豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素快速檢測試紙條的製作方法

2023-05-03 04:42:06 4

豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素快速檢測試紙條的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種豬細菌病內毒素檢測試劑顯示的器具，特別是涉及一種豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素（ApxIV）快速檢測試紙條，試紙條含支撐層、反應試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，反應試劑載體吸附層粘貼於支撐層上，從樣品測試端依次為纖維層，ApxIV金標單抗或多抗纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層；分別用ApxIV配對單抗或多抗或單抗溶液在纖維層上噴檢測印跡「｜」、「/」或「＼」，分別用羊（兔）抗小鼠或豬IgG的多抗或用SPA溶液在纖維素膜層上噴對照印跡「｜」、「/」或「＼」。該試紙條特異、敏感、直觀、準確、簡便、快速，能在畜禽飼養、肉類加工和檢疫等相關部門推廣應用。
【專利說明】豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素快速檢測試紙條
[0001]一、【技術領域】
本發明是一種涉及豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試劑顯示器具，特別是涉及一種可檢測豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條。
[0002]二、技術背景
豬胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的豬的一種急性、熱性、高度傳染性的呼吸道疾病。豬胸膜肺炎放線桿菌為巴氏桿菌科放線桿菌屬的成員，是一種革蘭氏染色陰性小球桿菌，有的呈纖細杆狀或絲狀，表現為多形態性和兩極著色性。有莢膜，有菌毛，無芽孢。臨床上以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為特徵。本病分布於世界許多國家和地區，是一種世界性疾病，目前呈上升的流行趨勢。我國於1987年證實存在本病，給規模化養豬場造成重大的經濟損失。天氣的變化和秋冬季節的來臨易導致本病的發生與流行，應引起高度重視，採取有力措施，避免寒冷季節本病的發生與流行。
[0003]病豬、隱性感染的帶菌豬是本病的主要傳染源，特別是亞臨床感染的母豬是病原的主要貯存宿主，在本菌的傳播中起重要作用。本病雖然不會通過垂直傳播感染仔豬，但可通過直接接觸經呼吸道傳染，影響到仔豬的安全。通過空氣傳播，可從一個發病豬舍跳躍式傳給另一個豬舍。也可以通過接觸被病原汙染的車輛、工具、器械以及飼養人員流動等間接傳播。嚙齒類動物和鳥類也可傳播本病。各種年齡、性別的豬只都有易感性，其中以6?16周齡的豬發病較多，以3月齡的豬發病率最高，可達80%?100%，死亡率一般為50%。
[0004]豬胸膜肺炎是當前危害世界各國養豬業的主要疾病之一。目前APP共發現有15種血清型，並且各個國家流行的優勢血清型各不相同。不同血清型之間及同一血清型的不同菌株的毒力均存在差異，致病性也有強弱之分，從而導致該病的診斷和治療非常困難。近幾年來的研究表明，與病原菌毒力相關的因子有毒素、莢膜、外膜蛋白、脲酶等，其中毒素既是主要的毒力因子，也是主要的免疫原，可作為診斷抗原建立血清學檢測方法，還可以用於診斷和衡量免疫狀態，因此毒素研究已成為該病的研究熱點。APP共有4種毒素，即毒素
1、I1、 III以及最近發現的毒素IV，它們均屬於RTX(Repeatsinthe structural, RTX)
毒素家族。近年發現，沒有一種血清型的APP能同時分泌4種毒素，但APP所有血清型在感染動物體內都能分泌ApxlV毒素蛋白，而體外培養的細菌卻不能分泌該毒素。因此，在動物體內檢測到ApxlV毒素，就能證明APP的感染，ApxlV毒素蛋白在建立診斷方法方面具較大的理論價值和應用前景，可用於區別診斷APP的感染與非感染。目前對上述疾病的診斷方法主要有以下幾種。
[0005](I)鏡檢。取鼻腔與支氣管的分泌物或肺部病變材料塗片，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，如見到多形態的兩極濃染的革蘭氏陰性的小球桿菌或纖細桿菌，可作進一步鑑定。
[0006](2)病原分離鑑定。無菌取病料，用5%綿羊血液瓊脂平板與金黃色葡萄球菌交叉劃線接種，在5%?10%二氧化碳濃度條件下37°C培養24小時，在金黃色葡萄球菌周圍有衛星菌落，再進行脲酶及甘露糖發酵等生化鑑定。並進行環磷酸腺苷(CAMP)試驗、溶血性測定以及血清型等檢查。[0007](3)血清學診斷。螢光抗體技術可用於特異抗原的檢查；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)與補體結合試驗可用於檢測抗體，查出隱性感染的豬只。間接血凝試驗(IHA)，APP的間接血凝試驗用於APP的檢測與分型。乳膠凝集試驗是一種簡便快速的檢測方法，它既可以用於APP的診斷，也可用於分型。以酶聯免疫吸附試驗技術進行APP的血清學診斷，可以分為型特異性ELISA和種特異性ELISA。前者是只能對一種血清型的APP做出檢測，後者是對所有血清型的APP都可做出檢測。
[0008](4)聚合酶鏈式反應(PCR)技術:PCR技術具有高靈敏度、高特異性等優點，多重PCR方法已被廣泛運用於APP或ApxIV的鑑定和流行病學調查。
