一種環氧化物水解酶及其製備方法
2023-05-03 01:47:26
專利名稱：一種環氧化物水解酶及其製備方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及通過定點突變得到的環氧化物水解酶。
背景技術：
環氧化物水解酶(印oxide hydrolase, EH, EC 3. 3. 2. 3)是催化環氧化物或其 鹽水解為相應鄰二醇或其鹽的一類酶的總稱，催化反應無需任何輔酶、輔基或金屬離子的 參與。環氧化物水解酶廣泛分布於哺乳動物、植物和微生物中，目前大多數報導都集中在 哺乳動物的環氧化物水解酶中，主要研究它在細胞解毒和重要生物活性物質代謝中的作 用。近年來，微生物來源的環氧化物水解酶由於具有立體專一性好、酶促反應快、產物光學 純度和得率高、產物分離純化簡單易行等特點，備受人們關注。1998年Archelas等首次 成功地將環氧化物水解酶應用於工業化生產，合成L(+)_酒石酸(Archelas A，Furstoss R. Epoxidehydrolase :new tools for the synthesis of fine organic chemicals. TrendsBiotechnol 1998 ；16 :108—116)。L (+)-酒石酸，又名(2R，3R) _2，3_ 二羥丁烷_1，4_ 二羧酸，是一種天然結構的有 機酸，可用於諸如以下行業在食品行業諸如可作為食品添加劑、增味劑以及食用色素成分 之一；在醫藥行業諸如用於抗結核藥乙胺丁醇的生產，作為不可替代的光學異構體拆分劑； 在化學工業及其它工業，諸如用於印染的防染劑、照相顯影劑、金屬離子隱蔽劑、電鍍、製革 及制鏡行業。過去，生產L(+)_酒石酸的主要方法是利用葡萄酒的副產物酒石或羅望子果為原 料經加工製得，或者從酒石中提取，或者以葡萄糖為主要原料通過一步發酵法提取。而通過 含有環氧化物水解酶的微生物轉化法是目前L (+)-酒石酸生產的發展方向，其原理如下 以順丁烯二酸酐為原料經加水得到順丁烯二酸溶液，再以鎢酸或鎢酸鹽為催化劑使順丁烯 二酸與過氧化氫反應製得順式環氧琥珀酸，最後利用微生物環氧化物水解酶將順式環氧琥 珀酸或其鹽水解為L(+)_酒石酸或其鹽。目前報導的能生產L(+)_酒石酸的微生物有根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌 屬(Pseudomonas)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、紅球菌屬 (Rhodococcus)、無色桿菌屬(Achromobacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬 (Agrobacterium)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes)禾口不雲力桿菌屬(Acinetobacter)0工業生產 中常用的是具有較高酶活性的紅球菌屬。2007年Liu等首次報導了紅球菌Rhodococcus opacusML-0004環氧化物水解酶的基因序列並在原核細胞中表達(請參見Liu ZQ, Li Y， Xu YY, Ping LF, Zheng YG. Cloning, sequencing, and expression of a novelepoxide hydrolase gene from Rhodococcus opacus in Escherichia coli andcharacterization of enzyme. Appl Microbiol Biotechnol 2007 ;74 :99_106)。然而該酶極不穩定，對溫度特 別敏感，在35°C保溫30min後，酶活力只有原來的60%，40°C保溫30min後，活力幾乎完全 喪失，這極大限制了生物催化劑的使用效率。因此，如何提高酶的溫度穩定性並維持高酶活 性，是目前利用生物轉化法生產L(+)-酒石酸急需解決的一個問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的環氧化物水解酶及其製備方法。為實現上述目的，本發明所採取的技術方案是本發明所述的DNA分子的主體核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示。本發明所述的重組載體含有主體核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。本發明所述的宿主細胞含有重組載體，所述重組載體含有主體核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。本發明所述環氧化物水解酶的主體胺基酸序列的第163位的胺基酸為苯丙氨酸， 所述主體胺基酸序列如SEQ ID NO 10所示。進一步地，本發明所述環氧化物水解酶由主體核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的 DNA分子所編碼。