益生菌、分泌型免疫球蛋白a和感染的製作方法

2023-11-06 06:39:07

專利名稱：益生菌、分泌型免疫球蛋白a和感染的製作方法
益生菌、分泌型免疫球蛋白A和感染本發明大體上涉及營養、健康(health)和身心健康(wellness)領域。具體來說， 本發明涉及益生菌和增加其有效性的途徑。本發明的一個實施方案涉及益生菌和分泌型免 疫球蛋白A(IgA)的組合以及此組合的可能用途。感染是外來物種在宿主生物中進行的有害建群。通常，感染生物試圖用宿主的資 源促進其自身增殖。由此感染生物(或稱病原體)可以幹擾宿主的正常功能，並導致更多 感染相關的疾病，所述疾病可能具有不同的嚴重性，最嚴重的情況可以導致死亡。如果感染生物和宿主之間存在協同作用，其中此關係對於感染生物是有利的，對 後者則是有害的，則表徵為寄生現象。與感染相關聯的疾病種類繁多，與治療和預防感染相關的花費也很可觀。僅美國的抗菌劑市場就擁有約260億美元。如今可通過合適的藥物治療不需要的感染。然而，選擇適當的藥物需要定義待處 理的感染類型。細菌感染通常使用抗菌抗生素治療。誤服錯誤的抗菌抗生素治療特定的非 病毒感染不但不能治療感染，甚至可能是有害的。此外，此類藥物通常可能導致不需要的副 作用，並且經常需要醫務人員的監督。此外，廣泛使用抗生素可能致使產生具有抗生素抗性的傳染物種。福布斯雜誌在 2006年6月聲稱被藥物抗性的感染殺死的美國人比AIDS和乳腺癌加起來還要多。因此，研發能夠降低社會對抗生素的需求的組合物是當今的研究重點。因此，在本領域需要這樣的非抗生素組合物，即可以不具副作用，優選每日施用， 並可安全地用於治療或預防感染，而無需事先定義致病因子的準確性質。達到此目的的一種途徑是施用包含益生菌的食物組合物。已經知道益生菌微生物對宿主的健康和身心健康具有有益作用。在近幾十年中， 作為治療例如胃腸疾病(Isolauri E，等人，Dig Dis Scil994，39 :2595_2600)的安全和易 得形式，益生細菌的用途已經得到相當的關注。在此方面應用的典型益生細菌屬於乳桿菌 屬(Lactobacillus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。益生菌的有效性部分取決於其抵抗消化道條件和粘附於腸上皮的能力。並且，決 定其對宿主潛在益處的關鍵方面是益生菌和宿主環境的對話(cross-talk)和其對上皮屏 障及其功能的影響。儘管在胃腸道建群方面，一些益生菌已經取得了非常不錯的結果，仍然期望獲得 一種工具以進一步改進益生菌微生物在腸中定居的有效性。因此本發明的目的是為本領域提供一種組合物，所述組合物具有與對需要的受試 者施用益生菌相同的益處，但是在治療或預防感染方面比單獨使用益生菌更有效。本發明者已論述了此需要，並發現他們可以通過根據權利要求1的用途和根據權 利要求13的食物組合物達到此目的。因此本發明涉及包含抗體，特別是分泌型IgA和至少一種益生菌的組合物，並涉 及其治療、調節、減弱和/或預防感染的用途。抗體通常為糖蛋白，其特異性識別抗原。已描述的5類脊椎動物免疫球蛋白類別(包括IgG、IgM, IgA、IgD和IgE)中，其在免疫系統中的功能均有不同。分泌型IgA(SIgA) 是腸黏膜分泌物中佔主要且較穩定的免疫球蛋白，對本發明的目的特別有效。不希望受理論限制，發明者相信SIgA和益生菌可形成複合物以增強益生菌和宿 主的相互作用及改進其健康益處。所述組合和宿主腸黏膜的可能的相互作用機制展示於

圖1。益生菌和宿主的首次相互作用發生在腸黏膜的水平。選擇益生菌微生物的關鍵標 準之一是其粘附於腸黏膜的能力。此粘附似乎是阻斷病原體進入所需要的，並且在例如調節保護性免疫功能中起作用。在大多數哺乳動物中黏膜免疫系統最獨特的特徵之一是分泌型抗體的優勢存在， 特別是分泌型IgA(SIgA)，其是黏膜中獨有的抗體種類。多聚IgA的生物合成在黏膜固有層中進行，通過隱窩和柱狀上皮細胞表達的多聚 Ig受體(PlgR)保證其穿過排列在黏膜表面的上皮的運輸。在分泌過程中，plgR的大部分(稱作分泌成分(SC))保持與多聚IgA的結合，同 時釋放SIgA。SIgA至腔的釋放取決於SC的產生，SC的表達在出生後上調。