優化的草魚α幹擾素編碼基因及其應用的製作方法

2023-07-06 06:01:31 2

專利名稱：優化的草魚α幹擾素編碼基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明 屬於基因工程領域，涉及一種優化的草魚α幹擾素編碼基因及其應用。
背景技術：
近年來，我國高密度、集約化水產養殖方式導致了各種病害頻繁發生，特別是 各種病毒性疾病，已經成為制約我國水產養殖產業可持續性發展的關鍵因素。長期以來 人們一直使用各種化學物品來進行魚類病毒性疾病的治療，但是此類藥物極易導致藥物 殘留超標，再加上國內外對食品健康的要求越來越高，使得水產養殖業步履維艱，於是 尋找新的安全無殘留的抗病毒漁藥已然是迫在眉睫。魚類是低等脊椎動物，非特異性免疫佔有重要地位。幹擾素系統作為一種高效 的非特異性免疫因子，在魚體的抗感染免疫中發揮重要的作用。目前國內外已有魚乾擾 素基因序列、胺基酸序列方面的報導，並實現了幹擾素基因在原核或真核表達系統中的 發酵表達，為魚類基因工程幹擾素的規模化生產和應用提供了依據。

發明內容
本發明的目的是提供一種優化的草魚α幹擾素編碼基因及其應用。本發明提供的優化的草魚α幹擾素編碼基因為序列表的序列2所示的DNA。含有序列表的序列2所示的DNA的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系 均屬於本發明的保護範圍。所述重組載體可為將序列表的序列2所示的DNA插入pBV220的多克隆位點 得到的重組質粒。所述重組載體優選為將序列表的序列2所示的DNA插入pBV220的 BamHI和EcoRI位點間得到的重組質粒。所述重組菌可為將序列表的序列2所示的DNA導入大腸桿菌DH5 α得到的重組 菌。所述重組菌優選為將所述重組載體導入大腸桿菌DH5 α得到的重組菌。所述重組 菌最優選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) DH5 α /pBV220_GCIFN α，已於2010年8月 23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北 京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC Νο.4111。本發明還保護一種製備α幹擾素的方法，是將所述重組菌，40 43°C誘導4 8小時(優選42°C誘導6小時)，然後破碎菌體，收集包涵體、洗滌包涵體、溶解包涵體 並將其復性，得到含有α幹擾素的溶液。所述方法還包括將所述含有α幹擾素的溶液進行蛋白純化的步驟。所述蛋白純化的方法如下將所述含有α幹擾素的溶液用醋酸調節ρΗ值為 5.5-9.5,採用 HiLoad 26/10 SP Sepharose High Performance 進行陽離子交換層析，用洗滌 緩衝液甲衝洗5個柱體積，然後用洗滌緩衝液乙洗脫1-10個柱床體積，收集280nm光照 下紫外吸收值大於200的洗脫液，得到的溶液即為α幹擾素溶液；所述洗滌緩衝液甲的 ρΗ 為 5.5-9.5，由 Tris · Cl、NaCl 和水組成，Tris · Cl 濃度為 0.1mol/L，NaCl 濃度為0-150mM ；所述洗滌緩衝液乙的pH為5.5-9.5，由Tris · Cl、NaCl和水組成，Tris ·Cl 濃度為 O.lmol/L，NaCl 濃度為 150_2000mM。所述蛋白純化的方法具體如下將含有草魚α幹擾素的溶液用醋酸調節pH值 為 6.5，採用 HiLoad 26/10 SP Sepharose High Performance (內徑 26mm，床高 100mm，GE LifeScience)進行陽離子交換層析；樣品以Iml/分鐘的速度加入層析柱中，用洗滌緩衝 液甲以5ml/分鐘的速度衝洗5個柱體積，用洗滌緩衝液乙以5ml/分鐘的速度洗脫3個柱 體積，收集280nm光照下紫外吸收值大於200的洗脫液，得到的溶液即為α幹擾素溶液 (可用0.22um濾膜進行過濾除菌)；所述洗滌緩衝液甲的pH為6.5，由Tris · Cl、NaCl 和水組成，Tris · Cl濃度為O.lmol/L，NaCl濃度為50mM ；所述洗滌緩衝液乙的pH為 6.5，由 Tris · Cl、NaCl 和水組成，Tris · Cl 濃度為 O.lmol/L，NaCl 濃度為 500mM。