本發明所述的環氧化物水解酶的製備方法是用苯丙氨酸取代野生型環氧化物水 解酶的主體胺基酸序列第163位的酪氨酸，所述野生型環氧化物水解酶的主體胺基酸序列 如SEQ ID NO 4所示，該野生型環氧化物水解酶由主體核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的 DNA分子所編碼。進一步地，本發明所述取代是指將野生型環氧化物水解酶主體胺基酸序列第163 位的酪氨酸定點突變為苯丙氨酸。相對於現有技術，本發明的有益效果在於1.通過定點突變技術，得到一種新的DNA分子，其主體核苷酸序列如SEQ IDNO 9 所示，編碼具有如SEQ ID NO :10所示胺基酸序列的突變型環氧化物水解酶。2.通過基因工程技術，得到了一種新的重組載體，其含有主體核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。3.通過基因工程技術，得到了一種新的宿主細胞，其含有重組載體，所述重組載體 含有主體核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子，該宿主細胞可表達突變型環氧化物 水解酶。4.本發明通過定點突變，將野生型環氧化物水解酶主體胺基酸序列第163位的酪 氨酸取代為苯丙氨酸，大大提高了酶的溫度穩定性並維持高酶活性。而目前國內外還未見 對環氧化物水解酶定點改造的研究報導。5.通過基因工程技術，得到了一種表達本發明突變型環氧化物水解酶的基因工程 菌，利用該基因工程菌生產L (+)-酒石酸，大大提高了細胞的使用壽命，符合目前工業應用 的要求。 生物材料樣品的保藏信息保藏的生物材料樣品紅球菌(Rhodococcus sp)；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)；保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所(郵編 100101)；保藏日期2006年7月13日；保藏登記號CGMCCNo. 1756
注該紅球菌CGMCC1756 (Rhodococcus sp. CGMCC1756)已在 2010 年 1 月 27 日授 權公告的專利號為ZL200710002155. 9的中國專利說明書中記載。
圖1為本發明環氧化物水解酶純化過程的SDS-PAGE圖，其中，M:蛋白分子量標準，從上至下依次為116kDa、66. 2kDa、45kDa、35kDa、25kDa、 18.4kDa、14. 4kDa ；A 超聲上清液；B =Ni-NTA柱非結合流出液；C:純化後的蛋白液。圖2為溫度對野生型和本發明突變型環氧化物水解酶活性影響的對比圖。圖3為溫度對野生型和本發明突變型環氧化物水解酶穩定性影響的對比圖。
具體實施例方式在本發明的以下實施例中，有關的檢測方法如下(1)酶活測定方法將0. 9ml lmol/L的順式環氧琥珀酸鈉底物(pH 8. 0)於30°C 保溫7min後，加入0. Iml酶液並在30°C反應20min，測定反應液中酒石酸的含量。在上述 反應條件下，每分鐘產生1 μ mol酒石酸定義為一個酶活單位，以U表示。在上述條件下，每 毫克蛋白所含的酶活單位數定義為比活力，用U/mg表示。(2)酒石酸含量的檢測方法取2. 5ml 1 %的偏釩酸銨於25ml的容量瓶中，加適量 的上述反應液後，再加Iml lmol/L的硫酸，用蒸餾水定容至25ml，混勻後測480nm處的吸光 值，並根據制定的標準曲線計算反應液中酒石酸的含量。(3)蛋白濃度的測定方法取5ml考馬斯亮藍染色液(0. Ig考馬斯亮藍溶於50ml 95%乙醇，加入IOOml 85%磷酸，加水定容至1L)，加入適量蛋白液，混勻後測595nm處的吸 光值，並根據制定的標準曲線計算蛋白濃度。(4)對映體過量值的測定方法取0. Iml環氧化物水解酶液加入0. 9ml lmol/L的 順式環氧琥珀酸鈉(PH 8.0)中，30°C反應4h，用蒸餾水將反應液稀釋400倍後，用高壓液 相色譜(Agilent 1200)檢測，並計算L(+)_酒石酸的對映體過量值，其具體檢測條件為手 性柱 Astec CLC (150 X 4. 6讓)；進樣量 20 μ 1 ；柱溫 30 °C ；流動相 3mM CuSO4 (pH 3. 2)；流速 lml/min ；檢測波長 254nm。(5) Km和Vmax值的測定方法將等量酶液分別置於終濃度為10mmOl/L、20mmOl/ L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、160mmol/L 的順式環氧琥珀酸鈉底物(pH 8.0)中，30°C 反應5min，測定反應液中酒石酸的含量，並用Lineweaver-Burk雙倒數法，計算酶的Km和 Vmax值，其單位分別為mmol/L和U/mg。 實施例1 紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶基因的獲得