plgR似乎在抗體的 穩定性和黏膜錨定中起關鍵作用(Phalipon等人(2002) Secretory component :A new role in secretory IgA-mediatedimmune exclusion in vivo. Immunity 17:107-115)。幾乎檢測不到SIgA抗體的新生兒依賴經胎盤轉移的母體IgG和在母乳中充足的 外源供應的SIgA。這共同提供了在胃腸免疫系統成形和成熟期對保護宿主至關重要的腸中的被動 免疫。因此本發明的組合物對新生兒和嬰兒(最大至2歲)特別有益，因為他們不產生 足夠量的SIgA而依賴於外部供應。發明者現在相信正是SIgA和益生菌的關聯增強了益生菌和宿主的相互作用，從 而改善宿主的健康益處。本發明者發現SIgA抗體能夠與共生細菌菌株結合。本發明者在體外使用了 Caco-I上皮細胞單層以研究SIgA是如何利於非病原細 菌和上皮表面的對話。作為原則證明，評估了 2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益 生菌代表菌株，即鼠李糖乳桿菌(Lactobaci 1 lusrhamnosus) NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)NCC2818(BL818)。發現SIgA和/或SC當與益生菌結合時，促進益生菌和宿主的相互作用並調節涉 及防禦機制的下遊過程。這在增強益生菌的健康益處中起作用。通過與益生菌組合，SIgA和/或SC能夠 最佳的幫助觸發有效的保護性宿主防禦反應，包括對抗各種病原體的反應。考慮到其體內 穩態作用，與益生菌組合的SIgA可幫助觸發對抗感染的免疫加強作用，同時預防任何潛在 的損害性炎症過程。因此，本發明的一個實施方案是包含SIgA和至少一種益生菌的組合物，用於製備 治療或預防非病毒性感染的產品。
本發明還涉及包含SIgA和至少一種益生菌的組合物在製備用於治療或預防非病 毒性感染的產品中的用途。本發明另外涉及包含SIgA和至少一種益生菌的組合物，用於治療和/或預防非病 毒性感染。本發明擴展至包含SIgA和至少一種益生菌的組合物，用於治療和/或預防非病毒 性感染。非病毒性感染的治療包括非病毒性感染的減弱。「益生菌」是指對宿主健康或身心健康具有益作用的微生物細胞製備物或微生物 細胞組分° (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人"Probiotics :how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999 10 107-10)。根據本發明可使用所有益生菌微生物。優選的，它們可選自雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口酵母 屬(Saccharomyces)或其混合物，特別選自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳 雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李 H L If lif (Lactobacillus rhamnosus) > glj zF ？L If lif (Lactobacillus paracasei) > ^ 15 If lif (Lactobacillus johnsonii) > ^ If lif (Lactobacillusplantarum) > ^？LIf lif (Lactobacillus salivarius) > M lif (Enterococcus faecium) > ^iif^BJ (Saccharomyces boulardii)和羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)或其混合物，優選的 選自約氏乳桿菌(NCC533 ；CNCM 1-1225)、長雙歧桿菌(NCC490 ；CNCM 1-2170)、長雙歧桿菌 (NCC2705 ；CNCM 1-2618)、乳雙歧桿菌(2818 ；CNCM 1-3446)、副乾酪乳桿菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌(NCC4007 ；CGMCC 1. 