一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法
2023-05-03 01:53:26 1
專利名稱：一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型 的方法。
背景技術：
遲發性皮膚卟啉病(porphyria cutanea tarda，PCT)是由於血紅素生物合成過程
中的第5個酶-尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase, UR0-D)分子缺陷
或活性降低而引發的一種最常見的卟啉病，多在中年以後發病，男性較多。有關PCT的研究 最早見於1950年，在土耳其，人們因食用了噴灑過殺真菌劑六氯苯的小麥種子而引發了一 場PCT的大爆發。從此以後人們用六氯苯等氯化的碳氫化合物誘發動物PCT。嚙齒類動物 攝入鐵、血紅素合成前體S-氨基-Y-酮戊酸、酒精等也可誘發PCT。另一類用於研究PCT 的動物模型就是URO-D基因敲除小鼠。但是，尚未有血紅素氧化酶-1 (Heme Oxygenase-I, H0-1)誘發人或動物PCT的研究報導。血紅素氧化酶(heme oxygenase，H0)催化血紅素 分解產生鐵，一氧化碳和膽綠素。申請者在製作了全身性過表達H0-1的轉基因C57BL/6/ DBA2 (BDFl)小鼠後，發現該轉基因雄性小鼠患上了遲發性皮膚卟啉病。該遲發性皮膚卟啉 病動物模型基於H0-1轉基因的過表達。
發明內容
本發明的上述技術問題主要是通過下述技術方案得以解決的一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法，其特徵在於，包括以下步 驟步驟1，構建一線性轉基因序列，該序列從5'至3'依次含有chicken β -actin 啟動子，CMV增強子，小鼠HO-I cDNA編碼序列，終止信號rabbit β-globin poly (A)序列；步驟2，應用顯微注射方法將構建的基因序列注入C57BL/6/DBA2 (BDFl)小鼠受精 卵；步驟3，將步驟2中的受精卵植入假孕鼠的輸卵管；步驟4，產生FO代轉基因小鼠，該小鼠基因組中整合有外源性H0-1表達序列；步驟5，將獲得的陽性轉基因小鼠與野生型BDFl小鼠雜交，獲得子代。在上述的一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法，所述的構建一線性 轉基因序列的具體方位為在小鼠基因組中擴增H0-1基因序列，克隆入pCAGG載體。H0-1 cDNA 由 chicken β-actin啟動子和 CMV增強子啟動，H0-1 連接rabbit β -globin poly (A) 終止信號，質粒經Sail andDral酶切，獲得線性轉基因序列。因此，本發明具有如下優點通過轉基因技術過表達H0-1，建立了一種能自發再 現遲發性皮膚卟啉病症狀的小鼠模型，不僅為PCT的病因、發病機製作了理論上的補充，更 為其治療提供更多有價值的新理念。另一方面，本發明也為證明H0-1過表達還具有致病性 提供證據，為今後利用H0-1保護機體提供理論及實驗依據。
附圖1是顯微注射用轉基因構件示意圖；附圖2是HO-I在轉基因(Tg)及野生型(WT)小鼠肝臟中的表達及HO活性測定， A為Western blot檢測H0-1在Tg及WT小鼠肝臟中的表達水平示意圖；B為HO活性示意 圖，*，與同窩野生型小鼠比較P < 0. 05 ；附圖3是雄性HO-I轉基因(Tg)小鼠患PCT。其中，A禾Π B為雄性ΗΟ-lTg小鼠 的牙齒受到紫外線照射時發出紅色螢光(箭頭所示)；C為牙齒發出紅色螢光(紅牙小 鼠)及野生型小鼠的尿口卜琳圖。URO，uroporphyrin ；HEPTA, hepatacarboxyporphyrin ； C0PR0, coproporphyrin ；D和E為紅牙小鼠的肝臟中PCT所特有的針樣內容物(箭頭所 示)，X400。。
具體實施例方式下面通過實施例，並結合附圖，對本發明的技術方案作進一步具體的說明。實施例結合附圖，以下實施例僅用於說明本發明而不限制本發明的範圍。一、獲得目的基因設計引物，在小鼠基因組中擴增H0-1基因序列，克隆入pCAGG載體。H0_1 cDNA由 chicken β -actin 啟動子和 CMV 增強子啟動，HO-1 連接 rabbit β -globin poly (A)終止 信號(圖1)。質粒經Sail and DraI酶切，獲得線性轉基因序列，純化回收用於顯微注射。二、H0-1經顯微注射引入BDF-I小鼠受精卵及陽性鼠的產生將線性化的目的基因片段注射入BDF-I小鼠受精卵的原核中，使其與小鼠基因組 整合，隨著細胞不斷分裂，每個細胞將攜帶該片段。