治療癌基因HER－2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體的製作方法

2023-05-02 12:39:41 2

專利名稱：治療癌基因HER－2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程中一種特異性治療癌基因HER-2/neu過表達腫瘤的新型重組毒素腺病毒突變體。
腫瘤是嚴重危害人類健康與人們生命的常見多發病，我國每年癌症新發病人數超過160萬(癌症患者總人數超過1000萬)。癌症正超過心腦血管病而成為人類致死的第一位原因。
在常見的人類腫瘤中，有30-83％的乳腺癌、49-70％的卵巢癌、56-84％的肺癌、4-35％的胃癌和38-47％的喉癌等多種腫瘤都有癌基因HER-2/neu的過度表達。在大多數情況下，具有癌基因HER-2/neu過表達的腫瘤患者，常常對放療和化療不敏感，基本上喪失了進一步治療的可能，因而發展針對癌基因HER-2/neu過表達的腫瘤患者的治療方法就顯得特別重要。
腺病毒基因組中的Ela基因能誘導癌基因HER-2/neu過表達的腫瘤細胞的凋亡，抑制HER-2/neu過表達腫瘤細胞的生長。但是人體是一個十分複雜的有機體，而癌症又是一種尤其錯綜複雜的疾病。任何一種單純的藥物不管其功能如何強大，其作用依然有限。癌症的治療正在進入一個綜合治療的時代，腫瘤的單基因治療方案正被多基因治療方案所取代。用單純的腺病毒的Ela基因治療癌基因HER-2/neu過表達腫瘤固然有一定療效，但其療效依然很有限。
「以毒攻毒」自古以來就是治療包括癌症在內的各種頑症的首先原則。在現代癌症治療方案中，毒素(包括綠膿桿菌外毒素[Pesudomonasexotoxin，PE]、白喉毒素基因[diphtheria toxin，DT]、葡萄球菌內毒素A[Staphylococcal enterotoxin A，SEA]和蓖麻毒素[Ricin]等)亦是常用的有效藥物。然而由於毒素本身缺乏靶向性，其毒副作用較大，因此其應用受到了相當程度的限制。
本發明的目的為了克服毒素治療癌症缺乏靶向性，毒副作用大的缺點，改善單基因治療方案中療效不佳的現狀，本發明設計並構建成了一種特異性治療癌基因HER-2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體，命名為CBC-016。
主要技術內容國內外的研究表明，腺病毒基因組中的Ela基因產物能誘導HER-2/neu過表達的腫瘤細胞的凋亡，有效抑制HER-2/neu過表達的腫瘤細胞的生長。本發明利用我們已構建成的重組毒素腺病毒突變體，記載於題目為「治療腫瘤抑制基因p53缺陷腫瘤的重組毒素腺病毒突變體」的專利申請中，該重組毒素腺病素突變體命名為CBC-015。把CBC-015的Ela基因進行改造，讓其獲得高表達，從而得到一種特異針對於HER-2/neu過表達腫瘤的新型腺病毒突變體，命名為CBC-016。該重組腺病毒突變體可進一步開發成一種全新的抗腫瘤新藥。
特異性治療癌基因HER-2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體的主要特點是質粒pXCl(A)，用聚合酶鏈式反應法(即PCR法)(1)得到腺病毒基因組中的Ela基因片段(a)；該片段經核酸限制性內切酶Nhe I/Spe I雙酶切(2)，得到Ela基因(b)；同時質粒pRL-CMV(B)經核酸限制性內切酶Nhe I/Xba I雙酶切(3)，得到載體pRL-CMV(c)；將(b)與(c)連接(4)，連接後得到Ela基因表達質粒pRL-Ela(d)；將(d)經核酸限制性內切酶BamH I/Bgl II雙酶切(5)得到Ela基因表達單元(e)；同時質粒pΔElsplA(C)經核酸限制性內切酶BamH I/Bgl II雙酶切(6)，得到載體pΔElsplA(f)；將(e)與(f)連接(7)，得到腺病毒前體質粒pElasplA(g)；將(g)與腺病毒中間質粒pBHG-PE(D)共轉染293細胞(8)，從空斑中篩選含重組毒素基因的腺病毒突變體(9)，用PCR法鑑定重組毒素腺病毒突變體(Z)。