3724)、屎腸球 菌 SF 68(NCIMB101415)，和其混合物。本發明的組合物還可包含益生素。益生素的添加是有益的，因為當與益生菌組合 時其可發揮在健康益處方面的協同作用。包含益生素和益生菌組合的組合物一般被稱為共 生組合物。「益生素」是指在腸中促進益生菌生長的食物成分。它們不在消化其的人胃中 和/或腸的上部被分解或在胃腸道中被吸收，但被胃腸微生物群和/或益生菌發酵。益 生素例如定義於 Glenn R. Gibson 禾P Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept of Prebiotics,J. Nutr. 1995125 1401-1412。根據本發明可使用的益生素沒有特別限制，包括所有在腸中促進有益細菌例如雙 歧桿菌或乳桿菌，和/或益生菌生長的食物成分。優選的，它們可選自寡糖，任選的包含果 糖、半乳糖、甘露糖；膳食纖維，特別是可溶纖維、大豆纖維；菊粉；或其混合物。優選的益生 素為寡聚果糖(FOS)、寡聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，G0S)、寡聚異麥芽糖、寡聚 木糖、大豆寡糖、糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳果糖(LA)、寡聚異麥芽酮糖(PAO)、寡聚麥 芽糖、果膠和/或其水解產物。本發明的非病毒性感染可以是細菌和/或寄生蟲感染。也可是真菌感染。非病毒性感染可以是細菌感染，選自大腸桿菌感染、霍亂弧菌(Vibriocholerae) 感染、沙門氏菌感染、梭狀芽胞桿菌感染、志賀菌屬感染、寄生蟲感染，包括蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)和隱孢子蟲屬 (Cryptosporidium spp)或其混合物。可用本發明治療或預防的典型細菌感染性疾病包括沙門氏菌病、細菌性痢疾、傷 寒、細菌性腦膜炎、炭疽、食物中毒、普魯斯病、彎曲菌病、貓抓病、霍亂、白喉、流行性斑疹傷 寒、淋病、小膿皰疹、軍團桿菌病、麻瘋病(Hansen病)、細螺旋體病、利斯特菌病、萊姆病、類 鼻疽、風溼熱、MRSA感染、諾卡菌病、百日咳、瘟疫、肺炎球菌性肺炎、鸚鵡病、Q熱、洛磯山斑 疹熱(RMSF)、猩紅熱、梅毒、傷風、沙眼、肺結核、土拉菌病、斑疹傷寒症、和/或尿道感染。可用本發明治療或預防的典型寄生蟲傳染性疾病包括非洲錐蟲病、變形蟲病、蛔 蟲病、巴貝西蟲病、美洲錐蟲病、華支睪吸蟲病、隱孢子蟲病、囊蟲病、裂頭絛蟲病、龍線蟲 病、包蟲病、蟯蟲病、片形吸蟲病、薑片蟲病、絲蟲病、自由生活阿米巴感染、賈第鞭毛蟲病、 顎口線蟲病、膜殼絛蟲病、等孢球蟲病、黑熱病、利什曼病、瘧疾、後殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾 絲蟲病、蝨咬症、蟯蟲感染、疥瘡、血吸蟲病、絛蟲病、弓蛔蟲病、弓形體病、旋毛蟲病、旋毛蟲 病、鞭蟲病、滴蟲病、和/或錐蟲病。可用本發明治療或預防的典型真菌感染性疾病包括麴黴菌病、芽生菌病、念珠菌 病、球孢子菌病、隱球菌病、組織胞漿菌病、和/或腳癬。使用本發明製備的產品可為食物產品、動物食物產品或藥物組合物。例如，所述產 品可為營養組合物、營養食品、飲料、食物添加劑或藥物。食物添加劑或藥物可為例如片劑、膠囊、錠劑或液體形式。食物添加劑或藥物優選 以持續釋放製劑提供，使SIgA和益生菌的持續供應維持更長的時間。產品優選的選自基於奶粉的產品、方便飲料、可立即飲用的製劑、營養粉、營養 液、基於奶的產品特別是酸乳酪或冰激凌、穀物產品、飲料、水、咖啡、熱牛奶咖啡(cappucc ino)、麥芽飲料(malt drink)、巧克力口味飲料、烹飪產品、湯、片劑和/或糖漿。奶可為任意可從動物或植物來源得到的奶，優選的為牛奶、人奶、綿羊奶、山羊奶、 馬奶、駱駝奶、米乳(rice milk)或豆奶。除了奶以外，可使用來源於奶的蛋白質部分或初乳。