T-bam(cd40l)技術在治療涉及平滑肌細胞的疾病中的治療應用的製作方法

2023-07-05 22:45:51

專利名稱：T-bam(cd40l)技術在治療涉及平滑肌細胞的疾病中的治療應用的製作方法
本申請享有1996年7月8日提出的美國專利申請系列號08/677,730的優先權，其內容在此被加入到本申請中以作參考。
本文所公開的發明是在衛生部(Department of Health and HumanServices)的NIH撥款號K08-AR-01904,RO1-CA55713,RO1-AI-28367,RO1-AI-14969,HL21006,HL42833,HL50629和RO1-AI-14969的政府支持下進行的。因此，美國政府在本發明中享有一定的權利。
在本申請中，各種參考文獻被歸總在括號中。這些出版物的全文公開在此被加入到本申請以作參考，從而更全面地描述本發明所涉及的現有技術狀況。這些參考文獻的全部文獻引用可在本文中找到或由實驗詳述部分之後的數字列出。
CD40是一種在各種細胞中表達的細胞表面分子，且與稱為CD40L的30-33kDa活化誘導的CD4+T細胞反受體相互作用。在T細胞-B細胞相互作用中，CD40L-CD40相互作用已被廣泛研究，並且其對於T細胞依賴的B細胞分化以及IgG,IgA和IgE的產生是必需的。CD40還在單核細胞、樹突細胞、上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞中表達。在體外，這些細胞中的CD40表達由細胞因子，最顯著的是IFN-γ正調節。令人感興趣的是，體內研究已證實在炎症位點，例如類風溼性關節炎滑膜或牛皮癬斑點有明顯正調節的CD40表達。使用抗CD40單克隆抗體或CD40L+細胞的體外研究證實CD40在單核細胞、樹突細胞、上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞中功能性表達。
例如，CD40L-CD40相互作用誘導單核細胞分泌促炎細胞因子IL-Iα、IL1β、IL-6和TNF-α以及樹突細胞分泌TNF-α。CD40L-CD40相互作用還促進單核細胞和樹突細胞分泌趨化因子IL-8和MIP1α。而且，CD40連接增強胸腺上皮細胞的IL-1介導的GM-CSF的產生。此外，CD40L介導的信號誘導單核細胞分泌IL-10和氧化氮並增加成纖維細胞IL-6的產生。在CD40L-CD40相互作用後成纖維細胞也增殖。最後，在CD40連接後，內皮細胞和成纖維細胞正調節胞間粘著因子。
已用各種藥物，包括降低膽固醇的藥物、β阻斷劑、鈣通道阻斷劑和抗凝血劑來治療血管病，如動脈粥樣硬化。目前已證實平滑肌細胞能表達CD40。這為通過抑制CD40與CD40配體(也稱為T-BAM、5c8Ag、gp39和TRAP)之間的相互作用來治療血管病提供了基礎。涉及平滑肌的其他疾病也通過抑制CD40-CD40L相互作用來治療。
本發明提供抑制細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD配體活化的方法，包括將細胞與能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質接觸，其中該物質以有效抑制該細胞活化的量存在。
本發明提供在宿主中抑制細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD配體活化的方法，包括給予該宿主能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質，其中該物質以在該宿主中有效抑制細胞活化的量存在。
本發明提供在宿主中治療平滑肌細胞依賴性疾病的方法，包括包括給予該宿主能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質，其中該物質以在該宿主中有效抑制細胞活化的量存在，從而治療平滑肌細胞依賴性疾病。


圖1A靜息人主動脈平滑肌細胞的FACS分析。虛線代表同型對照單克隆抗體；短劃線代表抗CD54單克隆抗體；實線代表抗CD40單克隆抗體。該圖表明平滑肌細胞不組成性地表達CD40。
圖1B在存在IFN-γ(1000U/cc)下，在細胞培養物中72小時後的人主動脈平滑肌細胞的FACS分析。該圖表明對IFN-γ產生應答的平滑肌細胞CD40表達的正調節。
圖1C在存在IL-1α(1ng/cc)下，在細胞培養物中72小時後的人主動脈平滑肌細胞的FACS分析。未觀察到平滑肌細胞CD40表達的正調節。
圖1D在細胞培養物中72小時後，在存在TNF-α(200U/cc)下，人主動脈平滑肌細胞的FACS分析。未觀察到平滑肌細胞CD40表達的正調節。
圖2A-Y含殘基Gly116-Leu261(在Brookhaven蛋白質資料庫格式中)(SEQ ID NO:1)的人CD40L的可溶性細胞外片段的晶體結構的原子坐標。
圖3A-3B在與移植相關的動脈粥樣硬化損傷部位的平滑肌細胞和巨噬細胞中CD40原位表達。顯示的是二色免疫組織化學研究的顯微照片，表明在患有與移植相關的動脈粥樣硬化的病人中的圖3A中的平滑肌細胞(紅色染色)以及圖3B中的巨噬細胞(紅色染色)中的CD40表達(褐色染色)。
圖4A-4B用蘇木精和伊紅(圖4A)以及抗CD40單克隆抗體(圖4B)染色的來自患有特發性心肌炎的病人的正常冠狀動脈。圖4A注意不存在內膜加厚或炎症感染。圖4B:CD40的表達局限於貼附在血管腔的內皮細胞。對同型特異性對照單克隆抗體沒有反應性(未顯示)。(圖4A，圖4B×25)。