所述方法製備得到的α幹擾素溶液也屬於本發明的保護範圍。所述DNA、所述的重組載體、所述重組菌、所述表達盒或所述轉基因細胞系均 可用於製備α幹擾素。所述DNA、所述的重組載體、所述重組菌、所述表達盒或所述轉基因細胞系均 可用於製備病毒抑制劑。所述病毒可為傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)和/或草魚出 血病病毒(GCHV)。所述染性造血器官壞死病毒(IHNV)具體可為WRAC毒株。所述DNA、所述的重組載體、所述重組菌、所述表達盒或所述轉基因細胞系均 可用於製備如下(a)和/或(b)；(a)治療和/或預防魚病毒性疾病的製劑；(b)提高蝦存活率的製劑。所述魚病毒性疾病具體可為草魚出血病。所述蝦具體可為中國對蝦。本發明發現了一種優化的ChIFNa基因，所述基因的表達能力遠高於現有基 因，將該基因插入pBV220的多克隆位點得到了重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌 DH5a ,得到了重組菌。該重組菌通過簡單的誘導培養就可以製備出大量ChIFNa蛋 白。本發明提供的基因、重組質粒和重組菌對於α幹擾素的生產極具經濟價值，對於水 產養殖業也具有重大價值。


圖1為GcIFN- a -1基因(序列2所示DNA)禾Π GcIFN- a -2基因(序列3所示 DNA)的序列比對。圖2為草魚乾擾素基因(GcIFN- a -1和GcIFN- a -2)的PCR擴增結果的瓊 脂糖凝膠電泳圖；M為DNA分子量標準，Ll為陰性對照結果(以水為模板)，L2為 GcIFN- a -1基因擴增結果，L3為GcIFN- a -2基因擴增結果。圖3為SDS-PAGE檢測草魚乾擾素基因(GcIFN- a -1和GcIFN- a -2)在大腸杆
菌中表達產物結果；Ll對照菌誘導前，L2為對照菌誘導後，L3為重組工程菌誘導前， L4為重組工程菌誘導後，M為低分子量蛋白Marker。圖4為經過純化的草魚乾擾素的SDS-PAGE檢測結果；M為蛋白Marker，Ll為 GcIFN- α -1 溶液，L2 為 GcIFN- α -2 溶液。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說 明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。所有引物合成及測序工作均由北京博邁德科 技發展有限公司完成。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均 值。以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinicpolycytidylic acid，PolyI C)購自上海禾豐製藥
有限公司，貨號為國藥準字H20003599。草魚腎細胞系(GIK)中國典型培養物保藏 中心，編號 GDC081。傳染性造血器官壞死病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus， IHNV) (ATCC,編號 VR-1392，毒株名稱為 WRAC)。草魚出血病病毒(Grass Carp Hemorrhage Virus，GCHV)公眾可以從中國科學
院微生物研究所獲得；(參考文獻GCHV 837株，柯麗華，方勤，蔡宜權，一株新的草 魚出血病病毒分離物的特徵[J]。水生生物學報，1990，14(2) 153-159)。2*YT培養液由溶質和水組成，溶質及其濃度如下蛋白腖16g/L、酵母粉IOg/ L、氯化鈉5g/L。