組合物可進一步包含保護性水狀膠質(例如樹膠、蛋白質、變性澱粉)、粘合物、 成膜劑、成膠囊劑/材料、囊/外殼材料、基質化合物、塗料、乳化劑、表面活性劑、加溶劑 (油、脂肪、蠟、卵磷脂等等)、吸附劑、載體、填料、共化合物(co-compound)、分散劑、溼潤 劑、加工助劑(溶劑)、流動劑、掩味劑、增重劑、膠凝劑(jellifying agents)、膠凝劑(gel formingagents)、抗氧化劑和抗菌劑。其還可包含傳統藥物添加劑和佐劑、賦形劑和稀釋 劑，包括但不局限於水、任意來源的明膠、植物膠、木素磺酸鹽、滑石、糖、澱粉、阿拉伯樹膠、 植物油、聚亞烷基二醇、調味劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、緩衝液、潤滑劑、著色劑、溼潤齊U、 填料，等等。此外，其可包含適於口或腸施用的有機或無機載體材料及維生素、微量礦物質 元素和符合政府機關推薦的例如美國推薦的日攝食量(USRDA)的其他微量營養素。本發明的組合物可包含蛋白質來源、碳水化合物來源和/或脂來源。可使用任意合適的膳食蛋白質，例如動物性蛋白質(例如奶蛋白、肉蛋白和卵蛋 白)；植物性蛋白質(例如大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游離胺基酸的混合 物；或其組合。奶蛋白例如酪蛋白和乳清和大豆蛋白是特別優選的。如果組合物包括脂肪來源，則脂肪來源更優選提供配方5%至40%的能量；例如20%至30%的能量。可添加DHA。可使用芥籽(canola)油、玉米油和高油酸向日葵油混合 物得到合適的脂肪譜。碳水化合物來源可更優選的提供組合物的40%至80%能量。可使用任意合適的 碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、固體玉米糖漿、麥芽糊精和其混合物。由本發明製備的產品可對人或動物施用，特別是伴侶動物、寵物或家畜。其對任何 年齡群體均具有有益作用。優選的，產品計劃供嬰兒、青少年、成人或老年人使用。然而也 可對懷孕期和哺乳期的母親施用以治療嬰兒。當益生菌和SIgA同時、一種緊接另一種施用時，在最大時間範圍少於60分鐘、優 選的少於30分鐘、更優選的少於15分鐘和最優選的少於5分鐘時，和/或二者在施用前已 組合存在於食物產品中時，本發明的組合物有效。然而，發現如果SIgA和益生菌在施用前組合為複合物，益生菌和SIgA的組合特別 有效。其優勢在於有益的複合物不需要在消耗產品後組成，而是已經存在於食物產品中。因此，本發明的一個實施方案涉及包含SIgA和益生菌的組合物的用途，其中SIgA 分子和至少一種益生菌在組合物中至少部分結合。SIgA和至少一種益生菌優選的作為免疫複合物存在，例如至少90%、更優選的至 少95%、甚至更優選的所有益生細菌均結合至少1個SIgA分子，例如至少5個SIgA分子以 免疫複合物存在。組合物還可包含至少另一種其他食品級細菌，優選的選自乳酸細菌、雙歧桿菌、腸 球菌或其組合。這些其他食品級細菌可利於得到健康的腸微生物群，因此利於更有效的實 現本發明的目的。本發明還涉及包含SIgA和至少一種益生菌微生物的食物組合物。SIgA和益生菌 微生物可優選的在食物組合物中作為複合物組合。SIgA和益生菌微生物可優選的以至少 10 1、優選的至少100 1、最優選的至少2000 1至100000 1的化學計量比率存在。 SIgA飽和的上限由益生菌微生物的表面和可結合SIgA的結合位點數決定。一般的，益生菌在大範圍的量內有效。如果細菌活著到達腸，則單個細菌就足以通 過在腸中延續並增殖達到有力的效果。然而一般而言，如果產品包含每日劑量102和1010 之間的細胞益生菌則是優選的。發揮作用所需要的SIgA量同樣沒有局限。原則上一個SIgA分子與一個益生菌 微生物結合，優選以複合物形式，即對於本發明而言有效。然而一般而言，如果產品包含 0. OOOlmg SIgA和IOmg SIgA之間的每日劑量則是優選的。本領域技術人員將理解在不背離公開的發明範圍內，他們可自由組合此處描述的 本發明的所有特徵。具體來說，描述本發明用途的特徵將應用於本發明的組合物，例如食物 組合物，反之亦然。通過以下實施例和圖，本發明的其他優勢和特徵是顯而易見的。圖1圖解顯示了 SIgA是如何被認為改進共生細菌的作用的，當SIgA與其結合時 增加了與宿主腸黏膜的相互作用。圖2顯示了代表2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益生菌菌株鼠李糖乳桿菌 NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌NCC2818 (BL818)與上皮細胞的結合性能的檢測實驗結果。數 據以每100個Caco-2細胞的菌落形成單位(CFU)平均值士標準誤(SEM)表示。
