一種新型生物固氮酶製劑(hse製劑)的製作方法

2023-07-05 23:28:41 1

專利名稱：：一種新型生物固氮酶製劑(hse製劑)的製作方法一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)是通過分離於土壤的有自主智慧財產權的微生物發酵製成的一種生物酶製劑。HSE製劑對氧、氨等穩定能催化空氣中的氮氣和水反應生成氨水。HSE製劑是一種極具挑戰意義的生物試劑，無論在實際應用還是理論研究都有非常的價值。一、所屬領域本發明屬於一種常溫常壓下，將空氣中的氮氣固定下來的生物固氮酶製劑(HSE製劑)。二
背景技術：
：生物固氮是生命科學中的重大基礎研究課題之一，國內外生物固氮研究已進入一個新階段，其特點是學科交叉，將基礎研究和應用前景相結合。為了對這一重大課題有所突破和模擬生物固氮應用，當前生物固氮研究正在分子和原子水平上展開1]。人們已探明傳統意義上的固氮酶對氧、氨等特別不穩定極易失活，生物固氮機理進一步的闡明和應用是人類夢寐以求的事情。1909年德國化學家HaberFritz發明了以Fe304為主要催化劑，在高溫高壓條件下，使氮氣和氫氣反應，合成氨的方法。Fe304-Al203-K20Cat.N2+3H2~34n232-2NH3z2500。C300atm3近百年來，這一被稱為20世紀最大的發明，為造福人類做出了偉大的貢獻，但其不僅是一個高投入，低產出的過程，而且也給人類賴以生存的環境帶來了相當的負面影響。儘管如此，人類還是不得而為之。因此，更加溫和的條件下，將化學性質非常不活潑的氮氣分子轉變成氨的反應研究是關係到環境和能源的重要工作。氮元素是核酸，胺基酸，蛋白質等的重要組成部分，是維持生命活動必要的元素，同時是營造現代文明生活必要的塑料，纖維，醫藥品，化工原料等不可缺少的重要元素之一，然而，大氣中豐富的氮氣是含有很大的，"N^N"三鍵結合能量(946KJ/MEL)，顯示出其非常難於反應的特性，因而，在常溫常壓條件下，使其轉變為氮的化合物並不是一件容易的事情。另一方面，固氮菌所產生的固氮酶在常溫常壓下，就能將空氣中的氮固定下來，從整個地球規模來看每年固氮的總量工業方法的固氮只佔到總量的不到20%，剩餘的80%大部分是微生物所為"。作為人類重要的能源煤碳、石油等越來越少的現實，已為世界所關注，而且世界人口的快速增長，對肥料的需求量也越來越多。對反應性非常低的氮氣，如果能藉助或者摸仿生物固氮酶，在常溫常壓下使其發生反應，將是一項具有重要意義的課題，因此、化學模擬生物固氮已經成為人類夢寐以求的事情。人們為了利用固氮微生物和揭示(認識)固氮酶的催化機理，對固氮微生物源進行了廣泛的研究。從厭氧微生物到好氧微生物，從共生微生物到自由微生物，已發現了30餘類2)(表l-l)表l-l固氮微生物種屬表2)屬代表性種絕對厭氧性菌一般厭氧性菌M^av，*，Mraseo-aW,微耗氧性菌好氧性菌/w^/ca承/jB^/Zwm/n/y承光合成細菌(厭氧性菌)光合成細菌(一般厭氧性菌)tableseeoriginaldocumentpage5在根瘤中固氮酶存在於類菌體中。而根瘤的特殊結構和生理環境，不但保護了固氮酶而且還提供了合適的固氮條件,其中豆血紅蛋白起著重要的輸氧作用。固氮酶對冷敏感，一般在0。C左右易失活。其中鐵蛋白對冷最敏感，但不同固氮生物之間存在差異。然而，所有的固氮酶在-2001:下都是穩定的，故純化的固氮酶均可保存在液氮中19)。在自然條件下，N2和質子是固氮酶的底物。固氮酶每還原一分子N2就要釋放一分子H2。當沒有任何其它底物時,固氮酶的全部電子都用於氫離子的還原而釋放氫。固氮酶的放氫也需要腺苷三磷酸(ATP)，這則區別於氫酶22)。除上述天然底物外，固氮酶是生物中分離出來的唯一能還原三鍵化合物的酶。其底物多數是具有三鍵或潛在三鍵的分子，如H-S-C三N、CH2-N^C-S，NOC=N，CHfCH-N-C，以及最近剛得到證明的氧硫化碳(COS)和C02也是固氮酶的底物，然而其類似物CS2則是抑制劑，在底物中弓l起人們廣泛應用的是乙炔，因乙炔還原被人們用來作為測定固氮酶活性的簡便而靈敏的方法。固氮酶的腺苷三磷酸和還原劑24)。固氮生物能將空氣中的氮還原成氨，是因其體內存在生物催化劑固氮酶。生物固氮也是一個耗能的反應,為了還原上述底物，則需要有ATP和還原劑(電子)。在完整固氮有機體中一般ATP與MgZ+是以l:l的複合物形式存在，大量實驗表明固氮酶每提供一個電子給N2需要水解2個分子的ATP(生成產物ADP和無機磷)，即ATP/et匕為2。因此,固氮酶催化N2還原的反應式可寫作N2+8FT+8e-+腹gATP—2NH3+H2+16MgAD+16Pi。方程式中ATP:腺苷三磷酸，是由呼吸、厭氧呼吸、發酵、或光合作用所提供的；ADP:腺苷二磷酸；Pi:無機磷酸鹽。固氮酶催化作用機理。固氮酶作用機理包括電子的傳遞、底物的絡合和還原兩部分。