圖5A-5B用蘇木精和伊紅(圖5A)以及抗CD40單克隆抗體(圖5B)染色的患有局部缺血心肌病的病人的冠狀動脈中的纖維動脈粥樣硬化斑點。圖5A覆蓋在部分鈣化的動脈粥樣硬化核心的纖維帽含有許多炎症細胞(箭頭)。圖5B纖維帽中的大多數炎症細胞為強CD40+(箭頭)。相鄰的內膜平滑肌細胞和內皮細胞也為CD40+(圖5A，圖5B×25)。
圖6A-6C用蘇木精和伊紅(圖6A)以及抗CD40單克隆抗體(圖6B,6C)染色的患有與移植相關的冠狀動脈疾病(TCAD)的病人中的在泡沫細胞中富集的早期內膜損傷。圖6A內膜損傷包含許多泡沫細胞，巨噬細胞和平滑肌細胞。圖6B在TCAD的早期損傷中，CD40在許多內膜細胞中強烈表達。圖6C特別是，泡沫細胞顯示大量的對CD40的染色。(圖6A×25，圖6B×50，圖6C×400)。
圖7A-7D在用抗CD40L單克隆抗體(圖7A)，對照單克隆抗體(圖7B)，抗CD4單克隆抗體(圖7C)和抗CD8單克隆抗體(圖7D)標記的天然CA中的內膜損傷的纖維帽中存在的炎症感染。圖7A僅局限於淋巴細胞的特徵性胞質和細胞表面CD40L的免疫反應性。圖7B用無關的同型配對對照單克隆抗體染色的相同損傷未顯示免疫染色。圖7C事實上天然CA損傷中的所有淋巴細胞(以及許多巨噬細胞和泡沫細胞)是CD4+，表明CD40L+淋巴細胞為CD4+T細胞。圖7D在天然CA的內膜斑點中，CD8+T細胞很少。(圖7A,7B×1000，圖7C,7D×400)。
圖8A-8C在用抗CD40L單克隆抗體(圖8A)，對照單克隆抗體(圖8B)，抗CD4單克隆抗體(圖8C)標記的TCAD中的深處內膜淋巴聚集物。圖8A在內膜中以及遠離內皮表面的淋巴聚集物中發現了TCAD中的大多數CD40L+細胞(箭頭)。圖8B無關同型配對對照單克隆抗體表明在該內膜淋巴聚集物中沒有細胞染色。圖8C如上相同的內膜淋巴聚集物差不多隻包含CD4+T細胞，表明在這些損傷中CD40L在CD4+T細胞中表達(圖8A-8C×400)。
圖9A-9B用抗CD8(圖9A)和抗CD40L(圖9B)單克隆抗體染色的TCAD中的內皮炎病灶。圖9A與對內皮炎為特徵性的TCAD中的腔內皮細胞相連的CD8+T細胞。大多數CD8+T細胞存在於內皮炎的病灶中，而它們很少出現在遠離內皮表面的內膜淋巴聚集物中。圖9B內皮炎病灶中的炎症細胞為CD40L+。類似地，在內皮細胞中未檢測到CD40L的表達(圖9A-9B×400)。
圖10A-10B圖10A用抗CD40單克隆抗體(褐色)和作為巨噬細胞標記物的抗CD68單克隆抗體(紅色)對天然CA的內膜損傷的雙免疫標記。細胞的中心群(箭頭)顯示出強的對CD40和CD68的染色。圖10B用抗CD40單克隆抗體(褐色)和抗平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(紅色)對TCAD的雙免疫標記證實了CD40+平滑肌細胞(箭頭)。CD40反應性局限於內膜平滑肌細胞(箭頭)，而內側的肌原細胞為CD40-。(圖10A-B×400)。
圖11A-11D天然CA的系列區說明了內膜新血管形成，並被用抗CD34(圖11A)，抗CD40(圖11B)，抗ICAM-1(圖11C)和抗VCAM-1(圖11D)單克隆抗體染色。圖11A用CD34染色突出的內膜新血管的內皮細胞。圖11B內膜新血管內皮細胞強烈表達CD40。相鄰的炎症細胞也可標記CD40。圖11C,11D新血管形成的病灶也顯示強烈的對ICAM-1(圖11C)和VCAM-1(圖11D)的內皮反應性(圖11A-11D×400)。
圖12A-12C在用抗CD40單克隆抗體(褐色)和粘著分子(紅色)抗ICAM-1單克隆抗體(圖12A)，抗VCAM-1單克隆抗體(圖12B)和無關對照單克隆抗體(圖12C)對天然CA的活化刺激的內膜損傷的雙免疫標記。圖12A事實上所有的CD40+(褐色)細胞，主要是巨噬細胞(長箭頭)，和內膜肌原細胞(短箭頭)對ICAM-1(紅色)強烈反應。圖12B許多CD40+(褐色)炎症細胞和內膜肌原細胞(箭頭)也對VCAM-1(紅色)反應。圖12C對代替抗ICAM-1和抗VCAM-1單克隆抗體(紅色)的CD40(褐色)和無關同型配對對照抗體雙標記的相同的內膜損傷。僅分辨出了褐色染色而沒有紅色染色，表明不存在順序應用抗CD40和抗ICAM或抗VCAM單克隆抗體的檢測技術的幹擾(參見材料和方法)。(圖12A-C×400)。
圖13用抗p65單克隆抗體標記活化的NF-kB(褐色)和CD40(紅色)對天然CA的內膜損傷的雙免疫標記。在CD40+細胞的核中僅僅分辨出活化的NF-kB(箭頭)，其中大多數為巨噬細胞(×400)。
本發明提供一種抑制細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD40配體活化的方法，包括將細胞與能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質接觸，其中該物質以有效抑制該細胞活化的量存在。在本發明的一個具體實施方案中，該物質能抑制CD40配體與CD40之間的任何相互作用。「CD40配體與細胞表面的CD之間的相互作用」指CD40-CD40配體一個或多個功能或結構方面的相互作用。因此，在一個具體實施方案中，抑制相互作用的物質可競爭性地與CD40配體結合以此方式來阻斷或減少CD40配體與細胞CD40的結合。在另一個具體實施方案中，抑制相互作用的物質可以不抑制CD40配體與細胞CD40結合的方式與CD40或CD40配體結合，但它影響對CD40連接的細胞應答，例如通過改變細胞CD40或CD40-物質複合物的轉化率，或通過改變CD40與CD40配體的結合動力學，或通過改變在對CD40連接的應答中細胞活化的比例或程度。