圖3顯示了代表2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益生菌菌株鼠李糖乳 桿菌NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌NCC2818 (BL818)與上皮細胞的結合性能以及分泌型 IgA(SIgA)或分泌成分(SC)的影響的檢測實驗結果。數據以每100個Caco-2細胞的CFU 平均值士 SEM表示。圖4顯示了代表2種主要菌種乳桿菌和雙歧桿菌的2種益生菌菌株鼠李糖乳桿菌 NCC4007 (LPR)和乳雙歧桿菌NCC2818 (BL818)，單獨或與SIgA或SC組合，對測量上皮滲透 性的跨上皮電阻(TER)的影響的檢測實驗結果。數據以每平方釐米的歐姆平均值士SEM表
7J\ ο圖5顯示了 LPR，與SIgA或SC組合或未組合，在Caco_2細胞單層中對NF- κ B活 化的影響的檢測實驗結果。NF-K B結合活性的降低指示Caco-2細胞內減弱的炎症途徑。圖6顯示了 LPR，與SIgA或SC組合或未組合，對Caco_2細胞的福氏志賀菌 (S. flexneri)入侵的影響的檢測實驗結果。使用了 2種單克隆SIgA分子識別沙門氏 菌屬表位的非特異性SIgA(SIgAnon特異性)和特異性抗福氏志賀菌SIgAC5。數據以每 Transwell濾膜的CFU平均值士 SEM表示。圖7顯示了益生菌對Caco-2單層中多聚Ig受體(plgR)表達的影響的檢測實驗 結果。(A)在16小時檢測不同的處理，包括益生菌和非特異性SIgA的組合，及福氏志賀菌 和特異性抗福氏志賀菌SIgA的組合。用蛋白質印跡檢測plgR的存在，如同β-肌動蛋白。 (B)plgR表達水平的半定量分析，用肌動蛋白標準化，通過對A中凝膠鑑定條帶的密度 計分析。(C)與各種製劑孵育24小時的Caco-2細胞中的plgR表達的動力學(酶聯免疫吸 附法(ELISA))。實施例1 與上皮細胞的結合每平方釐米Transwell濾膜上接種約106CacO-2細胞。細胞和不同劑量的細菌 (如圖注中所示)在無抗生素或FCS下於37°C孵育16小時。使用LPR、BL818和大腸桿菌 (E. coli) TG-I細菌的新鮮過夜培養物。之後在計數前清洗細胞。通過在MRS或LB平板上 塗板計數結合的細菌。每個實驗進行3次重複檢測。數據以每100個Caco-2細胞結合的 細菌的平均值士SEM表示。每個實驗進行3次重複檢測。在隨後的實驗中，在存在遞增濃 度的SIgA或SC下(如圖3的圖注中所示)，細胞和2xl07細菌於37°C孵育16小時。之後 在計數前清洗細胞。通過在MRS或LB平板上塗板計數結合的細菌。每個實驗進行3次重 復檢測。數據以每100個Caco-2細胞結合的細菌的平均值士SEM表示。每個實驗進行3 次重複檢測。與大腸桿菌TG-I相比，觀察到LPR或BL818對極化Caco-2細胞的優先結合。益 生菌對腸上皮細胞具有劑量依賴性的結合能力。可以觀察到結合性能在2種菌株之間存在差異。在隨後的實驗中使用2x107CFU的益生菌，因為此劑量一方面不會引起培養基的任 何PH改變，另一方面顯示了有效的結合比率。提高單克隆SIgA的劑量促進了 UR和BL818 二者結合極化Caco-2細胞單層的能 力。與細菌結合時，分泌成分未展示這些性能(圖3)。在隨後的實驗中選擇Iyg劑量的 SIgA，此劑量可顯著改進益生菌的結合能力。此劑量致使形成由約50』 000至100』 000單位SIgA對應1個細菌組成的最終複合物。結果顯示於圖2和3。實施例2 極化Caco-2細胞單層的屏障功能每平方釐米Transwell濾膜上接種約106Caco_2細胞。細胞和2xl07CFU細菌在不 存在抗生素或FCS下於37°C孵育24小時。檢測單獨的細菌，或與圖4的圖注中指示濃度的 SIgA或SC組合的細菌。