將紅球菌CGMCC1756接種至種子培養基(1%葡萄糖，0. 5%蛋白腖，0. 5%牛肉膏， 氯化鈉，PH7. 5)中，30°C振蕩培養24h。用EZ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒(購於Bio Basic Inc.公司)，按照說明書提取紅球菌CGMCC1756的基因組DNA。根據美國GenBank數 據庫中公開的紅球菌ML-0004 (Rhodococcus opacusML-0004)環氧化物水解酶的核苷酸序列(登錄號DQ471957)，設計兩條引物(即引物1和引物2)，引物1和引物2的核苷酸序列 分別如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2所示。以提取的紅球菌CGMCC1756基因組DNA為模板， 利用引物1和引物2，通過常用的PCR擴增技術獲得一段約為SOObp的DNA片段。其PCR反 應體系為雙蒸水 40 μ 1，10XPCR buffer 5 μ 1,10mmol/L dNTPs 1 μ 1，1 μ 1 的 lOmmol/L 引物 1，1 μ 1 的 10mmol/L 引物 2，紅球菌 CGMCC1756 基因組 DNA 1 μ 1，Taq 酶 1 μ 1，共 50 μ 1 的反應體系。其PCR程序為94°C預熱5min後，94°C 50s, 40°C 30s, 72°C lmin，30個循環， 最後72°C延伸lOmin。PCR產物用Wizard PCR片段回收試劑盒(購於Promega公司)回 收純化後，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA測序。測序結果顯示，紅球菌 CGMCC1756環氧化物水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。實施例2 紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶表達體系的構建根據實施例1中對紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶基因的測序結果，重新設計 兩條引物(即引物3和引物4)，引物3和引物4的核苷酸序列分別如SEQID NO 5和SEQ ID N0:6所示。引物3中帶有Nco I限制性內酶切位點、6個多聚組氨酸序列和起始密碼 子。引物4中帶有Bam HI限制性內酶切位點和終止密碼子。以實施例1中提取的紅球菌 CGMCC1756基因組DNA為模板，利用引物3和引物4，PCR擴增獲得一段約為SOObp的核苷 酸片段。其 PCR 反應體系為雙蒸水 40 μ 1，10XPCR buffer 5 μ l,10mmol/L dNTPs 1μ 1, 1 μ 1 的 10mmol/L 引物 3，1 μ 1 的 10mmol/L 引物 4，紅球菌 CGMCC1756 基因組 DNA 1 μ 1， Taq酶1 μ 1，共50 μ 1的反應體系。其PCR程序為94°C預熱5min後，94°C 50s，55°C 30s， 72°C lmin，30個循環，最後72°C延伸lOmin。將該PCR片段和pTrc99A載體(購於Amersham Biosciences公司)分別用限制性內切酶NcoI和Bam HI於37°C酶切10h。跑瓊脂糖凝 膠電泳，用Wizard PCR片段回收試劑盒(購於Promega公司)回收純化兩個目的片段後， 用！； DNA連接酶於16°C連接4h，將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞(購於北京 鼎國生物技術有限責任公司，其基因型為recAl，endAl，gyrA96，thi-1, hsdR17，supE44， relAl, Δ (lac-proAB) /F' [traD36, proAB+, laclq, IacZ ΔM15])，塗布於含 50 μ g/ml 氨苄 青黴素的LB瓊脂平板上(1%蛋白腖，0. 5%酵母提取物，氯化鈉，1. 5%瓊脂粉，pH7. 0)， 通過菌落PCR(其PCR反應體系中的模板為1 μ 1菌液，其餘PCR反應體系和程序與實施 例1相同)篩選陽性克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果顯示， 紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶基因成功克隆到pTrc99A載體中，將該重組載體命名為 pTrc99A-EH，該基因工程菌命名為野生型基因工程菌，其表達的蛋白命名為野生型環氧化 物水解酶。所述野生型基因工程菌表達的環氧化物水解酶的胺基酸序列，除了含有SEQ IDNO :4所示的胺基酸序列外，還含有6個組氨酸標籤序列。為明確起見，本發明將具有SEQ ID NO 4所示的胺基酸序列定義為野生型環氧化物水解酶的主體胺基酸序列，將具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列定義為野生型環氧化物水解酶的主體核苷酸序列，6個組氨酸 序列為環氧化物水解酶的標籤序列。