在具體的實施方案中，具有CD40的平滑肌細胞為膀胱平滑肌細胞、血管平滑肌細胞、支氣管平滑肌細胞、主動脈平滑肌細胞、冠狀動脈平滑肌細胞、肺平滑肌細胞或胃腸道平滑肌細胞。在更具體的實施方案中，胃腸道平滑肌細胞為食管、胃或腸道平滑肌細胞，包括小腸或大腸(腸)平滑肌細胞。
在本發明的一個具體實施方案中，該物質抑制CD40配體與細胞表面的CD40的結合。
在本發明的一個具體實施方案中，該物質為蛋白質。
在本發明的另一個具體實施方案中，該物質為非蛋白質。如本文所採用的，術語非蛋白質包括任何或所有包含除簡單或共軛多肽鏈外的部分的化合物或物質。這包括例如具有非肽鍵的胺基酸的成分；非蛋白胺基酸，如β、γ或δ胺基酸、D構型胺基酸或其他非蛋白胺基酸，包括高半胱氨酸、高絲氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、γ-氨基丁酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸或β-氰基丙氨酸；單糖、多糖或碳水化合物部分；脂肪酸或脂質部分；核苷酸部分、無機物部分；或其他非蛋白分子。
在本發明的另一個實施方案中，該物質為肽模擬化合物。肽模擬化合物可至少部分為非天然的。肽模擬化合物可為小分子模擬物。由於為模擬物，該化合物可具有提高的穩定性、功效、效價和生物利用度。而且，該化合物可具有降低的毒性。肽模擬化合物可具有改善的腸黏膜通透性。可合成製備該化合物。本發明的化合物可包括L-,D-或非天然胺基酸，α、α-雙取代的胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸(丙氨酸的等電類似物)。該化合物的肽骨架可具有至少一個被PSI-[CH=CH]替代的鍵(Kempf等(1991)國際肽和蛋白質研究雜誌38,237-241)。該化合物可進一步包括三氟酪氨酸、對氯苯丙氨酸、對溴苯丙氨酸、多-L-炔丙基甘氨酸、多-D,L-烯丙基甘氨酸或多-L-烯丙基甘氨酸。
在本發明的另一個具體實施方案中，具有抑制CD40配體與細胞表面的CD相互作用的生物活性的肽模擬化合物可具有一個鍵，肽骨架或被適宜模擬物替代的胺基酸部分。可為適宜胺基酸模擬物的非天然胺基酸的實例包括β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸、L-γ氨基丁酸、L-α氨基異丁酸、L-ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-穀氨酸、半胱氨酸(乙醯氨基甲基)、N-∈-Boc-N-α-CBZ-L-賴氨酸、N-∈-Boc-N-α-Fmoc-L-賴氨酸、L-甲硫氨酸碸、L-正亮氨酸、L-正頡氨酸、N-α-Boc-N-δCBZ-L-鳥氨酸、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-鳥氨酸、Boc-對硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羥基脯氨酸、Boc-L-硫代脯氨酸(Blondelle,S.E.等(1994)抗微生物劑和化學療法38,2280-2286；Pinilla,C.等(1995)肽科學37,221-240)。
在一個具體的實施方案中，蛋白質包括能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的的抗體或其一部分。抗體為單克隆或多克隆抗體。在一個更具體的實施方案中，單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC登記號為HB10916)特異性與其結合的表位結合。該單克隆抗體的一個實例為單克隆抗體5c8(ATCC登記號為HB10916)。在另一個具體實施方案中，抗體特異性地與CD40結合。抗CD40抗體的一個實例為單克隆小鼠抗人CD40，其可從Genzyme CustourerService(product 80-3702-01,Cambridge,MA)獲得。在另一個具體實施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體，靈長類源化抗體，人源化抗體或包含來自第一個人的CDR區的抗體和來自第二個人的支架的抗體。
「嵌合」，「靈長類源化」和「人源化」抗體的含義以及製備它們的方法對於本領域技術人員來講是熟知的。參見例如1990年7月26公開的PCT國際申請號WO 90/07861(Queen等)；和Queen等Proc.Natl Acad.Sci.USA(1989)86:10029。製備靈長類源化抗體的方法公開在例如對應於國際申請號PCT/US92/06194的PCT國際申請公開號WO/02108(Idec藥物)；和Newman等，生物技術(1992)10:1455-1460中，它們被引入本申請以作參考。
通常，人源化抗體為包含一個或多個功能性地與人框架部分相連的非人抗體的互補性決定區(CDRs)的抗體。可任選存在其他與非人抗體相關的其它部分。通常，至少一個重鏈或一個輕鏈包含非人CDRs。通常，非人互補性決定區為小鼠互補性決定區。一般來講，靈長類源化抗體為包含一個或多個功能性地與非人靈長類的框架區部分連接的除非人靈長類外的種類的抗體的互補性決定區(CDRs)的抗體。可任選存在與其中CDR從中產生的種類相關的其它部分。通常，至少一個重鏈或一個輕鏈包含不是非人靈長類種類的互補性決定區。典型地，互補性決定區為人互補性決定區。一般，嵌合抗體為其輕鏈和/或重鏈含來自不同種類的區域的抗體。例如，一個種類的一個或多個可變(V)區部分可與另一個種類的一個或多個恆定(C)區部分相連。雖然可採用其他的哺乳動物種類，但通常嵌合抗體包含與人恆定區部分相連的小鼠的可變區部分。