上述質粒pXCl(A)包含有5型腺病毒(Ad5)基因組的早期轉錄區(El)；質粒pRL-CMV(B)包含報告基因——螢光素酶基因，真核基因表達調控序列CMV基因立即早期啟動子和增強子、化學合成的內含子及猿猴病毒40(即SV40)加poly(A)信號。
根據上述特點構建成的治療癌基因HER-2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體，命名為CBC-016。
CBC-016的結構示意見附圖6，該圖為附圖2的注釋。有關英文縮寫說明如下注1)Δd5adenovirus type 5，5型腺病毒。
2)1mu≈360 bp；bp(base paris)鹼基對。
3)ITRinverted terminal repeat，末端重複序列；Elaearlyregion la，早期轉錄區1a；Elbearly region 1b，早期轉錄區1b；E3early region 3早期轉錄區3。
4)SV40simian virus 40，猿猴病毒40；poly(A)polyadenylicacid，多聚腺苷酸。
5)ATG轉錄起始密碼子。
6)CMVcauliflowet mosaic virus，花椰菜花葉病毒。
7)腺病毒中間質粒pBHG-PE(D)的構建過程見圖8。
CBC-016的構建過程見附圖7；該圖為附

圖1的注釋。(以PE基因為例)CBC-016構建解釋1)用PCR法從包含有Ad5基因組中的E1區的質粒pXCl擴增出腺病毒基因組中的Ela基因片段，該片段用Nhe I和Spe I進行雙酶切後，與經過Nhe I和Xba I雙酶切的質粒載體pRL-CMV(該質粒載體含有報告基因——螢光素酶(luciferase，Iuc)基因，真核基因表達調控序列CMV基因立即早期啟動子和增強子、化學合成的內含子及SV40加poly(Δ)信號)用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化為大腸桿菌後，篩選出重組質粒，命名為Ela基因表達質粒pRL-Ela。
2)Ela基因表達質粒pRL-Ela經BamH I和Bgl II雙酶切後，回收2.4kb Ela基因表達單元，與質粒pΔElsplA經BamH I和Bgl II雙酶切後所得到的載體pΔElsplA用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化為大腸桿菌後，篩選出重組質粒，命名為腺病毒前體質粒pElasplA。
3)用腺病毒前體質粒pElasplA和腺病毒中間質粒pBHG-PE(見注7)共轉染293細胞，從形成的空斑中篩選出含有重組毒素基因的腺病毒突變體，用PCR法鑑定重組毒素腺病毒突變體。該重組毒素腺病毒突變體即是能特異性地誘導癌基因HER-2/neu的過表達腫瘤細胞凋亡的重組毒素腺病毒突變體。
腺病毒中間質粒pBHG-PE的構建過程見附圖8，該圖為附圖7中間質粒的注釋。
本發明的積極結果1.克服了現代癌症治療方案中毒素本身缺乏靶向性，毒副作用大的缺點，有效提高了毒素作用的特異靶向性。2.取代單基因治療方案，本治療方案有機組合了毒素基因和特異性殺傷癌基因HER-2/neu過表達腫瘤細胞的腺病毒Ela基因，將二者構建成了包含重組毒素的特異性針對於HER-2/neu過表達腫瘤的腺病毒突變體。3.本癌基因HER-2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體可進一步開發為一種效率強大的抗腫瘤新藥。
附圖及圖面說明圖1CBC-016的構建過程2CBC-016的結構示意3、圖4、圖5質粒的限制性酶譜圖6附圖2的注釋圖7附圖1的注釋圖8附圖7中間質粒的注釋圖中序號說明(A)質粒pXCl；(B)質粒pRL-CMV；(C)質粒pΔElsplA；(D)腺病毒中間質粒pBHG-PE。