在3、6、9、15和24小時測量跨上皮電阻(TER)。對照包括和SIgA 和SC單獨的孵育。每個實驗進行3次重複檢測。極化Caco-2細胞單層和LPR或BL818的單獨孵育導致跨上皮電阻(TER)的 20-25%的增加，提示益生菌增強了上皮的屏障功能。當細菌和SIgA或SC組合時仍然如此 (圖4)。SIgA或SC本身不引起任何TER變化。結果顯示於圖4。實施例3 極化Caco-2細胞單層中的NF_kB活化每平方釐米Tran8well濾膜上接種約106Caco_2細胞。細胞和2xl07CFU LPR在不 存在抗生素或FCS下於37°C孵育16小時。檢測單獨的細菌，或與圖5的圖注中指示濃度的 SIgA或SC組合的細菌。使用福氏志賀菌、傷寒沙門菌(S. Typhi)和幽門螺桿菌(H. Pylori) (2x107CFU)在對照實驗中作為前炎性病原體。製備細胞核提取物並進行電泳遷移位移分析 (EMSA)以檢測NF-κ B與特異性DNA探針的結合。平行獲得細胞質提取物，用蛋白質印跡檢 測IKBa的存在，使用針對該蛋白的抗IKBa特異性單克隆抗體。與非病原菌相比，極化的Caco-2細胞單層暴露於病原菌導致明顯更顯著的細胞 核NF- κ B活化(圖5)。I κ B α (下圖)的消失表示導致NF- κ B核轉運的途徑活化。因此，雖然單獨的LPR 對NF- κ B活化具有輕微作用，LPR和SIgA或SC的組合降低了 Caco-2細胞中的NF- κ B活 化(未檢測BL818)。與預期中相同，上皮細胞和致病福氏志賀菌的孵育導致ΙκΒα表達的 完全消失。結果顯示於圖5。實施例4 抗致病活性每平方釐米Transwell濾膜上接種約106Caco_2細胞。細胞和2xl07CFU LPR在不 存在抗生素或FCS下於37°C孵育16小時。檢測單獨的LPR，或與0.2yg SC、lyg多克隆 SIgA或1 μ g特異性抗福氏志賀菌LPS的SIgAC5組合的LPR。與LPR孵育後清洗細胞，之 後與IO7福氏志賀菌孵育6小時，再次清洗細胞並與50mg/ml慶大黴素孵育45分鐘。最後， 裂解細胞並在LB瓊脂平板上計數細胞內的福氏志賀菌。每個實驗進行3次重複檢測。LPR的加入以劑量依賴的方式降低了福氏志賀菌對極化Caco-2細胞單層的感染。 與SIgA組合後此作用大大增強了。當使用福氏志賀菌LPS特異性SIgAC5抗體時可得到對 感染的完全保護(圖6)。結果顯示於圖6。實施例5:
極化Caco-2細胞單層中的多聚Ig受體的表達每平方釐米Transwell濾膜上接種約106Caco_2細胞。細胞和2xl07CFU LPR或 BL818在不存在抗生素或FCS下於37°C孵育16小時。檢測單獨的益生菌，或與0. 2 μ g SC 或1 μ g多克隆SIgA組合的益生菌。檢測單獨的對照福氏志賀菌，或與1 μ g特異性抗福 氏志賀菌LPS的SIgAC5組合的對照福氏志賀菌。清洗後，從Transwell濾膜上直接收穫 Caco-2細胞並裂解。去除細胞核，通過蛋白質印跡分析細胞碎片和細胞質，使用抗PlgR抗 體和人SC和肌動蛋白的抗血清作為對照。每個實驗進行3次重複檢測。在隨後的實驗中，按照相同的程序孵育細胞，之後在孵育8、16和24小時後從 transwell濾膜上收穫細胞。通過ELISA在細胞碎片/細胞質組分中進行plgR的定量分 析。通過BCA蛋白質法測定總蛋白質。用蛋白質含量標準化數值，數據以ng plgR/mg總蛋 白的平均值士 SEM表示。plgR在上皮細胞中的表達用β-肌動蛋白的表達標準化。蛋白質印跡(上圖) 和對各個(條帶)信號的密度計分析(下圖)顯示，與單獨益生菌相比，過夜暴露於UR或 BL818和SIgA或SC組合的極化Caco-2細胞單層中的plgR水平增加(圖7a)。特異性抗 福氏志賀菌LPS的SIgAC5阻止了病原菌和Caco-2細胞極化單層的相互作用，因此解釋了 與福氏志賀菌單獨處理相比PlgR表達的降低。結果進一步顯示了在極化Caco-2細胞單層暴露於益生菌和SIgA或SC的組合後， 多聚Ig受體(PlgR)水平的時間依賴性增加(圖7b)。結果顯示於圖7。
權利要求
1.包含分泌型IgA和至少一種益生菌的組合物在製備用於治療、減弱或預防非病毒性 感染的產品中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中非病毒性感染為細菌感染、寄生蟲感染或真菌感染。
