疫檢測實施例1得到的檢測結果圖。如圖2所示，A圖為免疫分析化學發光圖片，B為免疫分析標準曲線。多張紙晶片檢測計算結果如表1所示：
表1
本發明免疫檢測實施例2：小鼠IgG間接法ELISA實驗
(IgG：免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG))
按圖1(Ⅰ)微流控紙晶片結構圖噴蠟列印whatman 1號層析紙後110℃烘乾0.5min，剪裁後按圖1(Ⅱ)所示組裝微流控紙晶片。
將進樣層與吸水層旋轉至檢測層兩側，在檢測層反應池分別滴加4μl不同濃度的(20μg/ml、10μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0μg/ml)小鼠IgG，其中20μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0μg/ml為樣品標線濃度，10μg/ml、10μg/ml為檢測樣品濃度，室溫放置10min；
旋轉檢測層上面的緩衝液進樣層與檢測層對齊，旋轉檢測層下部的吸水層與檢測層對齊，向進樣層進樣口每次滴加200μl緩衝液衝洗兩次，衝洗後撕掉用過的吸水層，旋轉緩衝液進樣層至檢測層一側；
向檢測層各反應池滴加10μl封閉緩衝液，室溫放置10min；
旋轉檢測層上面的緩衝液進樣層與檢測層對齊，旋轉另一個吸水層至與檢測層下層對齊，向進樣層進樣口每次滴加200μl緩衝液衝洗兩次，衝洗後撕掉用過的吸水層，旋轉緩衝液進樣層至檢測層一側；
向檢測層各反應池滴加5μl anti-mousuIgG HRP抗體，室溫放置10min；
旋轉檢測層上面的緩衝液進樣層與檢測層對齊，旋轉一個吸水層至於檢測層下層對齊，向進樣層進樣口每次滴加200μl緩衝液衝洗兩次，衝洗後撕掉用過的吸水層和緩衝液進樣層；
旋轉檢測層下部發光液進樣層與檢測層對齊，並通過檢測層進樣觀察口向進樣層進樣口滴加500μl顯色液，1min後，在暗室用CCD拍攝圖片並分析灰度，首先根據標準樣品濃度與灰度關係得到標準曲線；然後根據檢測樣品的灰度利用所述標準曲線計算出檢測樣品濃度。
圖3為本發明免疫檢測實施例2得到的檢測結果圖。如圖3所示，A圖為免疫分析化學發光圖片，B為免疫分析標準曲線。多張紙晶片檢測計算結果如表2所示：
表2
本說明書中各個實施例採用遞進的方式描述，每個實施例重點說明的都是與其他實施例的不同之處，各個實施例之間相同相似部分互相參見即可。對於實施例公開的系統而言，由於其與實施例公開的方法相對應，所以描述的比較簡單，相關之處參見方法部分說明即可。
本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對於本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在具體實施方式及應用範圍上均會有改變之處。綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。