通過固氮酶系統的電子流，由鐵蛋白進入，而以被還原了的底物形式由鉬鐵蛋白放出。從固氮酶兩組分蛋白結構分析的結果推測，固氮酶系統內電子傳遞的順序是Fe蛋白—MoFe蛋白的P;;簇對—FeMo2co—底物MgATP的水解是與電子傳遞的第一步偶聯，而當底物與FeMo2co絡合時,電子和質子傳遞給底動力學研究也表明，鐵蛋白一次傳遞一個電子給鉬鐵蛋白,這種一個電子傳遞過程又包含著鐵蛋白和鉬鐵蛋白之間偶聯和解偶聯的循環過程,而解偶聯也是決定酶促反應速率的限制步驟26)。目前，世界h從事化學模擬生物固氮的研究大體上講有三個方面，一是模擬固氮酶的構造，通過化學方法合成類似的催化劑"；二是尋找新的固氮微生物或誘變出新的具有特別固氮能力的微生物；三是做基因修飾或克隆出超常規的固氮微生物或者植物。到目前為止，真正大規模能應用於產業中的還未浮出水面。不論那方面的研究，對固氮酶構造的深層認識是非常必要的。我們國家也早在1978年就有研究者分離和提純出了鐵鉬蛋白質結晶，為人類進一步認識固氮酶做出了很大的貢獻。
發明內容名稱一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)。HSE製劑能在常溫常壓下，將空氣中的氮氣固定下來生成氨水。新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)是通過分離於土壤的微生物發酵製成的一種生物酶製劑。功能HSE製劑對氧、氨等穩定能很容易地將空氣中的氮氣固定轉化為氨水，氨水平衡濃度可高達6mM以上；最適條件下，120小時內含酶菌體溼重0.1克約能生產0.23mM的氨。在生物技術、基礎科學研究上有廣泛的應用和研究前景。適用範圍空氣中的氮氣或純氮氣和水反應產氨的功能。內容如下1999年(當時在日本留學)，我從土壤中分離出了一株新型固氮微生物(泡"o6actersu/Y7am97Y力-^;)。主要利用該微生物發酵生產的生物製劑(HSE製劑)具有催化空氣中的氮氣和水反應生成氨水的功能。具體方法是，通過量取由HSE製劑離心分離得到的溼重沉澱物0.1g作為同氮酶劑，然後加10ml蒸餾水，在空氣中反應一定時間後進行離心分離，上清液則為生產的氨水，沉澱則為下一次用的酶製劑---，如此，循環往復進行氨水生產(附圖l，附圖2-4)。發現該生物製劑有產氨水的特別能力，且每次離心分離生產得到的氨水濃度隨時間的延長而增大'4)15)16)。氨水濃度測試通過液相色譜(HPLC)完成(附圖1)。通過和已知固氮能力較強的Z加to6a"erKz'/7^朋Jj7標準株的固氮酶的比較研究，發現在相同條件下，這一新型生物固氮酶製劑是標準株固氮酶固氮能力的至少5倍，而且可重複使用，不易失活，其每次合成氨的濃度幾乎沒有什麼變化(附圖2)。標準株固氮酶則很快失活，失去生產氨水能力。通過0.lg溼重沉澱酶劑(HSE制柳在各種濃度的(NH丄S04溶液中反應，並對反應後氨水的濃度進行測試，得知氨對這一新型固氮酶的固氮能力影響不明顯，對氨穩定。發現HSE製劑在水中氨的平衡濃度可高達6mM以上(附圖3)。相反，標準株化otofe"erw'"ci朋6W所產生的固氮酶在很短的時間內即失活，不能被重複利用(附圖2,4)16)。在一個月時間裡，O.l克溼重製劑，通過重複利用、失活修復能不斷地放出了氨水(附圖4)。7為了進一步證實HSE製劑的固氮酶活性，也進行了151^2的同位素生產氨水試驗。證實了HSE製劑的固氮性能。四、HSE製劑構成材料本ASE製劑是由酶蛋白、微生物、水、少量無機鹽等構成；主要酶Fe蛋白和MoFe蛋白等構成的固氮酶。構成法微生物和鉬酸鹽，磷酸鹽，鐵鹽，鎂鹽，蔗糖等發酵而成的生物製劑。五具體實施例方式將HSE製劑直接撒入含有空氣或氮氣的水中，HSE製劑作為催化劑就可以將氮氣固定、轉化成氨水。在溫度3(TC、pH7，有足夠的底物氮氣和水反應的條件下，120小時內菌體溼重0.1克約能生產0.23raM的氨。具體實施圖示例證，附圖1-4.如下附圖1是O.l克溼重菌體分別在10ml水中生產氨水及其分析方法；附圖2是0.1克溼重菌體的新型固氮微生物^^'to6a"er^//Y7ams7Y力i.7和標準株^"ote"erw'/7e7朋o^'生產的固氮酶在不同溫度下的固氮能力的比較結果；附圖3是不同濃度的(朋4)2304溶液對新型固氮微生物泡/tote"er犯/Y7aras打力-W7生產的固氮酶固氮能力的影響結果；附圖4是0.1克溼重菌體的新型固氮微生物^//7aras7Y力-";7和標準株力zoto6acterw'"eJa"必i在一個月內持續生產氨水的結果。