3.根據前述權利要求之一的用途，其中非病毒性感染為細菌感染，選自大腸桿菌感染、 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)感染、沙門氏菌感染、梭狀芽胞桿菌感染、志賀菌屬感染，寄生 蟲感染，包括蘭伯賈第蟲(Giardialamblia)、溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica) 和隱孢子蟲屬(Cryptosporidium spp)或其混合物。
4.根據前述權利要求之一的用途，其中益生菌選自雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、 乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口 酵母屬(Saccharomyces) 或其混合物，特別選自長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌 (Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆 |if (Lactobacillus rhamnosus) > glj zFIf lif (Lactobacillus paracasei) > 氏 ^L If lif (Lactobacillus johnsonii) > ^ If lif (Lactobacillusplantarum)、[！I ^夜 ？L If lif (Lactobacillus salivarius) > M 1 lif (Enterococcus faecium) > ii BJ (Saccharomyces boulardii)和羅伊乳桿菌(Lactobacillus reuteri)或其混合物，優選的 選自約氏乳桿菌(NCC533 ;CNCM 1-1225)、長雙歧桿菌(NCC490 ;CNCM 1-2170)、長雙歧桿菌 (NCC2705 ；CNCM H618)、乳雙歧桿菌 Q818 ；CNCM 1-3446)、副乾酪乳桿菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌GG(ATCC53103)、鼠李糖乳桿菌(NCC4007 ；CGMCC 1.37M)、屎腸球 菌 SF 68(NCIMB101415)，和其混合物。
5.根據前述權利要求之一的用途，其中產品為食物產品或藥物組合物。
6.根據前述權利要求之一的用途，其中產品計劃供人，特別是嬰兒、青少年、成人或老 年人消耗。
7.根據前述權利要求之一的用途，其中分泌型IgA和至少一種益生菌在組合物中至少 部分結合。
8.根據前述權利要求之一的用途，用於增強免疫功能。
9.根據前述權利要求之一的用途，其中組合物包含至少另一種其它食品級細菌，其優 選的選自乳酸菌、雙歧桿菌、腸球菌或其混合物。
10.根據前述權利要求之一的用途，其中產品還包含至少一種益生素，其優選的選自寡糖。
11.根據前述權利要求之一的用途，其中產品每日劑量包含IO2至101°個益生菌細胞。
12.根據前述權利要求之一的用途，其中產品每日劑量包含0.OOOlmg分泌型SIgA至 IOmg SIgA。
13.包含SIgA和至少一種益生菌微生物的食物組合物。
14.根據權利要求12的食物組合物，其中所述的至少一種益生菌微生物和SIgA相結 合。
全文摘要
本發明大體上涉及營養、健康和身心健康領域。具體來說，本發明涉及益生菌和增加其有效性的途徑。本發明的一個實施方案涉及益生菌和分泌型IgA的組合以及此組合的可能用途。例如公開了包含分泌型SIgA和至少一種益生菌的組合物在製備用於治療或預防感染的產品中的用途。
文檔編號A61P31/00GK102076361SQ200980124320
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月16日 優先權日2008年6月24日
發明者B·科特西, J·本雅各布, L·法沃爾, S·布蘭-斯佩裡森 申請人:雀巢產品技術援助有限公司