發酵培養基由溶質和水組成，溶質及其濃度如下蛋白腖5克/升、酵母粉5克 / 升、KH2P04 2 克 /升、K2HP044 克 / 升、Na2HPO4 · 12H20 7 克 / 升、(NH4)2SO4 1.2 克 / 升、NH4Cl 0.2 克 / 升、MnSO4 · 5H20 0.001 克 / 升、CoCl2 · 6H20 0.004 克 / 升、 Na2MoO4 · 2H200.002 克 / 升、ZnCl2 0.002 克 / 升、CuSO4 · 5H20 0.001 克 / 升、H3BO4 0.005 克 / 升、FeSO4 · 7H20 0.02 克 / 升、CaCl · 2H20 0.02 克 / 升、MgSO4 · 7H20 0.3克/升、消泡劑0.2克/升。補料培養基由溶質和水組成，溶質及其濃度如下甘油150mL/L、蛋白腖30g/ L、酵母粉 30g/L、MgSO4 · 7H20 5.5mg/L。PBS緩衝液pH為8.0，由溶質和水組成，溶質及其濃度如下NaCl 137mmol/ L, KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。2XLoading Buffer由溶質和水組成，溶質及其濃度如下IOOmM Tris-HCl(pH6.8)、4% SDS> 0.2%溴酚藍、20%甘油。變性緩衝液pH為8.5，由溶質和水組成，溶質及其濃度如下6mol/L鹽酸胍， 2mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris · Cl, 10mmol/LDTT。復性緩衝液pH為8.0，由溶質和水組成，溶質及其濃度如下0.5mol/L左旋精 氨酸(L-arg)，2mmol/L EDTA, 20% (體積百分含量)甘油，0.9mmol/L氧化型穀胱甘 肽(GSSG)，O.lmol/LTris · Cl。實施例1、優化的草魚α幹擾素基因和對照基因的人工合成一、優化的草魚α幹擾素基因(GcIFN-α -1基因)的人工合成根據密碼子的兼併性和對大腸桿菌對胺基酸密碼子的偏好型，參考Genebank中 已經發表的草魚α幹擾素基因序列DQ357216，設計含大腸桿菌喜好密碼子的草魚α幹 擾素的編碼基因，如序列表的序列2所示，該優化後基因既不改變草魚α幹擾素胺基酸 序列又為含大腸桿菌所喜好密碼子的基因序列。將序列表的序列2所示的DNA命名為 GcIFN- α -1基因(共480個核苷酸)。
實施例2、3和4中用作模板的GcIFN- α -1基因由上海生物工程有限公司合成。二、對照基因(GcIFN-α-2基因)的人工合成對照基因即Genebank中已經發表的草魚α幹擾素基因，如GENBANK ACCESSION NO.DQ357216 自 5，末端第 101-577 位核苷酸所示，在 GENBANK ACCESSION NO.DQ357216自5』末端第101位核苷酸前加上起始密碼子ATG，如序列 表的序列2所示。將序列表的序列3所示的DNA命名為GcIFN- α -2基因(共480個核
苷酸)。實施例2、3和4中用作模板的GcIFN- α -2基因由上海生物工程有限公司合成。三、GcIFN- α -1基因和GcIFN- α -2基因的序列比對GcIFN- α -1基因和GcIFN- α -2基因的序列比對見圖1，GcIFN- α -1基因和 GcIFN-α-2基因均編碼序列表的序列1所示的草魚(Ctenopharyngodonidellus)幹擾素。實施例2、重組質粒和重組菌的構建以及基因的表達一、含有GcIFNa-I基因的重組質粒和工程菌的構建1、將GcIFNa-I基因作為模板，用Fl和Rl組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。Fl 5，-CGCGAATTCATGTGCGAATGGCTG-3，(劃線部分為 EcoRI 酶切位
佔). /、、、/ Rl 5，-CGCCTCGAGTTAACGACGGTTAGC-3』 (劃線部分為 BamHI 酶切位