通過雜交瘤細胞產生單克隆抗體，其中根據用於專利程序目的的國際承認的微生物保藏的布達佩斯條約的條款，該雜交瘤細胞於1991年11月14日保藏在美國典型培養物中心(ATCC),12301 ParklawnDrive Rockville，馬裡蘭州20852，美國。該雜交瘤的ATCC登記號為10916。
在一個具體的實施方案中，抗體的某部分包含輕鏈或重鏈的互補決定區或可變區。在另一個具體實施方案中，抗體的該部分含互補決定區或可變區。在另一個具體實施方案中，抗體的該部分包含Fab或單鏈抗體。單鏈抗體由在單蛋白鏈中通過蛋白間隔區相連的可變區組成。
在另一個具體實施方案中，該蛋白包含能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的CD40配體，其一部分或其變異體的可溶性細胞外區；或能抑制細胞中CD40配體與CD40相互作用的CD40，其一部分或其變異體的可溶性細胞外區。在一個具體的實施方案中，CD40配體或CD40的可溶性細胞外區為單體。在另一個具體實施方案中，CD40的可溶性細胞外區為寡聚體。
變異體可在胺基酸序列上或以不涉及序列或兩種序列的方式不同於天然存在的CD40或CD40配體。當天然存在的CD40或CD40配體中的一個或多個胺基酸被不同的天然胺基酸，胺基酸衍生物或非天然胺基酸置換時產生胺基酸序列的變異體。特別優選的變異體包括天然存在的CD40或CD40配體，或天然存在的CD40或CD40配體的生物活性片段，其序列因一個或多個保守胺基酸取代與野生型序列不同它們通常對蛋白質或肽的二級結構和疏水性具有最小的影響。變異體還可具有因一個或多個非保守胺基酸的取代，缺失或插入而不同的序列，其不影響CD40或CD40配體生物活性。保守取代通常包括用具有類似特性的胺基酸取代另一個胺基酸，例如下面組中的取代纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸；天冬氨酸，穀氨酸；天冬醯胺，谷胺醯胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸和苯丙氨酸，酪氨酸。非極性胺基酸(疏水性)胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電(鹼性)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電(酸性)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。
可從表1中看到其他保守取代，且其它的見Dayhoff在蛋白質序列和結構圖譜中(1988)描述。
表1保守胺基酸取代
本發明的其他變異體為具有增加肽穩定性的修飾的那些。該變異體在肽序列中可包含，例如一個或多個非肽鍵(它代替肽鍵)。還包括包含非天然存在的L-胺基酸殘基的變異體，例如D-胺基酸或非天然存在的或合成的胺基酸，例如β或γ胺基酸和環狀變異體。用D-胺基酸代替L-胺基酸摻入到多肽中可增加其對蛋白酶的耐受。參見如美國專利5,219,990。
本發明肽也可通過各種保守或非保守的變化，如插入，缺失和取代來修飾，其中這些變化可在它們的應用中提供一些優點。
在其他具體實施方案中，具有保守性較少的胺基酸取代的變異體也可通過如電荷，構型和其他生物特性的改變來產生所需的衍生物。這些取代包括如親水性殘基取代疏水性殘基，半胱氨酸或脯氨酸取代其他殘基，具有小側鏈的殘基取代具有大側鏈的殘基或帶淨正電的殘基取代帶淨負電的殘基。當取代結果不能被肯定地預測時，根據本文公開的方法可容易地分析該衍生物以確定所需特性的存在與否。
本發明範圍中的變異體包括具有與CD40的細胞外區或CD40配體的細胞外區具有至少80％同源性的胺基酸序列的蛋白質和肽。較優選，序列同源性為至少90％，或至少95％。
正如可代替支架的組成一樣，也可取代功能性基團，其中該功能性基團可用類似特徵的基團修飾支架。這些取代開始是保守的，即該替代基團將具有與原來基團差不多的相同大小，形狀，疏水性和電荷。非序列修飾可包括例如對天然存在的CD40或CD40配體的某部分的體內或體外化學修飾，以及乙醯化，甲基化，磷醯化，羧化或糖基化修飾。
在另一個具體實施方案中，包括CD40配體和CD40細胞外區的蛋白質被化學修飾所修飾，其中活性被保留。例如，蛋白質可被醯胺化，硫酸化，單或多滷代，烷基化，羧化或磷酸化。蛋白質也可被如乙醯基，法呢基部分，或飽和，單不飽和或多不飽和脂肪酸單和多醯化。脂肪酸也可被單或多氟化。本發明還包括蛋白質的甲硫氨酸類似物，例如甲硫氨酸碸和甲硫氨酸亞碸類似物。本發明還包括蛋白質的鹽，如銨鹽，包括烷基或芳基銨鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硫代硫酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、苯甲酸鹽、磺酸鹽、硫代磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽和苯磺酸鹽。