本發明並不限定任何特定類型的前導序列、標籤序列 或信號肽。實施例3 紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶基因的定點突變對紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶的主體胺基酸序列第163位的酪氨酸(Tyr，對應密碼子為TAC)定點突變為苯丙氨酸(Phe，對應密碼子為TTC或TTT)。TTC和TTT是同 義密碼子，它們均編碼苯丙氨酸，本發明以TTC密碼子為例，設計突變引物(即引物5和引 物6)，引物5和引物6的核苷酸序列分別如SEQ IDNO 7和SEQ ID NO 8所示。以實施例 2中的重組載體pTrc99A-EH為模板，以引物5和引物6為突變引物進行PCR擴增。其PCR 反應體系為雙蒸水 40 μ 1，10XPCR buffer 5 μ 1,10mmol/L dNTPs 1 μ 1，1 μ 1 的 IOmmol/ L 引物 5，1μ 1 的 10mmol/L 引物 6，重組載體 pTrc99A_EH 1 μ 1，Taq 酶 1 μ 1，共 50 μ 1 的反 應體系。其PCR程序為94°C預熱5min後，94°C 50s, 66°C 30s, 72°C 6min，30個循環，最後 72°C延伸lOmin。然後將上述PCR產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，在含50 μ g/ml氨 苄青黴素的LB瓊脂平板上挑取菌落，通過上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA測 序，篩選陽性克隆。突變後的環氧化物水解酶的主體核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，其編 碼的主體胺基酸序列如SEQ ID N0:10所示。測序結果表明，紅球菌CGMCC1756環氧化物水 解酶主體胺基酸序列第163位的Tyr已成功突變為Phe。本發明將突變後的重組載體命名 為pTrc99A-EH-Y163F，該基因工程菌命名為突變型基因工程菌，其表達的蛋白命名為突變 型環氧化物水解酶。在對環氧化物水解酶主體胺基酸序列的163位酪氨酸殘基進行取代時，或保留其 核苷酸序列或胺基酸序列的其他位點的野生型，或同時對環氧化物水解酶的核苷酸序列或 胺基酸序列的其他單一位點或多位點進行取代或缺失或添加，都能達到本發明的效果。本發明所述的紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶或其突變體DNA分子以合適的取 向和正確的閱讀框插入到所述的載體，或者轉入所述的宿主細胞中，所述的DNA分子可以 在任何真核或原核系統中表達。許多宿主-載體系統都可以用來表達蛋白質編碼序列。本 發明的宿主-載體系統包括但不限於用噬菌體、質粒或粘粒轉化的細菌；含有酵母載體的 微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳動物細胞系統；用病毒感染的昆蟲細胞系統；用細菌感 染的植物細胞系統。本發明優選的載體包括病毒載體、質粒、粘粒或寡核苷酸，更優選的載 體是質粒，例如pTrc99A質粒。本發明優選的宿主為原核細胞，更優選的宿主是大腸桿菌細 胞，例如JM109。本發明所述的紅球菌CGMCC1756環氧化物水解酶或其突變體基因可以處於任何 啟動子的控制之下，可以選擇強原核啟動子，也可採用組成型或調節型的酵母啟動子。本發 明並不限定任何特定的載體、啟動子或終止子。所述的載體也可以帶一個選擇性標記，通常 是抗生素的抗性基因或者具有代謝缺陷特徵的酵母菌株的互補菌種的基因。本發明並不限 定任何特定類型的前導序列、標籤序列或信號肽。 實施例4 野生型和突變型環氧化物水解酶的表達和純化
分別接種實施例2中的野生型基因工程菌和實施例3中的突變型基因工程菌至含 50 μ g/ml氨苄青黴素的LB培養基中(1 %蛋白腖，0. 5%酵母提取物，1 %氯化鈉，pH7. 0)， 當菌體濃度(OD6tltl)達到0.4-0. 6時，加入0. 2mM異丙基硫代-β-D-半乳糖苷，37°C振蕩 培養12h。4°C，5000rpm離心IOmin收集菌體，生理鹽水衝洗三次後，按每克菌體5ml的 比例加入裂解緩衝液(50mmol/LTris-HCl，0. 5mol/L NaCl, ρΗ 7. 5)，冰預超聲破菌，4°C， SOOOrpm離心30min，取上清液，上樣至Ni-NTA親和柱(購於上海悅克生物科技有限公司)， 用洗雜緩衝液(50mmol/L Tri s-HCl,0. 5mol/L NaCl，20mmol/L 咪唑，ρΗ 7.5)洗去雜質成 份，用洗脫緩衝液(50mmol/L Tris-HCl，0. 5mol/L NaCl，200mmol/L 咪唑，ρΗ 7.5)洗脫目的蛋白，將收集的酶液於4°C，10mmol/L Tri s-HCl (pH 7. 