仔鼠出生3周後，剪去小鼠尾尖，以PCR 的方法進行轉基因小鼠的鑑定。三、轉基因在小鼠體內的表達活性結合圖2A，H0-1轉基因小鼠肝臟H0-1蛋白表達水平增加。結合圖2B，H0-1轉基因小鼠肝臟HO活性為野生型的28倍。四、轉基因小鼠的病理、生化特徵①項目申請人在成功製作了 H0-1全身過表達轉基因小鼠後，發現10月齡以上雄 性H0-1轉基因小鼠的牙齒受到紫外線照射時發出紅色螢光(圖3A、B)，至14月齡時全部 雄性H0-1轉基因小鼠都呈現此表現型。②卟啉類物質受到紫外線照射時可發出紅色螢光，因此，提示我們該10月齡以上 雄性H0-1 Tg小鼠可能患上了某種卟啉病。經高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)對牙齒出現紅色螢光的小鼠(簡稱紅牙小鼠)的尿液中卟啉含量 及成分的檢查發現，嚇啉含量明顯高於野生型同窩小鼠，且呈「uroporphyrin(URO) > hepa tacarboxyporphyrin(HEPTA)彡 coproporphyrin(C0PR0) 」樣排洩圖。這樣的卟啉排洩圖與 PCT患者的一致。③進一步，病理檢查證實凡紅牙小鼠肝內均可見到針樣的內容物(圖3D、E)，這是 PCT所特有的病理特徵。
綜上，確診10月齡以上雄性HO-I轉基因小鼠患PCT。本發明以雄性H0-1轉基因 小鼠為PCT模型，可用於對PCT發病機制的研究。在本實施例中，縮寫的含義分別如下PCT (porphyria cutanea tarda，遲發性皮膚卟啉病)URO-D(uroporphyrinogen decarboxylase,尿口卜啉原脫羧酶)H0-1 (Heme Oxygenase-1，血紅素氧化酶 _1)WT(wild type，野生型)Tg(transgene，轉基因)URO (uroporphyrin，原口卜啉)HEPTA (hepatacarboxyporphyrin, 7 羧基卟啉)C0PR0 (coproporphyrin,糞卟啉)本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬技術領 域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或採用類似的方式替 代，但並不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的範圍。
權利要求
一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟1，構建一線性轉基因序列，該序列從5′至3′依次含有chicken β actin啟動子，CMV增強子，小鼠HO 1 cDNA編碼序列，終止信號rabbit β globin poly(A)序列；步驟2，應用顯微注射方法將構建的基因序列注入C57BL/6/DBA2(BDF1)小鼠受精卵；步驟3，將步驟2中的受精卵植入假孕鼠的輸卵管；步驟4，產生F0代轉基因小鼠，該小鼠基因組中整合有外源性HO 1表達序列；步驟5，將獲得的陽性轉基因小鼠與野生型BDF1小鼠雜交，獲得子代。
2.根據權利要求1所述的一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法，其特徵 在於，所述的構建一線性轉基因序列的具體方位為在小鼠基因組中擴增HO-I基因序列， 克隆入pCAGG載體，HO-I cDNA由chicken β -actin啟動子和CMV增強子啟動，Η0-1連接 rabbit β-globin poly (A)終止信號，質粒經Sail and DraI酶切，獲得線性轉基因序列。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種建立遲發性皮膚卟啉病轉基因小鼠模型的方法。本發明提供一種具有可穩定遺傳、能夠自發產生一系列符合臨床遲發性皮膚卟啉病生化、病理特徵的動物模型。迄今為止PCT的病因和發病機制並不完全清楚。尚未見有HO-1參與人或動物PCT發病機制的研究報導。本發明通過轉基因技術過表達HO-1，建立了一種能自發再現遲發性皮膚卟啉病症狀的小鼠模型，不僅為PCT的病因、發病機製作了理論上的補充，更為其治療提供更多有價值的新理念。
文檔編號C12N15/63GK101921795SQ201010253969
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月16日 優先權日2010年8月16日
發明者周凌雲, 彭亞會, 惠洋, 鄒朝霞, 馬寧, 高旭 申請人:哈爾濱醫科大學