參考資料1)西林仁昭"21世全擔》次世代o窒素固定法^開発"化學t工業，第53巻第2號131-135(2000)Howard,丄B.Biochemistry.1994,63:2798-2808.2)JohnPostgante"NitrogenFixation"TheInstituteofBiology，sStudiesinBiologyno.92(1978)3)EditedbyAchimMullerandWilliamE.Newton"NitrogenFixation"(Thechemical-biochemical-GeneticInterface)PlenumPress.NewYorkandLondon(1983)李佳格，徐繼.生物固氮作用機理.ChineseBulletinofBotany.l997，14:1-13.4)EditedbyJchatt.GeneralL.MdaCamaraPinaandR.L.Richards"NewTrendsinthechemistryofNitrogenFixation"Academicpress(AsubsidiaryofHarcourtBraceJovanovich.Publisher)丄ondon.NewYork.Toronto.Sydney.SanFrancisco.(1980)5)W.D.P.stewart，A.Haystead,H.AV.Pearson"NitrogenaseActivityinHeterocgstsofBlue-GreenAlgae"NATUREVOL.224-226(1969).6)JongsunKim，D.woo，andD.C.Rees."X-raycrystalstructureoftheNitrogenaseMolybdemum-IronProteinfromClostridiumpasteurianumat3.0-AResolution"Biochemistry327104-7115(1993)7)JongsumKimandD.C.Rees"CrystallographicStructureandfunctionalimplicationofthenitrogenasemolybdenum-IronproteinfromAzotobactervinelandii"NATURE,vol360553(1992).8)MM.Georgiadis,H.Komiya.P.Chakrabarti,D.Woo，丄J.KornasD.C.Ress."CrystallographicStructureoftheNitrogenaseIronproteinfromAzotobactervinelandii"ScienceVoL.2571653(1992).9)MichaelK.chan，JongsunKim，D.C.Rees"TheNitrogenaseFeMo-cofactorandP-Clusterpair:2.2AresolutionStructures"ScienceVol260792(1993).10)KarlFisher,MichaelJ.Dilworth，Chul陽HwanKim，andWilliamE.Newton"AzotobacterVinelandiiNitrogenasecontainingAlteredMoFeProteinWithsubstitutionsintheFeMo-CofectorEnvironment:EffectsonthecatalyzedReductionofAcetyleneandEthyere"Biochemisty392970-2779(2000).11)C.GSchipke，D.B.Goodin，D.E.McRee，andC.D.Stout"OxidizedandReducedAzotobacterVinelandiiFerredoxinIat1.4AResolutionconformationalchangeofsurfaceresidueswithoutsignificantchangeinthe[3Fe-4s]+/0Cluster"Biochemistry388228-8239(1999).12)JeannineM.chan，JasonChristiansen,DennisR.Dear，andLanceC.Seefeldt"SpectroscopicEvidenceforchangesintheRedoxStateoftheNinrogenaseP-ClusterduringTurnover"Biochemistry385779-5785(1999).13)今堀和友，上代淑人，西泰美，早石修，村地孝"日本生化學會編"生化學實驗講座，酵研究法(上下)化學同人(1985)14)WeiHao"NitrogenFixationandAmmoniaProductionbyNi加genase"ThesisofGraduateSchoolofToyamaUniversity(Japan)卜47(2000);BulletinofFacultyofEngineeringToyamaUniversity5381(2002)15)郝煒'坂野公紀'井上正美"窒素固定菌o7>*二7生産能c，l、t"平成12年度日本化學研究発表會第49回(2000).16)WeiHao"SyntheseandReactivitiesofsomeSpecificSNCompoundsandApplicationS-alkoxy-入6-SulfanenitrilesasAlkylatingReagents"DoctoralDissertationofGraduateSchoolofToyamaUniversity(Japan)1-111(2004).17)邊少敏.