5)緩衝液中充分透析，聚乙二醇 濃縮後，用含50%甘油的lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 5)緩衝液，於_20°C保存，並通過12% 的十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)檢測純化效果，圖1的C泳道表明，純化後的蛋白條帶單一， 純度達99%以上，其分子量約為29kDa。實施例5 野生型和突變型環氧化物水解酶的酶活分析1.溫度對野生型和突變型環氧化物水解酶活性和穩定性的影響將實施例4中純化得到的野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶分別 於 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C，按照上述檢測方法測定野生 型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶的活性。結果顯示(參見圖2)，野生型環氧化 物水解酶在25-55°C (最高酶活的60%以上)、優選為35-50°C (最高酶活的90%以上) 有較高的活力，其最高比活力為453U/mg。突變型環氧化物水解酶在25-60°C (最高酶活的 60%以上)、優選為40-60°C (最高酶活的80%以上)、更優選為45-55°C (最高酶活的90% 以上)有較高的活力，其最高比活力為462U/mg。突變型環氧化物水解酶的最適溫度略高於 野生型環氧化物水解酶，並且突變型環氧化物水解酶的最高比活力也略高於野生型環氧化 物水解酶。將實施例4中純化得到的野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶分別 於25°C、3(TC、35°C、4(TC、45°C放置30min後，在30°C的條件下，按照上述檢測方法測定野 生型和突變型環氧化物水解酶的活性，並根據對照組計算殘餘活力。對照組實驗為野生型 環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶不經過30min保溫，直接於30°C測活，對應的酶 活定義為100%。結果顯示(參見圖3)，野生型環氧化物水解酶在35°C保溫30min後，殘餘 活力為60%，40°C保溫30min後，只剩1 %的活力。然而突變型的環氧化物水解酶在35°C保 溫30min後，殘餘活力為76%，40°C保溫30min後，還剩52%的活力，遠高於野生型環氧化 物水解酶。這說明，突變型環氧化物水解酶的溫度穩定性比野生型環氧化物水解酶有顯著 提高；本發明所述的突變型環氧化物水解酶，是由含有SEQ ID NO :9的主體核苷酸序列的 重組載體在宿主細胞中表達得到的；本發明的重組載體含有主體核苷酸序列如SEQ ID N0 9所示的DNA分子；本發明的宿主細胞含有重組載體，所述重組載體含有主體核苷酸序列如 SEQ ID NO 9所示的DNA分子。2. pH值對野生型和突變型環氧化物水解酶活性和穩定性的影響將實施例4中純化得到的野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶分別 於不同酸鹼度下，具體為ρΗ 5·0、ρΗ 6·0、ρΗ 7. 0、ρΗ 8. 0、ρΗ 9. 0、ρΗ10. 0，按照上述檢測方 法測定野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶的活性。結果顯示，在PH 5.0、ρΗ 6.0、ρΗ 10.0的條件下，野生型和突變型環氧化物水解酶活力都很低(最高酶活的20%以 下)；在pH 7. 0-9.0時有較高活力，達到最高酶活的60%以上，優選pH 8. 0-9.0時，達到最 高酶活的80%以上，並且它們的最適宜的pH值都為8. 0。這說明pH對野生型環氧化物水 解酶和突變型環氧化物水解酶活性的影響基本一致。將實施例4中純化得到的野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶分別 於 pH 5. 0、ρΗ 6. 0、ρΗ 7. 0、ρΗ 8. 0、ρΗ 9. 0、ρΗ 10. 0 及室溫下放置 30min 後，於 pH 8. 0 的 條件下，按照上述檢測方法測定野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶的活性，並根據對照組計算殘餘活力。對照組實驗為野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水 解酶不經過30min的pH梯度放置，直接於pH 8. 0測活，對應的酶活定義為100 %。結果 顯示，野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶在pH 5.0、pH 6.0、pH 10. 0放置 30min後，殘餘活力均小於20% ；它們在ρΗ 7· 0_9· 0 (殘餘活力有60 %以上)放置30min 後，仍有較高活力，其中優選為PH 8. 