點)οPCR擴增產物的電泳圖如圖2的泳道L2所示。2、用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切PCR擴增產物，得到酶切產物。3、用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切載體pBV220(原核表達載體，購自 上海捷瑞生物工程有限公司，GV0302)，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到連接產物。5、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (購自北京康為世紀生物科技有限公司，產 品目錄號為CW0808)感受態，挑取單菌落進行菌落PCR和酶切鑑定。菌落PCR所用的 弓丨物為Fl和Rl組成的引物對，得到480bp左右DNA的菌落為陽性菌落。酶切鑑定所 用的酶為限制性內切酶BamHI和EcoRL得到480bp左右DNA的菌落為陽性菌落。菌落PCR和酶切鑑定均為陽性的菌落即為重組菌(工程菌)。重組菌的宿主菌 為大腸桿菌DH5 α，含有重組質粒GcIFN- α /pBV220。重組質粒GcIFN- α /pBV220為 在pBV220載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列2所示的GcIFNa-I 基因基因得到的重組質粒。將一株工程菌命名為DH5 a /pBV220_GCIFN α，該重組菌已於2010年8月23 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京 市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏 號為CGMCC No.4111。將工程菌DH5 a /pBV220_GCIFN α進行30°C，200轉/分(旋轉半徑為13mm) 振搖培養(至菌液OD600 = 1)，然後在42°C下誘導6小時。分別取誘導前後的培養液 1毫升於EP管，5000g離心10分鐘，棄上清，加入50uL PBS緩衝液和50uL 2 X Loading Buffer,煮沸10分鐘裂解菌體，然後上樣IOuL進行SDS-PAGE電泳檢測。電泳檢測結果如圖3所示(泳道L3為誘導前，泳道L4為誘導後)，誘導後收集的菌體在19kD左右 處出現一條蛋白條帶，與預期大小相符。回收該條帶的的蛋白質進行N端測序，N端5 個胺基酸分別為Cys-Glu-Trp-Leu-Gly，表明該蛋白確實為GcIFN-α蛋白，GcIFNa-I
基因在大腸桿菌中 正確表達。經薄層凝膠掃描儀確定工程菌DH5 a /pBV220_GCIFN α表達的幹擾素產物在全 菌蛋白中所佔比例大於65%。二、含有對照基因的重組質粒和工程菌的構建1、將GcIFNa-2基因作為模板，用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。F25，CGCGAATTCATGTGCGAATGGCTC (劃線部分為 EcoRI 酶切位點)R25，CGCCTCGAGTTATCGTCTGTTGGC 3，(劃線部分為 BamHI 酶切位點)。PCR擴增產物的電泳圖如圖2的泳道L3所示。步驟2至4同步驟一的2至4。5、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態，挑取單菌落進行菌落PCR和酶切 鑑定。菌落PCR所用的引物為F2和R2組成的引物對，得到480bp左右DNA的菌落為 陽性菌落。酶切鑑定所用的酶為限制性內切酶BamHI和EcoRL得到480bp左右DNA的 菌落為陽性菌落。菌落PCR和酶切鑑定均為陽性的菌落即為對照重組菌(對照菌)。對照菌的宿 主菌為大腸桿菌DH5 α，含有質粒pBV220。將對照重組菌進行30°C，200轉/分(旋轉半徑為13mm)振搖培養(至菌液 OD600 = 1),然後在42°C下誘導6小時。分別取誘導前後的培養液1毫升於EP管， 5000g離心10分鐘，棄上清，加入50uL PBS緩衝液和50uL 2 XLoading Buffer,煮沸10 分鐘裂解菌體，然後上樣IOuL進行SDS-PAGE電泳檢測。電泳檢測結果如圖3所示(泳 道Ll為誘導前，泳道L2為誘導後)，誘導後收集的菌體在19kD左右處出現一條蛋白條 帶，與預期大小相符。回收該條帶的的蛋白質進行N端測序，N端5個胺基酸分別為 Cys-Glu-Trp-Leu-Gly,表明該蛋白確實為GcIFN-α蛋白，GcIFNα-2基因在大腸桿菌 中正確表達。