一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記及其應用的製作方法
2023-05-03 01:27:21
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段檢測致病菌的方法，具體為一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記及其應用。
背景技術：
中國是世界上草莓野生資源最豐富的國家，生產面積居世界第一位。近年來隨著草莓大棚栽培技術的推廣，保護地草莓面積越來越大，但棚內高溫多溼，易為病蟲害發生創造極有利的環境條件。草莓灰黴病、草莓炭疽病和草莓黃萎病是草莓病害中危害較嚴重，傳播較廣的病害。這三種病原菌以菌絲體及孢子隨病殘體在土壤中越冬，環境條件適宜時可侵染植株，病害症狀一旦顯現，就對草莓造成危害，並且病害流行速度快，經濟損失嚴重。因此，亟需一種能夠在發病初期或土壤中進行早期快速檢測的技術，以便及時採用針對性的有效防治措施來控制病害的發生和傳播。
傳統的病害診斷方法，大多根據植株的明顯症狀和病原菌形態特徵。近年來，有研究通過觀察病原菌分生孢子和附著胞的大小及形狀、確定宿主範圍和致病性，以及採用斑點雜交法和血清學等方法進行這3種草莓病原菌的檢測，但由於這些檢測方法操作難度大、實用性不足、靈敏度低且耗時耗了等缺點逐步被分子檢測技術所取代。目前已有許多關於草莓病原菌分子檢測技術的報導。但是均是採用一對引物對致病菌進行檢測，導致檢測結果不穩定，結果重複性不好。
技術實現要素：
本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種能夠快速、靈敏、穩定的檢測草莓灰黴病菌的方法，本發明提供了一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記及其應用。
技術方案：一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優選的，所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
表1分子標記序列
所述的分子標記在製備檢測草莓灰黴病菌試劑盒中的應用。
優選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
優選的，所述試劑盒檢測草莓灰黴病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200～500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋20～50倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
優選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
優選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
優選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
優選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
優選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
有益效果：(1)本發明所述分子標記具有檢測時間短、試驗成本低和快速高通量的優點；(2)本發明所述分子標記能夠在病害潛伏期或初期進行快速檢測，為田間草莓病害防治贏得有利時機，因此具有實際應用價值。
附圖說明
圖1是實施例1～3檢測結果圖；
其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實施例1pcr產物電泳結果；2為實施例2pcr產物電泳結果；3為實施例3pcr產物電泳結果。
具體實施方式
實施例1
一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在製備檢測草莓灰黴病菌試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測草莓灰黴病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋200倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋50倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
實施例2
一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在製備檢測草莓灰黴病菌試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測草莓灰黴病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋300倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋40倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
實施例5
一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在製備檢測草莓灰黴病菌試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測草莓灰黴病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋20倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
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一種用於檢測草莓灰黴病菌的分子標記及其應用
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