可溶性單體CD40-L蛋白可包括CD40-L細胞外區的全部或一部分。CD40-L的細胞外區包含與CD40結合的區域。因此，可溶性的CD40-L可抑制CD40L與含有CD40的細胞的相互作用。本發明預測sCD40-L可構成含與CD40結合的區域的CD40-L或片段或衍生物的完整細胞外區。
可溶性CD40蛋白(sCD40)包含CD40的細胞外區。sCD40抑制CD40L與含有CD40細胞的相互作用。sCD40可為單體或寡聚體形式。
在本發明的另一個具體實施方案中，包含CD40的可溶性細胞外區或其一部分的蛋白進一步包含與CD40的細胞外區或其一部分融合的Fc區。在一個具體的實施方案中，Fc區能與蛋白A或蛋白G結合。在另一個具體實施方案中，Fc區包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。
可使用常規的酶方法，通過切斷和連接來自所需序列的片段來製備可溶性CD40/Fc融合蛋白。融合蛋白適宜的Fc區為可與蛋白A或蛋白G結合，或能被可用於純化或檢測包含Fc區的融合蛋白中的抗體識別的Fc區。例如，Fc區可包括人IgG1或鼠IgG1的Fc區。本發明還提供編碼CD40/Fc融合蛋白的核酸分子。
已熟知通過重組方法產生可溶形式的膜分子的方法，其中缺失編碼跨膜和胞質區的序列。通常參見Hammonds等，美國專利號5,057,417。此外，已熟知製備sCD40和CD40/Fc融合蛋白的方法。參見如PCT國際申請No.WO93/08207；Fanslow等「可溶形式的CD40抑制人B細胞的生物應答」，免疫學雜誌，149卷，pp655-60(1922年7月)。
在本發明的一個具體實施方案中，該物質通過篩選方法來選擇。
在一個具體實施方案中，該物質用篩選方法選擇，它包括分離細胞樣品；在允許含有CD40的細胞活化的條件下培養樣品；將樣品與有效活化含有CD40細胞的表達被由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白，或與有效活化含有CD40細胞被具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白接觸；如果物質能抑制含有CD40細胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細胞活化的物質接觸；並測定在存在該物質時，表達被由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別蛋白的細胞，或被具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白是否活化含有CD40細胞。細胞樣品可從不同組織中分離，包括培養物中的細胞系或從動物中分離的細胞，如來自固體組織的分散細胞、來自骨髓活體的細胞，或從如血液或淋巴液的體液中分離的細胞。
在另一個具體實施方案中，根據能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的CD40配體的可溶性細胞外區或其一部分的三維結構來選擇物質(分子)。該物質可從已知物質庫中選擇，或根據三維結構從已知物質修飾而來，或根據三維結構從頭設計或合成。在一個具體實施方案中，根據CD40配體的可溶性細胞外區或其一部分與先導抑制劑的複合物的三維結構，通過先導抑制劑的結構最優化設計該物質(分子)。先導抑制劑為已被鑑定的分子，其中當與CD40配體接觸時，它與CD40配體，CD40或其一部分的可溶性細胞外區結合或複合，從而降低複合或結合的CD40配體或CD40配體的一部分活化含有CD40細胞的能力。在另一個具體實施方案中，先導抑制劑可通過與CD40配體或CD40的細胞外區，或在三級複合物中與CD40配體和CD40的一部分相互作用，從中降低複合的CD40配體-CD40活化含有CD40細胞的能力。在本發明的方法中，CD40配體可為可溶性的或與細胞結合，如活化的T細胞，並可為足夠長度的天然CD40配體或其一部分。可以不同方式測定降低的活化含有CD40細胞的能力。一種可測定它的方法為通過與在類似條件下，不存在抑制劑時，用相似量的CD40配體處理細胞比較，顯示在存在抑制劑時，CD40配體產生的含有CD40細胞的活化程度降低。活化含有CD40細胞的能力降低也可通過與未結合的CD40配體比較，在類似條件下產生類似程度的含有CD40細胞的活化所需的更高濃度的抑制劑-CD40配體複合物來說明。極端地，在允許通過未結合的CD40配體或其指定部分活化這些細胞的濃度和條件下，與抑制劑接觸的CD40配體可能不能活化含有CD40的細胞。
可通過計算機篩選法，使用包含殘基Gly116-Leu261的人CD40L(sCD40L(116-261))的細胞外區的可溶性片段晶體結構來選擇物質(分子)。
已通過分子置換法，以2A的解析度確定了篩選法中使用的晶體結構。簡單地說，首先製備可溶性形式的包含胺基酸殘基Gly116至C末端殘基Leu 261的人CD40配體的細胞外區的可溶性片段，接著純化和結晶。晶體被用來收集衍射數據。用XPLOR程序包和QUANTA(分子模擬公司)軟體進行分子置換和精製。尤其是，使用鼠CD40L模型，用QUANTA蛋白質同源性模型軟體構建人sCD40L的三維模型。該模型被用作用於晶體學分析計算的探針並使用XPLOR精製。確定sCD40L的晶體結構的方法更詳細地描述在Karpusas等「人CD40配體的細胞外區的2晶體結構」，結構(1995,10)3(10):1031-1039。sCD40L(116-261)的原子坐標提供在圖2A-Y中。用於選擇物質的篩選方法包括如下所述的計算機藥物設計和迭代結構最優化。