[0009]上述檢測方法需要專業人員在實驗室操作，操作繁瑣，檢測費時費力；而且需要昂貴的儀器設備，如PCR儀、酶標儀等，對非專業人員而言，上述檢測方法很難完成。雖然上述方法特異敏感，但無法實現現場快速檢測或診斷。本發明，研究一種簡便快速、實時在線檢測試紙，對控制和消滅此疾病意義重大。
[0010]三、
【發明內容】

本發明的目的是為了克服現有技術中檢測豬病病原存在的缺點，提供一種特異、敏感、簡便快速檢測豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素的方法，研製出檢測豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條。
[0011]本發明的技術方案是:提供一種豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測印跡和對照印跡；金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗ApxIV的單克隆抗體,檢測印跡用抗ApxIV的配對單抗印製,對照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體；或金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗ApxIV的多克隆抗體，檢測印跡用抗ApxIV的單抗製備，對照印跡用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗豬IgG多抗製備。
[0012]檢測印跡用抗ApxIV的配對單抗製備即用ApxIV的配對單抗溶液製備；檢測印跡用抗ApxIV的多克隆抗體製備即為用ApxIV的多克隆抗體製備。
[0013]支撐層用不吸水的硬質塑膠片條或硬紙條製成；測試端樣品吸附纖維層用玻璃棉製成；金標抗體纖維層用玻璃棉和金標抗體製成，金標抗體可以是單抗或多克隆抗體。
[0014]纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜製成。
[0015]吸水材料層用吸水紙製成。
[0016]檢測印跡和對照印跡為直線式、或斜線式，纖維素膜層上含有一條檢測印跡和一條對照印跡，檢測印跡和對照印跡的排列形式為「 I I 」、「/ /」、「\ \」中的任一種。
[0017]試紙條吸附層上面含有一層保護層，保護層附著在吸附層上，在測試端樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印製有樣品標記線，該標記線偏向測試端樣品吸附纖維層一側處約0.5cm處。
[0018]根據需要，選擇上述金標抗體纖維層、檢測印跡和對照印跡排列形式中一種形式。
[0019]本發明的積極有益效果: 1.檢測特異性強、敏感性高:本發明檢測試紙條以納米級金顆粒標記高親和力特異性單克隆抗體或特異性多克隆抗體為基礎而製成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的範德華力相結合，金顆粒不影響單克隆抗體或多克隆抗體的特異性和結合力，並且具有較高的標記率。本發明檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到納克級豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素。
[0020]2.操作簡便、快速:使用本發明試紙條檢測時無需附加任何其它儀器和試劑，只需將其測試端插入待檢的樣品液中30秒左右，然後在1-5分鐘內即可判定檢測結果。
[0021]3.檢測結果直觀、準確:本發明試紙條以是否顯示棕紅色的檢測線和對照線作為判定陽性和陰性結果的依據，即只在纖維素膜的對照線印記處顯示一條棕紅色對照線C，而在檢測線印記處無棕紅色條帶顯示，表示被檢測的ApxIV為陰性結果；在纖維素膜的對照線印記處顯示一條棕紅色對照線C，在檢測印跡處顯示一條棕紅色條帶T，則表示被檢測的ApxIV為陽性結果。無論陽性結果或陰性結果對照線C均應顯示，當對照線C不顯示時，說明試紙條失效。
[0022]4.檢測費用降低:使用本發明檢測試紙條，不需其它儀器及試劑，節省了儀器、設備和附加試劑費用；非專業人員也可隨時實時在線檢測，無需支付專家診斷檢查費及其相關費用，可極大的降低檢測成本的投入，降低檢測費用。
[0023]5.使用範圍廣:本發明檢測試紙條操作簡單，即「傻瓜式」操作，而且攜帶方便、易保存，可滿足不同單位和不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖到個體養殖等，具有廣闊的市場前景和社會效益。
[0024]四、【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1 一種豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條的側視結構示意圖 圖2 —種豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條的俯視結構示意圖 五、【具體實施方式】:
以下實施例僅為了進一步說明本發明，並不限制本發明的內容。豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條的製備，需要製備抗ApxIV的單克隆抗體和多克隆抗體，用於製備檢測印跡和金標抗體纖維層；同時需要製備羊或兔抗鼠IgG抗體，羊或兔抗豬IgG抗體，用於製備對照印跡。
[0025]1.羊(兔)抗鼠或抗豬IgG抗體的製備:
以飽和硫酸銨法提取小鼠或豬血清中的IgG，取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內2h，在4°C、10000r/min離心15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉澱，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內2h，在4°C、10000r/min條件下離心15min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉澱，置4°C冰箱內用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2?3次，在4°C、10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以50 μ g?100 μ g (IgG) /kg體重經皮下或肌肉注射抗體陰性健康羊或家兔3?4次，末次免疫20天後，靜脈採血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上，心臟採血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠或豬的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用於製備本發明試紙條的對照印跡。
[0026]2.ApxIV單克隆抗體(Mi)的製備:每隻用50 μ g~100 μ g ApxIV抗原免疫Balb/c系小鼠三次,每次間隔15~30d ;第三次加強免疫後3~4d，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，用75%酒精浸泡5~lOmin，無菌取其脾臟，剪碎並經100目尼龍網過濾，1000r/min離心10min，收集脾細胞；將IX IO8個脾細胞與2~5 X IO7個NSO骨髓瘤細胞混合，1000r/min離心10min棄上清，將含有沉澱細胞的離心管置於37°C的水中，並緩緩加入0.7~Iml 40%~50% PEG4000 (pH 8.5~9.0)作用lmin，然後緩慢加入無血清1640培養基15ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5~lOmin，1000r/min離心10min棄上清，將細胞沉澱重懸於HAT選擇培養基中，並加入
96孔培養板(100μΙ~200μ1/孔)，置於37°C 5% CO2培養箱中培養。培養7~IOd後，以548~1(^ g/ml的純化的病原體特異抗原包被96孔酶標板，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養上清，挑取強陽性細胞克隆(OD45tl ^ 0.5)，進行連續三次的有限稀釋法克隆化，獲得陽性雜交瘤細胞株，其染色體數為92~98，其分泌的單克隆抗體，能夠特異識別ApxIV，而不與其它毒素發生交叉反應，親和力常數達109~1(1，輕鏈亞型為K或入，重鏈亞型為IgG1UgG2aUgG2bUgG3 ;獲得的配對單克隆抗體，用於制金標單抗體玻璃棉或檢測印跡。
[0027]3.金標單抗玻璃棉的製備:
利用檸檬酸鈉還原法製備納米級金顆粒:即在50~100mL沸騰的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4ml的0.5~2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的納米級金顆粒。以0.lmol/L的K2CO3調金顆粒溶液的pH至8.5~9.5，以1:1000~1300的標記比將待標記的單克隆抗體加入PH8.5~9.5的金溶膠中，標記IOmin後，加20% PEG10000至最終濃度為0.05%, 4°C、1500~3000r/min離心20min,除去未結合的金顆粒顆粒，4°C、15000r/min離心lh，棄上清，獲金標抗體混合物後,用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標抗體,獲得的金標抗體。將1:100~ 500稀釋的金標抗體，吸附於精製玻璃棉中，4°C低溫真空乾燥，製備金標單克隆抗體玻璃棉。
[0028]4.ApxIV多克隆抗體(Ci)的製備:
ApxIV多克隆抗體(Ci)的製備。採用ApxIV抗原多次免疫接種抗體陰性健康豬。末次免疫20天後靜脈採血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上，心臟採血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與小鼠血清IgG的提取相同，不再重述)。
[0029]金標多抗和金標多抗玻璃棉的製備，與金標單抗玻璃棉的製備方法相同，不再重述。詳見【具體實施方式】中的內容3。
[0030]5.本發明檢測試紙條檢測原理
當本發明檢測試紙條測試端插入待檢樣品溶液後，待檢溶液通過虹吸帶動待檢ApxIV進入金標抗體纖維層，並與其中的金標抗體(Mi或Ci ) 一起沿硝酸纖維素膜向手柄端擴散，最終滲入手柄端吸水材料層，擴散過程中金標抗體能夠與相應的待檢ApxIV結合，結合金標抗體的ApxIV能夠被纖維素膜上檢測印跡的配對單抗或多抗攔截，當樣品液中含有被檢ApxIV時，則出現一條棕紅色的檢測線；羊或兔抗鼠或抗豬IgG則可與相應的金標單抗或多抗結合，出現I條棕紅色對照線。當待檢樣品液中不含ApxIV時，試紙條只顯示出一條棕紅色對照線；當纖維素膜上沒有對照線顯示時，則表明試紙條已失效。
[0031]6.本發明檢測試紙條的檢測操作方法 (I)檢測樣品的處理:取病豬病變組織，1:1?5加入生理鹽水並用剪刀剪碎，浸出液為待檢樣品，病豬全血或血清加入生理鹽水1:1?5稀釋後為待檢樣品。
[0032](2)檢測操作:將本發明檢測試紙條樣品端插入待檢樣品液中，插入深度不超過標記線9，約30秒後取出試紙條，水平放置約I?5分鐘，同時觀察結果。
