一種縊蟶抗高血肽的製備方法與流程
2023-05-03 04:34:26 3
本發明涉及多肽的製備技術領域，具體是一種縊蟶抗高血肽的製備方法。
背景技術：
海洋貝類資源豐富且富含許多生理活性物質，因而逐漸被廣泛研究和應用。縊蟶（Sinonovaculaconstricta）俗名蟶子，屬瓣鰓綱、異齒亞綱、簾蛤目、燈塔蛤科、縊蟶屬，在我國沿海均有分布，產量較大，為我國四大養殖貝類之一，縊蟶肉味鮮美，營養豐富，富含人體生命活動所需的各種必需胺基酸、不飽和脂肪酸等營養物質。縊蟶性寒、可補陰去邪熱，治煩悶、冷痢、熱痢、婦人產後虛損、虛熱等症，具有較高的藥用食用價值，對縊蟶肉的酶解條件進行研究，發現提取得到的糖胺聚糖對體外培養的HL-60細胞均有一定抑制作用，且隨著用量增加抑制作用增強。張永娟等，提取縊蟶多肽能促進小鼠胸腺和脾臟發育及遲髮型變態反應的發生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD還能提高血清SOD、GSH-Px水平，降低血清MDA 含量。
活性多肽由於具有敏感性高、穩定性好及副作用少等優點，已被用作抗腫瘤藥物開發的一個重要來源。研究已經證實，食物蛋白通過蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽。對於縊蟶，在抗高血壓方面的研究還很少，特別是利用酶解技術提取多肽在抗腫瘤方面的研究並未見報導。
現在已有很多研究採用酶解技術成功提取了動物多肽，說明從縊蟶中提取抗高血肽可行性很高。現有技術如授權公告號為CN104004808B的中國專利，公開了一種具有抗凝血與溶血栓全蠍多肽及其酶解製備方法與應用，製備方法包括：全蠍幹體清洗乾燥，粉粹成粉末；加入水均勻攪拌，pH 調至7~10，以100~300r/min 的速度勻速攪拌1h~3h，離心，上清液pH 調至3~7，得蛋白沉澱；將蛋白加水溶解，比例為5~20g ：100mL，pH 調至7.5~10，再加入鹼性蛋白酶，該酶體積與蛋白重量之比0.1~5mL ：100g，溫度40~80℃，攪拌速度100~300r/min，時間1~5h ；將酶解液通過陰離子交換柱分離純化，收集乾燥，得抗凝血肽粉。該方法為抗凝血類活性物質增加了新來源，實現原料的充分利用，具有產品活性高、製備過程方便可行、環保等優點，所製得的抗凝血肽粉可作為預防血栓、溶血栓、降血稠類食品的原料。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種操作簡單，提取率高，提取的抗高血肽純度高，活性強的縊蟶抗高血肽的製備方法。
本發明針對背景技術提到的問題，採取的技術方案為：
1）酶解：將縊蟶用冰水衝洗2~4次，將泥沙和附著縊蟶表面的汙漬和微生物清洗乾淨，瀝乾。在鼓風機中乾燥，溫度為50~70℃，乾燥時間1~2h，用粉碎機粉碎，過100~400目篩，按料液體積比為1:20~1:30加入Tris—HCl緩衝液，濃度為1.2~1.8 mol/L，水浴加熱攪拌，用鹽酸調節pH。加入複合酶製劑木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亞硫酸鈉0.05~0.08份，氯化鈣0.2~0.5份，ε-多聚賴氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份和助溶劑水楊酸鈉4~12份，硫代甜菜鹼0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。使用上述複合酶製劑酶解縊蟶不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應時間。加入助溶劑能抗高血肽在Tris—HCl緩衝液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解溫度為50~60℃，pH為6.5~7.2，酶解時間為3~5h，離心取上清液，加入析出劑硫酸銨2~5份，氯化鈉1~4份和共軛亞油酸0.4~0.8份，靜置過濾得粗抗高血肽。上述析出劑能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質蛋白質和多肽的析出少；
2）超濾：在步驟1得到的抗高血肽中按體積比1:10~1:15加入Tris—HCl緩衝液，濃度為1.2~1.8 mol/L，選用2500~3500Da的超濾膜進行超濾，壓力為500~1000Pa；
3）製備縊蟶抗高血肽：將步驟2得到的超濾液過HPLC柱，固定相為ZrO2/SiO2，流動相為含0.0002~0.0004%雙乙酸鈉1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl緩衝液，收集含抗高血肽的洗脫液，旋轉蒸發掉流動相留下縊蟶抗高血肽固體，冷凍乾燥，研磨，得到縊蟶抗高血肽粉末。上述方法製備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強，抗高血壓作用很好；使用酶解技術製備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用於抗高血壓藥物的生產。