棕色固氮菌變株DJ中鉬鐵蛋白和HBP59蛋白的研究一純化、特性及晶體生長.中國科學院研究生院博士研究生學位論文.2005:1-4.18)Shah，V.K，etal.ProcNatlAcad.Sci.USA.1999,74:3249-3253.19)Evans,H.J.etc.BiologicalNitrogenFixation.ChapmanandHall.NewYork.1997:1-42.20)JohnPostgate.NitrogenFixation.TheinstituteofBiology'sStudiesinBiology.1978(92):45-50.21)李佳格，徐繼.生物固氮作用機理.ChineseBulletinofBotany.l997，14:卜13.22)PapasaniV.Subbaiah,PeterHorvathetal.RegulationoftheActivityandFattyAcidSpecificityofLecithin-CholesterolAcyltransferasebySphingomyelinandItsMetabolites,CeramideandCeramidePhosphate.Biochemistry.2006,45:5029-5038.23)尤崇杓.生物固氮.北京科學出版社.1987:71-80.24)Seefeldt，L.C.etal.Biochemistry.1995,34:5382-5389.25)Burgess,B.K.Molybdenum.Enzyme.Wiley-Interscience.1985:161-219.26)Ress,D.C.et.al.BiologicalChemistiy.1999,269:2876-28083.權利要求1.一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)是利用分離於土壤的有自主智慧財產權的微生物(HaitobactersufflavusTih-w37)、磷酸鹽、鐵鹽、鉬酸鹽等發酵產出的生物固氮酶製劑。其固氮方法是在一定溫度、pH值下，將HSE製劑直接撒入溶有空氣或氮氣的水中，就可以將難於固定的氮氣轉化成氨水。其特徵是利用微生物在培養基中發酵製成的HSE製劑，具有催化氮氣和水反應生成氨的功能。2.根據權利要求1所述的一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)，其特徵是利用微生物(泡itote"ar卯/Harasr勸等在培養基中發酵製成的HSE製劑，在溫度(MOt:，pH值是4.5-8.5條件下，催化氮氣和水反應生成氨的生物方法。3.根據權利要求2所述的一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)，其特徵是HSE製劑在合適條件下發揮固氮活性時，所生成的產物是本公司的資源。4.根據權利要求1所述的一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)，其特徵在於HSE製劑是微生物(泡i'totecter幼f/7awys77力-fr幼、磷酸鹽、鐵鹽、鉬酸鹽等發酵產出的由微生物、酶等組成的生物材料。5.根據權利要求1所述的一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)，其特徵在於HSE帶J劑和作為固氮生物酶劑使用是對等關係，HSE製劑其它用途的開發利用是本公司資源。全文摘要本發明涉及利用一種分離於土壤的有自主智慧財產權的微生物(HaitobactersufflavusTih-w37)等發酵產出的一種新型生物固氮酶製劑(HSE製劑)能固定空氣中的氮氣或氮氣為氨的生物試劑。其方法是在一定溫度、pH值下，將HSE製劑直接撒入溶有空氣或氮氣的水中，就可以將難於固定的氮氣轉化成氨水，氨水平衡濃度可高達6mM以上；最適條件下，120小時內菌體溼重0.1克約能生產0.23mM的氨。其特徵是利用微生物在培養基中發酵製成的HSE製劑，對氧、氨等穩定具有催化氮氣和水反應生成氨的功能。文檔編號C05F11/08GK101407436SQ200810033748公開日2009年4月15日申請日期2008年2月21日優先權日2008年2月21日發明者煒郝,郝陽帆申請人:上海居知園生物技術有限公司