物質可為使用計算機藥物設計選擇的抑制劑。使用該方法，sCD40L的晶體結構坐標被用作如DOCK的電腦程式的輸入數據，它輸出一系列預期與CD40L結合的分子結構。該電腦程式的使用已為熟知。參見如Kuntz「基於結構的用於藥物設計和發現的策略」，科學，257卷，p1078(1992)。接著可通過對CD40L結合的生化分析篩選分子結構表。可使用熟知的競爭類型的生化分析。參見如Baiorath等「對於受體-配體相互作用至關重要的CD40和其配體的殘基的鑑定」生物化學，34,p1833(1995)。因此，被發現與CD40L結合的結構可用作本發明的物質。由結構最優化的相互作用循環所證實，該物質也可為被修飾或設計的分子。使用該方法，使用上述電腦程式和其他方法找到的CD40L的小分子抑制劑可與sCD40L一起共結晶，且該複合物的晶體結構可通過分子置換解決。通過分子置換揭示的信息可通過探明分子如何與CD40L相互作用而被用來最優化抑制劑的結構。該分子可被修飾以改善其理化性質，包括對CD40L的特異性和親和性。
在本發明的一個具體實施方案中，物質為小分子。如本文所採用的，小分子為具有20Da-1×106Da，優選50Da-2KDa分子量的化合物。
本發明還提供一種在宿主中，抑制細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD40配體活化的方法，包括對宿主施用能抑制CD40配體與細胞表面的CD40的相互作用的物質，其中該物質以有效抑制宿主中細胞活化的量存在。
在具體的實施方案中，含有CD40的平滑肌細胞為膀胱平滑肌細胞、血管平滑肌細胞、支氣管平滑肌細胞、主動脈平滑肌細胞、冠狀動脈平滑肌細胞、肺平滑肌細胞或胃腸道平滑肌細胞。在更具體的實施方案中，胃腸道平滑肌細胞為食管、胃或腸道平滑肌細胞，包括小腸或大腸(腸)平滑肌細胞。
在本發明的一個具體實施方案中，該物質抑制CD40配體與細胞上CD40的結合。
在本發明的一個具體實施方案中，該物質為蛋白質。在本發明的另一個具體實施方案中，該物質為非蛋白質。
在一個具體的實施方案中，蛋白質包括能抑制CD40配體與細胞上面的CD40相互作用的抗體或其一部分。抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。在一個更具體的實施方案中，單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC登記號為HB10916)特異性與表位結合的表位結合。該單克隆抗體的一個實例為單克隆抗體5c8(ATCC登記號為HB10916)。在另一個具體實施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體或人源化抗體。
在一個具體的實施方案中，抗體的一部分包含輕鏈或重鏈的互補決定區或可變區。在另一個具體實施方案中，抗體的該部分包括互補決定區或可變區。在另一個具體實施方案中，抗體的該部分包含F抗體或單鏈抗體。
在另一個具體實施方案中，蛋白質包含能抑制CD40配體與細胞上CD40相互作用的CD40配體可溶性細胞外區或其一部分；或能抑制CD40配體與細胞上CD40相互作用的CD40的可溶性細胞外區或其一部分。在一個具體的實施方案中，CD40配體或CD40的可溶性細胞外區為單體。在另一個具體實施方案中，CD40的可溶性細胞外區為寡聚體。
在本發明的另一個具體實施方案中，包含CD40的可溶性細胞外區或其一部分的蛋白進一步包含與CD40細胞外區或其一部分融合的Fc區。在一個具體的實施方案中，Fc區能與蛋白A或蛋白G的結合。在另一個具體實施方案中，Fc區包括IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD或IgE。
當給藥時，蛋白質通常迅速地被從循環中清除，從而產生相對短壽命的藥物學活性。結果，需要經常注射相對大劑量的生物活性蛋白以維持治療功效。通過與如聚乙二醇、聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸的水溶性聚合物的共價連接而修飾的蛋白已知在靜脈注射後從實質上顯示比相應的未修飾的蛋白更長的血液半衰期(抗體uchowski等，在「作為藥物的酶」，Holcenberg等編Wiley-Interscience，紐約，NY,367-383(1981；Anderson,W.F.(1992)人基因治療科學256:808-813；Newmark等(1982)應用生物化學雜誌4:185-189；和Katre等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:1487-1491(1987))。這些修飾還可增加蛋白質在水溶液中的溶解性，消除聚集，增加蛋白質的物理和化學穩定性以及大大降低蛋白質的免疫原性和抗原性。結果，通過比未修飾蛋白更少次或更低劑量地給藥該聚合物-蛋白質加合物可獲得所需的體內生物學活性。
由於PEG在哺乳動物中具有非常低的毒性，所以將聚乙二醇與蛋白質相連尤其有用(Carpenter等1971)。例如，在美國，腺苷脫氨酶的PEG加合物已被批准用於人類治療嚴重的混合型的免疫缺乏綜合症。PEG結合物提供的第二個優點是有效降低異源蛋白質的免疫原性和抗原性。例如，人蛋白質的PEG加合物可用於治療其他哺乳動物種類的疾病而不具有引發嚴重免疫應答的危險。在本發明的一個具體實施方案中，可以微囊化手段遞送蛋白質以降低或防止抗蛋白質的宿主免疫應答。還可以微膠囊化在膜中的形式遞送蛋白質，如脂質體的形式。