[0033](3)結果判定:如果在檢測試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對照線C，表示檢測結果為陰性，說明在被檢樣品中不含ApxIV;如果檢測試紙條上的纖維素膜出現對照線C，檢測印跡處出現一條檢測線，表示檢測結果為陽性，即在待檢樣品中含有ApxIV ;如果纖維素膜上沒有對照線C顯示，則表明試紙條已失效。
[0034]實施例一:豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條
參見圖1和圖2，圖中I為支撐層，用硬質塑膠薄片條製成，2為測試端的樣品吸附纖維層，用玻璃棉製成，3為金標抗體纖維層，吸附有納米級金顆粒標記的抗ApxIV的單克隆抗體的玻璃棉，根據上述【具體實施方式】3中所述的製備方法製備其金標單抗玻璃棉，4為纖維素膜層，採用硝酸纖維素膜製成，5為吸水材料層，用吸水紙製成，將編號2、3、4、5各層從左端測試端至右粘貼在硬質塑膠薄片條I上，彼此之間交界處互相交叉重疊。在硝酸纖維素膜層4上，6為用抗ApxIV的配對單抗溶液印製的檢測印跡T，7為用羊或兔抗鼠IgG溶液印製的對照印跡C，檢測印跡和對照印跡為直線式、或斜線式，兩種印跡帶排列形成的組合形式為「 I I 」、「/ /」、「\ \」中的任一種。8 -1為覆蓋在測試端樣品吸附纖維層2和金標抗體纖維層3上面的白色保護膜，在2和3交界處對應保護膜8-1位置上偏向於樣品吸附纖維層2 —側0.5cm處印有標記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5(手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護膜8-2。
[0035]待測樣品溶液的製備及檢測操作步驟，與【具體實施方式】6中的檢測操作方法相同，不再重述。
[0036]實施例二:豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條，與實施例一基本相同，不同之處在於:
金標抗體纖維層3用吸附有金顆粒標記的抗ApxIV的多克隆抗體的玻璃棉製成，根據上述【具體實施方式】3中所述的製備方法製備其金標多克隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為用抗ApxIV的單抗溶液印製的檢測印跡T，7為用羊或兔抗豬的IgG溶液印製對照印跡C，兩種印跡帶排列形成的組合形式為「 I I 」、「/ /」、「\ \」中的任一種。其它包括檢測樣品製備、操作方法和結果判定等均與【具體實施方式】6中的操作方法相同，不再重述。
【權利要求】
1.一種檢測豬胸膜肺炎放線桿菌內毒素(ApxIV)的檢測試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上製備有檢測印跡和對照印跡，其特徵是金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗ApxIV的單克隆抗體，檢測印跡用抗Apx IX的配對單抗或多克隆抗體印製，對照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)印製。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特徵是金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗Apx B'單克隆抗體，檢測印跡用抗Apx W的配對單抗或多克隆抗體印製，對照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)印製，或金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗Apx IV的多克隆抗體，檢測印跡用抗Apx IV的單抗製備，對照印跡用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗豬IgG多抗製備。
3.根據權利要求1或2所述的試紙條，其特徵是檢測印跡用抗ApxW的配對單抗製備即用抗Apx IX的配對單抗溶液製備；檢測印跡用抗Apx IY的多克隆抗體製備即為用抗Apx IX的多克隆抗體製備。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特徵是支撐層用不吸水的硬質塑膠片條或硬紙條製成；測試端樣品吸附纖維層用玻璃棉製成；金標抗體纖維層用玻璃棉和金標抗體製成，金標抗體可以是單抗或多克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特徵是纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜製成。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特徵是吸水材料層用吸水紙製成。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特徵是檢測印跡和對照印跡為直線式、或斜線式，纖維素膜層上含有三條檢測印跡和一條對照印跡，檢測印跡和對照印跡的排列形式為「I I中的任一種。
8.根據權利要求1所述的試紙條，其特徵是試紙條吸附層上面含有一層保護層，保護層附著在吸附層上，在測試端樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印製有樣品標記線，該標記線偏向測試端樣品吸附纖維層一側約0.5cm處。
【文檔編號】G01N33/68GK103941013SQ201310083779
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2013年3月15日
【發明者】李學伍, 鄧瑞廣, 楊繼飛, 趙東, 王麗, 柴書軍, 王方雨, 張改平 申請人:河南省農業科學院