經薄層凝膠掃描儀確定對照菌表達的幹擾素產物在全菌蛋白中所佔比例約 40 %，遠遠低於步驟一所述重組菌中的幹擾素所佔菌體總蛋白的比例。三、GcIFNa-I基因和GcIFNa-2基因的表達分別發酵工程菌DH5 a -GcIFN" a /pBV220和對照菌，生產草魚α幹擾素，具 體步驟如下1、種子製備將工程菌(或對照菌)菌液接種於20ml LB液體培養基(含100 μ g/ml氨苄青黴 素)，接種量為(體積百分含量)，30°C、200rmp振蕩培養8-10h ；然後升溫至42 °C 誘導培養4h，劃平板挑取5-10個單菌於LB液體培養基(含100 μ g/ml氨苄青黴素)中 搖瓶培養(至OD600』.5)；取菌液，每750ul菌液加250ul50% (體積百分含量)甘油水 溶液，即為種子，-20°C保存備用。2、發酵種子液製備
將步驟1製備的種子接種於200ml 2*YT培養液中，接種量為0.05% (體積百分 含量)，30°C、220rpm培養10-12h，得到的菌液即為發酵種子液。3、發酵生 產草魚α幹擾素髮酵培養基高溫滅菌後，每升培養基加入lmLlOOmg/ml的氨苄青黴素，然後接 種步驟2的發酵種子液，接種量為5-10% (體積百分含量)，35°C通氣攪拌培養4小時，
4小時後降溫至30°C繼續培養2-3小時，然後升溫至42°C繼續培養6小時，得到發酵液； 培養過程中隨著菌株的生長，培養基中的糖(甘油)逐漸消耗，當碳源消耗完後菌體不再 生長，溶氧回升(上升30%左右)，開始流加補料培養基，流加速度由溶氧控制(設定 DO = 30%,當DO大於30%流加泵打開流加培養基，DO逐步下降，當DO下降到30% 以下流加泵關閉)，大約每小時流加26-35ml培養基；培養過程中用3M NaOH水溶液和 10%磷酸水溶液維持pH值7.2。4、草魚α幹擾素的純化取5L步驟3得到的發酵液，5000g離心10分鐘收集菌體，PBS緩衝液洗滌， 然後用PBS緩衝液重懸；超聲(Φ10探頭，超聲7秒間隔5秒)30分鐘，使菌體破壁， IOOOOg, 4°C離心10分鐘收集沉澱；PBS緩衝液洗滌沉澱(包涵體)，然後用變性緩衝液 溶解包涵體，lOOOOg、4°C離心10分鐘收集上清，即變性蛋白溶液；將變性蛋白溶液緩 慢加入復性緩衝液中，4°C靜置48小時，lOOOOg、4°C離心20分鐘收集上清，即為含有草 魚α幹擾素的溶液。將含有草魚α幹擾素的溶液用醋酸調節pH值為6.5，進行陽離子交換層析。 陽離子交換層析柱採用 HiLoad 26/10 SP Sepharose High Performance (內徑 26mm，床 高100mm，GELifeScience)；樣品以lml/分鐘的速度加入層析柱中，用洗滌緩衝液甲 (O.lmol/LTris · Cl，50mMNaCl, pH 6.5)以5ml/分鐘的速度衝洗5個柱床體積，用洗 滌緩衝液乙(O.lmol/LTris · Cl，500mMNaCl, pH 6.5)以5ml/分鐘的速度洗脫3個柱 床體積，用紫外檢測儀在波長為280nm進行檢測洗脫目的蛋白，收集紫外吸收值大於200 的洗脫液。將收集的洗脫液用濾膜(0.22um)進行過濾除菌，得到的溶液即為草魚α幹擾素 溶液。將發酵工程菌得到的草魚α幹擾素溶液命名為GcIFNa-I溶液(批次2008001)， 將發酵對照菌得到的草魚α幹擾素溶液命名為GcIFNa _2溶液(批次2008001)。將GcIFN α -1溶液和GcIFN α -2溶液進行SDS-PAGE電泳檢測。檢測結果如 圖4所示(泳道M為低分子量蛋白Marker，泳道Ll為GcIFN α -1溶液純化產物，泳道 L2為GcIFN α -2溶液純化產物)。結果表明，GcIFN α -1溶液和GcIFN α -2溶液均在 19kD附近處出現一條蛋白條帶，與預期結果相符。四、GcIFNa-I溶液和GcIFN α-2溶液的GcIFN-α蛋白含量比較待測溶液為步驟三得到的GcIFNa-I溶液(批次2008001)或GcIFNa -2溶液 (批次 2008001)。按50 1的體積比取BCA蛋白定量試劑盒(購自北京康為世紀生物科技有限 公司，貨號CW0014)中的溶液A和溶液B混合成工作液，並將BSA標準品梯度稀釋 至 500mg/ml，400mg/ml, 300mg/ml, 200mg/ml, lOOmg/ml, 50mg/ml, 25mg/ml,取