(a)腺病毒基因組中的Ela基因片段；(b)Ela基因；(c)載體pRL-CMV；(d)Ela基因表達質粒pRL-Ela；(e)Ela基因表達單元；(f)載體pΔElsplA(g)腺病毒前體質粒pElasplA；(Z)PCR鑑定重組毒素腺病毒突變體。
(1)多聚酶鏈式反應法(即PCR法)；(2)Nhe I/Spe I雙酶切；(3)核酸限制性內切酶Nhe I/Xba I雙酶切；(4)連接；(5)核酸限制性內切酶BamH I/Bgl II雙酶切；(7)連接；(8)共轉染293細胞；(9)從空斑中篩選含重組毒素基因的腺病毒突變體；(10)圖距單位(Map u-nits即mu)；(11)5型腺病毒(即Ad5)；(12)腺病毒基因組中的缺失(1.0-9.8mu)；(13)腺病毒基因組中的缺失(77.5-86.2mu)；(14)ITR末端重複序列；(15)Ela早期轉錄區la；(16)早期轉錄區lb；(17)E3早期轉錄區3；(18)CMV立即早期啟動子與增強子；(19)Ela基因；(20)SV40加poly(A)信號；(21)ATG，轉錄起始密碼子；(22)轉錄方向；(23)SV40基因啟動子；(24)毒素基因；(25)SV40增強子。
實施例見圖2和說明書中CBC-016構建過程。取質粒(A)、(B)、(C)、(D)各5μg，經圖1中(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)中各中間過程分別處理，實現中間產物(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)，用腺病毒前體質粒pElaplA(g)與腺病毒中間質粒pBHG-PE(D)共轉染293細胞(8)，從空斑中篩選含重組毒素基因的腺病突變體(9)，用聚合酶鏈式反應法(即PCR法)鑑定重組毒素腺病毒突變體(Z)。
權利要求
1.一種治療癌基因HER-2/neu過表達腫瘤的腺病毒突變體，其特徵是質粒pXCl(A)用聚合酶鏈式反應法(即PCR法)(1)得到腺病毒基因組中的Ela基因片段(a)；該片段經核酸限制性內切酶Nhe I/SpeI雙酶切(2)得到Ela基因(b)；同時質粒pRL-CMV(B)經核酸限制性內切酶Nhe I/Xba I雙酶切(3)，得到載體pRL-CMV(c)；將(b)與(c)連接(4)，連接後得到Ela基因表達質粒pRL-Ela(d)；將(d)經核酸限制性內切酶BamH I/Bgl II雙酶切(5)，得到Ela基因表達單元(e)；同時質粒pΔElsplA(C)經核酸限制性內切酶BamH I/BglII雙酶切(6)得到載體pΔElsplA(f)；將(e)與(f)連接(7)，得到腺病毒前體質粒pElasplA(g)；將(g)與腺病毒中間質粒pBHG-PE(D)共轉染293細胞(8)，從空斑中篩選含重組毒素基因的腺病毒突變體(9)，用PCR法鑑定重組毒素腺病毒突變體(Z)。
2.按權利要求1所說的腺病毒突變體其特徵是質粒pXCl(A)包含有5型腺病毒(Ad5)基因組的早期轉錄區(El)。
3.按權利要求1、2所說的腺病毒突變體，其特徵是質粒pRL-CMV(B)包含報告基因——螢光素酶基因，真核基因表達調控序列CMV基因立即早期啟動子和增強子，內含子及猿猴病毒40(即SV40)加poly(A)信號。
全文摘要
本發明提供一種具有特異性治療癌基因HER－2/neu過表達腫瘤的重組毒素腺病毒突變體。主要特點是用質粒pXCl,質粒pRL－CMV,質粒pΔElsplA,經一系列中間過程,得到腺病毒前體質粒pElasplA與腺病毒中間質粒pBHG－PE共轉染293細胞,從形成的空斑中篩選出含重組毒素基因的腺病毒突變體,用PCR法鑑定該重組毒素腺病毒突變體。該重組毒素腺病毒突變體可進一步開發為效率強大的抗腫瘤新藥,用於治療癌基因HER－2/neu過表達腫瘤的基因治療。
文檔編號C12N7/00GK1258737SQ9812402
公開日2000年7月5日 申請日期1998年12月25日 優先權日1998年12月25日
發明者魏於全, 田聆 申請人:華西醫科大學