可方便地將聚合物如PEG與蛋白質中的一個或多個活性胺基酸殘基相連，如氨基末端胺基酸的α-氨基、賴氨基側鏈的ε-氨基、半胱氨酸側鏈的巰基、天冬氨醯和穀氨醯側鏈的羧基、C末端胺基酸的α-羧基、酪氨基側鏈，或與跟一些天冬醯胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基相連的糖基鏈的活化衍生物連接。
已描述了許多適宜於與蛋白質直接反應的PEG活化形式。可用於與蛋白質氨基基團反應的PEG試劑包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，尤其是其中離去基團為N-羥基琥珀醯亞胺、對硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸鹽的那些。含有馬來醯亞胺基或滷代乙醯基基團的PEG衍生物為可用於無巰基基團蛋白質修飾的試劑。同樣，含有氨基肼或醯肼基團的PEG試劑可用於與由蛋白質糖類基團的高碘酸氧化產生的醛反應。
可用上述方法治療的宿主為動物。優選該動物為哺乳動物。可被治療的哺乳動物的實例包括，但不局限於人、非人靈長類、嚙齒類(包括大鼠、小鼠、蒼鼠和豚鼠)，牛、馬、羊、豬、狗和貓。
在本發明的一個具體實施方案中，用篩選法選擇物質。
在一個具體實施方案中，用篩選法選擇該物質，它包括分離細胞樣品；在允許含有CD40的細胞活化的條件下培養樣品；將樣品與有效活化含有CD40細胞的表達被具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白的細胞，或與有效活化含CD40細胞的且被具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白接觸；如果物質能抑制含有CD40細胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細胞活化的物質接觸；並測定在存在該物質時，表達被具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白的細胞，或被具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白是否活化含有CD40細胞。細胞樣品可從不同組織中分離，包括培養物中的細胞系或從動物中分離的細胞，如來自固體組織的分散細胞、來自骨髓活體的細胞，或從如血液或淋巴液的體液中分離的細胞。
在另一個具體實施方案中，根據能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的CD40配體的可溶性細胞外區或其一部分的三維結構來選擇物質(分子)。該分子可從已知分子庫中選擇，或根據三維結構從已知分子修飾而來，或根據三維結構從頭設計或合成。在一個具體實施方案中，根據CD40配體的可溶性細胞外區或其一部分與先導抑制劑的複合物的三維結構，通過先導抑制劑的結構最優化設計該物質(分子)。治療方法本發明提供一種包括上述抑制在細胞表面含有CD40的平滑肌細胞的CD40配體活化的方法的治療宿主平滑肌細胞依賴疾病的方法，包括給予宿主能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質，其中該物質以有效抑制宿主細胞活化的量存在。
在本發明的一個具體實施方案中，平滑肌細胞依賴疾病為血管病。在一個特定的具體實施方案中，血管病為動物粥樣硬化。
在另一個具體實施方案中，平滑肌細胞依賴疾病為胃腸道疾病。在一個特定的具體實施方案中，胃腸道疾病選自食管異常遊動性、炎症性腸道疾病和硬皮病。
在一個具體實施方案中，平滑肌細胞依賴疾病為膀胱疾病。
可用醫學上可接受的任何方式給藥予本發明化合物。這包括注射，胃腸外途徑，如靜脈內、血管內、動脈內、皮下、肌肉內、腫瘤內、腹膜內、心室內、硬膜內或其他方式以及口、鼻、眼、直腸、局部或吸入。持續釋放給藥也特定地包括在本發明中，將這些方式作為外科手術中直接運用的對易受侵蝕的移植物的給藥注射。
以醫學上可接受的任何劑量/體重和任何劑量頻率給予化合物。可接受的劑量包括約0.01-200mg/Kg宿主體重的範圍。優選的劑量範圍為約0.1-50mg/Kg之間。尤其優選的是約1-30mg/Kg之間的劑量。以每天至個月的間隔重複該劑量。一個優選的給藥方案是在治療的開始3天每天給予本發明化合物，此後每3周給予化合物，其中每次為靜脈給藥5或10mg/Kg。另一個優選的方案為治療的開始3天每天靜脈內給藥5mg/Kg本發明化合物，此後每周以10mg/宿主經皮下或肌肉內給藥化合物。另一個優選的方案為以20mg/Kg體重經胃腸外給予單劑的本發明的化合物，接著每周以10mg/宿主經皮下或肌肉內給予化合物。
可以單劑的形式給藥本發明的化合物以用於某些適應症，如防止宿主短時間暴露於抗原產生的抗原的免疫應答，如在治療的某一天給予的外源抗原。該抗原的實例包括同時給予本發明化合物和基因治療載體或治療劑，如抗原藥物或血液產品。在抗原緩慢出現的適應症中，如在控制對移植組織或緩慢給藥的抗原藥物的免疫反應中，以一定的間隔，在如醫學上指示的從數天，數星期至宿主終身的時間內給予本發明化合物。
由於伴隨有水腫的毛細血管擴張和吞噬白細胞的遷移的結果，炎症反應的特徵表現為發紅、腫脹、發熱和疼痛。炎症進一步由Gallin定義(第26章，基礎免疫學，第二版，Raven出版，紐約，1989,pp721-733)，其被本文引作參考。