各個濃度的標準品或待測溶液20 μ 1，加200 μ 1的工作液混合，用保鮮膜封好37°C孵育30min,恢復至室溫後用酶標儀讀OD565吸光值。根據標準品濃度和吸光值繪製標準曲 線，再根據標準曲線計算待測蛋白樣品中的蛋白濃度。GcIFNa-I溶液(批次2008001)的蛋白濃度為3mg/ml，GcIFNa -2溶液(批 次2008001)的蛋白濃度為1.9mg/ml。結果表明，本發明提供的GcIFNa-I基因的表達 能力遠遠高於現有的GcIFNa -2基因。實施例3、GcIFN a -1基因和GcIFN a -2基因的表達一、含有GcIFNa-I基因的重組質粒和工程菌的構建1、將GcIFNa-I基因作為模板，用Fl和Rl組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。Fl 5，CGCGAATTCATGTGCGAATGGCTG 3，(劃線部分為 EcoRI 酶切位
點)；Rl 5，CGCCTCGAGTTAACGACGGTTAGC 3，(劃線部分為 BamHI 酶切位點)。2、用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切PCR擴增產物，得到酶切產物。3、用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切載體pBV220(原核表達載體，購自 上海捷瑞生物工程有限公司，GV0302)，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到連接產物。5、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (購自北京康為世紀生物科技有限公司，產 品目錄號為CW0808)感受態，挑取單菌落進行菌落PCR和酶切鑑定。菌落PCR所用的 引物為Fl和Rl組成的引物對，得到480bp左右DNA的菌落為陽性菌落。酶切鑑定所 用的酶為限制性內切酶BamHI和EcoRL得到480bp左右DNA的菌落為陽性菌落。菌落PCR和酶切鑑定均為陽性的菌落即為重組菌(工程菌)。重組菌的宿主菌 為大腸桿菌DH5 α，含有重組質粒GcIFN- α /pBV220。重組質粒GcIFN- α /pBV220為 在pBV220載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列2所示的GcIFNa-I 基因基因得到的重組質粒。二、含有對照基因的重組質粒和工程菌的構建1、將GcIFNa-2基因作為模板，用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增，得 到PCR擴增產物。F2 5，CGCGAATTCATGTGCGAATGGCTC (劃線部分為 EcoRI 酶切位點)；R2 5，CGCCTCGAGTTATCGTCTGTTGGC 3，(劃線部分為 BamHI 酶切位點)。步驟2至4同步驟一的2至4。5、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態，挑取單菌落進行菌落PCR和酶切 鑑定。菌落PCR所用的引物為F2和R2組成的引物對，得到480bp左右DNA的菌落為 陽性菌落。酶切鑑定所用的酶為限制性內切酶BamHI和EcoRI，得到480bp左右DNA的 菌落為陽性菌落。菌落PCR和酶切鑑定均為陽性的菌落即為重組菌(對照菌)。對照菌的宿主菌 為大腸桿菌DH5 α，含有質粒pBV220。三、GcIFNa-I基因和GcIFNa-2基因的表達
分別發酵工程菌和對照菌，生產草魚α幹擾素，具體步驟同實施例2的步驟