與現有技術相比，本發明的優點在於：採用複合酶製劑木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，半胱氨酸，亞硫酸鈉，氯化鈣，ε-多聚賴氨酸和硫胺酶解縊蟶，不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應時間；加入助溶劑水楊酸鈉，硫代甜菜鹼和二烯丙基二硫能抗高血肽在Tris—HCl緩衝液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率；析出劑硫酸銨，氯化鈉和共軛亞油酸能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質蛋白質和多肽的析出少；製備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強，抗高血壓作用很好；使用酶解技術製備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用於抗高血壓藥物的生產。
具體實施例
下面通過實施例對本發明作進一步說明：
實施例1：
一種縊蟶抗高血肽的製備方法，具體操作步驟為：
1）酶解：將縊蟶用冰水衝洗2~4次，將泥沙和附著縊蟶表面的汙漬和微生物清洗乾淨，瀝乾。在鼓風機中乾燥，溫度為50~70℃，乾燥時間1~2h，用粉碎機粉碎，過100~400目篩，按料液體積比為1:20~1:30加入Tris—HCl緩衝液，濃度為1.2~1.8 mol/L，水浴加熱攪拌，用鹽酸調節pH。加入複合酶製劑木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亞硫酸鈉0.05~0.08份，氯化鈣0.2~0.5份，ε-多聚賴氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份和助溶劑水楊酸鈉4~12份，硫代甜菜鹼0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。使用上述複合酶製劑酶解縊蟶不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應時間。加入助溶劑能抗高血肽在Tris—HCl緩衝液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解溫度為50~60℃，pH為6.5~7.2，酶解時間為3~5h，離心取上清液，加入析出劑硫酸銨2~5份，氯化鈉1~4份和共軛亞油酸0.4~0.8份，靜置過濾得粗抗高血肽。上述析出劑能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質蛋白質和多肽的析出少；
2）超濾：在步驟1得到的抗高血肽中按體積比1:10~1:15加入Tris—HCl緩衝液，濃度為1.2~1.8 mol/L，選用2500~3500Da的超濾膜進行超濾，壓力為500~1000Pa；
3）製備縊蟶抗高血肽：將步驟2得到的超濾液過HPLC柱，固定相為ZrO2/SiO2，流動相為含0.0002~0.0004%雙乙酸鈉1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl緩衝液，收集含抗高血肽的洗脫液，旋轉蒸發掉流動相留下縊蟶抗高血肽固體，冷凍乾燥，研磨，得到縊蟶抗高血肽粉末。上述方法製備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強，抗高血壓作用很好；使用酶解技術製備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用於抗高血壓藥物的生產。
實施例2：
一種縊蟶抗高血肽的製備方法，最優選操作步驟為：
1）酶解：將縊蟶用冰水衝洗3次，將泥沙和附著縊蟶表面的汙漬和微生物清洗乾淨，瀝乾。在鼓風機中乾燥，溫度為65℃，乾燥時間1.5h，用粉碎機粉碎，過200目篩，按料液體積比為1:25加入Tris—HCl緩衝液，濃度為1.5 mol/L，水浴加熱攪拌，用鹽酸調節pH。加入複合酶製劑木瓜蛋白酶8份，中性蛋白酶6份，半胱氨酸0.6份，亞硫酸鈉0.07份，氯化鈣0.3份，ε-多聚賴氨酸0.02份和硫胺0.01份和助溶劑水楊酸鈉9份，硫代甜菜鹼1.0份和二烯丙基二硫0.3份。使用上述複合酶製劑酶解縊蟶不僅能得到抗高血肽，不會破壞抗高血肽的活性，而且酶解速度快，縮短反應時間。加入助溶劑能抗高血肽在Tris—HCl緩衝液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解溫度為55℃，pH為7.0，酶解時間為4h，離心取上清液，加入析出劑硫酸銨3份，氯化鈉2份和共軛亞油酸0.6份，靜置過濾得粗抗高血肽。上述析出劑能使抗高血肽分子周圍的水化膜減弱或消失，析出率高，而且雜質蛋白質和多肽的析出少；
2）超濾：在步驟1得到的抗高血肽中按體積比1:12加入Tris—HCl緩衝液，濃度為1.5 mol/L，選用3000Da的超濾膜進行超濾，壓力為800Pa；
3）製備縊蟶抗高血肽：將步驟2得到的超濾液過HPLC柱，固定相為ZrO2/SiO2，流動相為含0.0003%雙乙酸鈉1.5mol/L 的Tris—HCl緩衝液，收集含抗高血肽的洗脫液，旋轉蒸發掉流動相留下縊蟶抗高血肽固體，冷凍乾燥，研磨，得到縊蟶抗高血肽粉末。上述方法製備的縊蟶抗高血肽純度高，活性強，抗高血壓作用很好；使用酶解技術製備縊蟶抗高血肽綠色安全，可放心用於抗高血壓藥物的生產。
以上實施方式僅用於說明本發明，而並非對本發明的限制，本領域的普通技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，還可以做出各種變化和變型。因此，所有等同的技術方案也屬於本發明的範疇，本發明的專利保護範圍應由權利要求限定。