0-9.0 (殘餘活力有80%以上)，更優選為pH 8. 0 (殘 餘活力有90%以上)。這說明pH對野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶穩定 性的影響基本一致。3.野生型和突變型環氧化物水解酶的動力學和立體特異性根據上述檢測方法，測定實施例4中純化得到的野生型環氧化物水解酶和突變 型環氧化物水解酶的動力學參數(Km和Vmax)和對映體過量值(反映酶的立體特異性)。 野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶都具有米氏酶的典型特徵，Km值分別為 50. 3mmol/L和49. 8mmol/L, Vmax值分別為687. 6U/mg和679. OU/mg，對映體過量值分別為 99. 4%和99. 5%。測定結果表明，野生型環氧化物水解酶和突變型環氧化物水解酶的動力 學性質和立體特異性基本一致。實施例6:利用本發明所述的野生型和突變型基因工程菌細胞製備L(+)_酒石酸 或其鹽本發明生產L(+)_酒石酸或其鹽的方法是在順式環氧琥珀酸或其鹽溶液中，加 入環氧化物水解酶(野生型和/或突變型)和/或基因工程菌(野生型和/或突變型)進 行酶促反應，生成L(+)_酒石酸或其鹽。本發明所涉及的順式環氧琥珀酸鹽為順式環氧琥 珀酸與各種陽離子形成的鹽，陽離子包括但不僅限於銨離子、鉀離子、鈉離子和鈣離子等。 以下舉例說明分別取Ig實施例4中經異丙基硫代_ β -D-半乳糖苷誘導的野生型和突變型基因 工程菌細胞，於100ml lmol/L順式環氧琥珀酸二鈉溶液中，30°C振蕩反應24h，加入CaCl2 水溶液，過濾並水洗沉澱，再經硫酸酸解、陰陽離子交換柱精製、濃縮、結晶和烘乾，分別得 到L(+)_酒石酸15. 2g和15. 3g。在轉化過程中，我們通過測定半衰期(酶活降低至起始酶 活一半時所需的時間)來檢測野生型基因工程菌和突變型基因工程菌的酶活穩定性。野生 型基因工程菌的酶活半衰期為10h，突變型基因工程菌的酶活半衰期為18h。這說明，突變 型基因工程菌的酶活穩定性比野生型基因工程菌有顯著提高。本發明所述的突變型基因工 程菌含有重組載體，所述重組載體含有主體核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子，該 主體核苷酸序列編碼如SEQ ID NO :10所示的蛋白，該蛋白具有環氧化物水解酶活性。
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權利要求
一種DNA分子，其特徵在於其主體核苷酸序列如SEQ ID NO9所示。
2.一種重組載體，其特徵在於其含有主體核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子。
3.一種宿主細胞，其特徵在於其含有重組載體，所述重組載體含有主體核苷酸序列 如SEQ ID NO 9所示的DNA分子。
4.一種環氧化物水解酶，其特徵在於其主體胺基酸序列的第163位的胺基酸為苯丙 氨酸，所述主體胺基酸序列如SEQ ID N0:10所示。
5.根據權利要求4所述的環氧化物水解酶，其特徵在於該環氧化物水解酶由主體核 苷酸序列如SEQ ID NO :9所示的DNA分子所編碼。
6.一種權利要求4所述的環氧化物水解酶的製備方法，其特徵在於用苯丙氨酸取代 野生型環氧化物水解酶的主體胺基酸序列第163位的酪氨酸，所述野生型環氧化物水解酶 的主體胺基酸序列如SEQ ID NO :4所示，該野生型環氧化物水解酶由主體核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的DNA分子所編碼。
7.根據權利要求6所述的環氧化物水解酶的製備方法，其特徵在於所述取代是指將 野生型環氧化物水解酶主體胺基酸序列第163位的酪氨酸定點突變為苯丙氨酸。
全文摘要
本發明公開了一種環氧化物水解酶及其製備方法。該環氧化物水解酶的主體胺基酸序列的第163位的胺基酸為苯丙氨酸，其主體胺基酸序列如SEQ IDNO10所示，該環氧化物水解酶由主體核苷酸序列如SEQ ID NO9所示的DNA分子所編碼。該環氧化物水解酶的製備方法是用苯丙氨酸取代野生型環氧化物水解酶主體胺基酸序列第163位的酪氨酸，所述野生型環氧化物水解酶的主體胺基酸序列如SEQ ID NO4所示，該野生型環氧化物水解酶由主體核苷酸序列如SEQ ID NO3所示的DNA分子所編碼。與野生型環氧化物水解酶相比，本發明環氧化物水解酶具有較高的溫度穩定性並維持高酶活性，可用於水解順式環氧琥珀酸或其鹽為L(+)-酒石酸或其鹽，提高工業化生產中生物催化劑的使用壽命。
文檔編號C12N1/21GK101942471SQ20101025360
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月13日 優先權日2010年8月13日
發明者張建國, 潘海峰, 謝志鵬, 鮑文娜 申請人:杭州寶晶生物化工有限公司