__ ο將發酵工程菌得到的草魚α幹擾素溶液命名為GcIFNa-I溶液(批次
2008002)，將發酵對照菌得到的草魚α幹擾素溶液命名為GcIFNα_2溶液(批次 2008002)。四、GcIFNa-I溶液和GcIFN α-2溶液的GcIFN-α蛋白含量比較待測溶液為步驟三得到的GcIFNa-I溶液(批次2008002)或GcIFNa -2溶液 (批次2008002)。檢測方法同實施例2的步驟四。GcIFN a -1 溶液(批次 2008002)的蛋白濃度為 2.8mg/ml，GcIFN a -2 溶液(批 次2008002)的蛋白濃度為1.75mg/ml。結果表明，本發明提供的GcIFNa-1基因的表達 能力遠遠高於現有的GcIFNa -2基因。實施例4、GcIFN a -1基因和GcIFN a -2基因的表達一、含有GcIFNa-I基因的重組質粒和工程菌的構建同實施例3的步驟一。菌落PCR和酶切鑑定均為陽性的菌落即為重組菌(工程菌)。重組菌的宿主菌 為大腸桿菌DH5 α，含有重組質粒GcIFN- a /pBV220。重組質粒GcIFN- a /pBV220為 在pBV220載體的BamHI和EcoRI酶切位點之間插入序列表的序列2所示的GcIFNa-I
基因基因得到的重組質粒。二、含有對照基因的重組質粒和工程菌的構建同實施例3的步驟二。菌落PCR和酶切鑑定均為陽性的菌落即為重組菌(對照菌)。對照菌的宿主菌 為大腸桿菌DH5 α，含有質粒pBV220。三、GcIFNa-I基因和GcIFNa-2基因的表達分別發酵工程菌和對照菌，生產草魚α幹擾素，具體步驟同實施例2的步驟
__ ο將發酵工程菌得到的草魚α幹擾素溶液命名為GcIFNa-I溶液(批次
2008003)，將發酵對照菌得到的草魚α幹擾素溶液命名為GcIFNa_2溶液(批次 2008003)。四、GcIFNa-I溶液和GcIFN a-2溶液的GcIFN-α蛋白含量比較待測溶液為步驟三得到的GcIFNa-I溶液(批次2008003)或GcIFNa -2溶液 (批次2008003)。檢測方法同實施例2的步驟四。GcIFN a -1 溶液(批次 2008003)的蛋白濃度為 3.5mg/ml，GcIFN a -2 溶液(批 次2008003)的蛋白濃度為2.25mg/ml。結果表明，本發明提供的GcIFNa-1基因的表達 能力遠遠高於現有的GcIFNa -2基因。實施例5、草魚α幹擾素的生物學活性測定分別將實施例2至實施例4製備的三個批次的GcIFN a -1溶液分別分成兩組第一組4°C-8°C保存，分別於6個月、12個月、18個月和24個月取樣檢測幹擾素活 性；第二組25°C保存，分別於1個月、3個月和6個月取樣檢測幹擾素活性；然後分 別進行α幹擾素的生物學活性測定。測定方法參照2005年《中華人民共和國藥典》三部附錄XC細胞活性抑制法，用草魚腎細胞系(GIK)(中國典型培養物保藏中心，編號 GDC081)-傳染性造血器官壞死病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV)系
統，採用CPE(細胞致病變效應)抑制為基礎的抑制微量測定法，以每毫升幹擾素檢品的 最高稀釋度仍能保護半數細胞(50% )免受病毒攻擊的稀釋度的倒數為幹擾素單位。幹擾素活性檢測方法具體如下1、細胞製備取生長良好的GIK細胞，消化後用含10% FBS的DMEM製備細胞懸液；對 細胞進行計數，調整細胞濃度為5 X IO5個/mL的懸液，然後加入到96孔細胞培養板上 (ΙΟΟμΙ/孔)，37°C、5% CO2培養8-10h使其成為單層細胞。2、加入幹擾素處理細胞將GcIFN α -1溶液用含10% FBS的DMEM預稀釋至終濃度為0.001mg/ml，作
為母液，再將母液進行4倍梯度稀釋，稀釋6個梯度，得到各種稀釋液。3、將步驟1的細胞培養板每孔中的培養液吸出；細胞培養板中的6個孔(3個陽 性對照孔，3個陰性對照孔)加入100 μ 1/孔的細胞培養液，其餘孔分別加入步驟2的稀 釋液(ΙΟΟμΙ/孔，每個梯度三個重複)；37°C、5% CO2培養12-15h。4、病毒感染取IHNV病毒，用無血清DMEM稀釋成終濃度為1000TCID5(1/ml的病毒稀釋 液；陽性對照孔每孔加入100 μ 1病毒稀釋液，陰性對照孔每孔加入100 μ 1無血清DMEM 培養液，其餘各孔每孔加入100 μ 1病毒稀釋液；培養24h。5、結晶紫染色棄細胞培養液，於每孔中加入結晶紫染色液100 μ 1，室溫放置30min。6、脫色棄染料，並用自來水或雙蒸水衝洗未著色染料，然後在每孔中加入脫色液 100 μ 1，室溫放置IOmin。7、利用酶標儀測定OD57tl值並記錄。8、數據處理以能抑制50%細胞病變的幹擾素含量定義為一個活性單位，運用Reed-Muench 法計算幹擾素效價，即能抑制50%細胞病變的稀釋倍數，結果見表1。表1運用Reed-Muench法計算幹擾素效價
權利要求
1.序列表的序列2所示的DNA。
2.含有序列表的序列2所示的DNA的重組載體、重組菌、表達盒或轉基因細胞系。
3.如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將序列表的序列2所 示的DNA插入pBV220的多克隆位點得到的重組質粒；所述重組載體優選為將序列表的 序列2所示的DNA插入pBV220的BamHI和EcoRI位點間得到的重組質粒。
4.如權利要求2所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌是將序列表的序列2所示 的DNA導入大腸桿菌DH5 α得到的重組菌；所述重組菌優選為將權利要求3所述重組 載體導入大腸桿菌DH5 α得到的重組菌；所述重組菌最優選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) DH5 α /pBV220-GCIFN α，它的保藏編號為 CGMCC Νο.4111。
5.—種製備α幹擾素的方法，是將權利要求2或4所述的重組菌，40 43°C誘導 4 8小時，優選42°C誘導6小時，然後破碎菌體，收集包涵體、洗滌包涵體、溶解包涵 體並將其復性，得到含有α幹擾素的溶液。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於所述方法還包括將所述含有α幹擾素的 溶液進行蛋白純化的步驟；所述蛋白純化的方法如下將所述含有α幹擾素的溶液用醋酸調節ρΗ值為 5.5-9.5,採用 HiLoad 26/10 SP Sepharose High Performance 進行陽離子交換層析，用洗滌 緩衝液甲衝洗5個柱體積，然後用洗滌緩衝液乙洗脫1-10個柱床體積，收集280nm光照 下紫外吸收值大於200的洗脫液，得到的溶液即為α幹擾素溶液；所述洗滌緩衝液甲的 ρΗ 為 5.5-9.5，由 Tris · Cl、NaCl 和水組成，Tris · Cl 濃度為 O.lmol/L，NaCl 濃度為 0-150mM ；所述洗滌緩衝液乙的ρΗ為5.5-9.5，由Tris · Cl、NaCl和水組成，Tris · Cl 濃度為 O.lmol/L，NaCl 濃度為 150_2000mM。
7.權利要求5或6所述方法製備得到的α幹擾素溶液。
8.權利要求1所述DNA或權利要求2至4中任一所述的重組載體、重組菌、表達盒 或轉基因細胞系在製備α幹擾素中的應用。
9.權利要求1所述DNA或權利要求2至4中任一所述的重組載體、重組菌、表達盒 或轉基因細胞系在製備病毒抑制劑中的應用；所述病毒為傳染性造血器官壞死病毒和/ 或草魚出血病病毒；所述染性造血器官壞死病毒具體為WRAC毒株。
10.權利要求1所述DNA或權利要求2至4中任一所述的重組載體、重組菌、表達盒 或轉基因細胞系在製備如下(a)和/或(b)中的應用；(a)治療和/或預防魚病毒性疾病的製劑；(b)提高蝦存活率的製劑；所述魚病毒性疾病具體為草魚出血病；所述蝦具體為中國對蝦。
全文摘要
本發明公開了一種優化的草魚α幹擾素編碼基因及其應用。本發明公開的優化的草魚α幹擾素編碼基因為序列表的序列2所示的DNA。所述基因的表達能力遠高於現有基因，將該基因插入pBV220的多克隆位點得到了重組質粒，將重組質粒導入大腸桿菌DH5α，得到了重組菌。該重組菌通過簡單的誘導培養就可以製備出大量ChIFNα蛋白。本發明提供的基因、重組質粒和重組菌對於α幹擾素的生產極具經濟價值，對於水產養殖業也具有重大價值。
文檔編號C12R1/19GK102021175SQ20101054930
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月18日 優先權日2010年11月18日
發明者劉文軍, 李晶, 楊利敏, 秦文安, 範文輝 申請人:中國科學院微生物研究所, 天津康萊森生物科技集團有限公司