從下面的實驗詳述中將更好地理解本發明。然而，本領域技術人員容易理解如後面權利要求中更全面描述的，所討論的具體的方法和結果僅僅只是說明本發明。實驗詳述下面的實施例1和2證實炎症細胞因子誘導平滑肌細胞表達CD40。而且，它們表明CD40介導的信號調節平滑肌細胞的功能。實施例1FACS被用來研究是否平滑肌細胞表達CD40。在6孔平板中，將人主動脈平滑肌培養在補充有25％FCS,5％人血清，肝素90ug/ml，內皮細胞生長因子15ug/ml和1％青黴素-鏈黴素的M199培養基中。每2-3天更換培養基，並且當細胞接近鋪滿時，在存在或不存在IFN-γ(1000U/cc),IL-1α(1ng/cc)或TNF-α(200U/cc)下，將它們培養72小時。用胰蛋白酶-EDTA處理收集細胞，並使用抗CD40單克隆抗體G28.5，通過FACS分析測定CD40的表達。還用同型陰性對照單克隆抗體將細胞染色，並使用抗-CD54(ICAM-1)單克隆抗體作為陽性對照。
如圖1A所證實，平滑肌細胞不組成性地表達CD40。然而，與IL-1α或TNF-α相反，IFN-γ正調節平滑肌細胞的CD40的表達(圖1A,1B和1C)。這些研究證明IFN-γ正調節人主動脈平滑肌中的CD40的表達。實施例2就地測定平滑肌細胞的CD40的表達。在正常血管的培養基中發現的形態學上與平滑肌細胞相似的細胞不與抗CD40單克隆抗體反應。然而，在與移植相關的加速動脈粥樣硬化的炎症損傷中發現的在形態學上與平滑肌細胞相似的細胞原位表達CD40。這些研究表明炎症細胞因子誘導平滑肌細胞表達CD40。而且，這些研究證實CD40L介導的信號調節平滑肌細胞的功能。實施例3CD40L+CD40+T細胞和CD40+靶細胞出現在動脈粥樣硬化和移植冠狀動脈疾病中活化的內皮細胞(EC)，巨噬細胞(Mac)和CD4+T細胞早期出現在冠狀動脈粥樣硬化(CA)和心移植動脈粥樣硬化(TA)的損傷中。由於CD40L為一種將接觸依賴活化信號遞送到CD40+靶細胞的活化誘導的CD4+T細胞表面因子，因此我們研究了在CA(n=5)和TA(n=5)中的原位CD40L和CD40表達，其中CD40+靶細胞包括EC(正調節ICAM、VCAM和E-選擇表達)和Mac(誘導NO,TNF-α和IL-1的產生)。使用抗CD40L單克隆抗體5C8，抗CD40單克隆抗體G28.5或適宜的對照單克隆抗體測定CD40L和CD40的表達。正常冠狀動脈的冷凍切片(n=3)不含有T細胞，CD40的表達局限於EC。相反，如通過對連續切片的免疫標記所證實的，與CA和TA相關的損傷含有CD40L+CD4+T細胞。另外，來自患有CA和TA的病人的冰凍切片中，CD40的表達在內皮細胞、侵染單核細胞、泡沫細胞和內膜平滑肌細胞(SMC)中明顯被正調節。使用SMC(平滑肌肌動蛋白)或Mac(HAM-56)特異性標記物對石蠟固定組織的二色免疫組織化學分析證實了這些細胞中的CD40表達。令人感興趣的是，遠離炎症細胞的內膜SMC和中膜SMC為CD40+，表明在體內局部炎症介導物正調節SMC中CD40的表達。在TA的所有階段發現CD40正調節和CD40L+CD4+T細胞，並在CA的早期損傷包括脂肪條斑中最顯著。總之，這些研究表明CD40L+T細胞可與CA和TA中的CD40+靶細胞相互作用，並通過促進炎症原分子的產生導致這些疾病的發病。實施例4:CD40在移植動脈粥樣硬化損傷中的平滑肌細胞和巨噬細胞中表達用二色免疫組織化學分析研究在自然動脈粥樣硬化或與移植相關的動脈粥樣硬化中的CD40的原位表達。對被固定在10％福馬林緩衝液並被用石蠟包埋的冠狀動脈中進行雙標記免疫組織化學分析。將切片在二甲苯中脫蠟，水合，並用1/5％H2O2的80％乙醇溶液淬滅內源過氧化物酶。接著在37℃下，將切片用0.01％胃蛋白酶的鹽酸溶液(pH1.5)消化15分鐘。然後，將切片用PBS漂洗，與10％馬血清一起保溫20分鐘以阻止非特異性染色。利用Vector ABC Elite盒(Vector)，依次使用生物素標記的第二抗體、親和素-過氧化物酶複合物和3,3』二氨基聯苯作為顯影劑檢測抗CD40染色。觀察到CD40的存在為褐色染色。此後，將切片用PBS漂洗，再用10％馬血清阻斷。將切片與對平滑肌細胞(平滑肌肌動蛋白)或巨噬細胞(HAM 56)特異性的單克隆抗體一起保溫1小時。使用親和素-生物素體系(Vector)將一抗與鹼性磷酸酶共軛。Vector Red(Vector)被用來檢測鹼性磷酸酶活性和產生紅色反應的染色。因此，雙標記細胞被染成褐色(CD40)和紅色(平滑肌細胞或巨噬細胞)。為了控制用於雙重標記分析的兩種免疫組織化學方法之間的幹擾，還對各樣品的連續切片的CD40、平滑肌肌動蛋白或HAM56進行染色。參見圖3A和3B。對照切片顯示出相同的每個第一單克隆抗體與雙染色切片相的免疫活性分布。實施例5在自發冠狀動脈粥樣硬化和與移植相關的冠狀動脈疾病中的CD40L和CD40的分布CD40的表達與細胞間粘附分子，活化的NF-KB和T淋巴細胞之間的相互關係T細胞在自發冠狀動脈粥樣硬化(CA)和與移植相關的冠狀動脈疾病(TCAD)的發病中起作用，然而，對在這些損傷中T細胞與其他細胞相互作用機理了解不甚全面。CD40L是一種與包括巨噬細胞和內皮細胞的CD40+靶細胞相互作用的活化誘導的CD4+T細胞表面分子，並誘導包括ICAM-1和VCAM-1的促炎症分子的產生。而且，已知CD40的連接活化轉錄因子NF-KB。為了研究CD40L-CD40相互作用是否可能在CA或TCAD的發病中起作用，在從患有CA(n=10)或TCAD(n=9)的心臟異源移植受體獲得的冠狀動脈的冷凍切片中進行CD40L和CD40表達的免疫組織化學研究。使用兩種不同的抗CD40L單克隆抗體，發現CD40L的表達局限在CA和TCAD的侵染淋巴細胞中。在兩種疾病中的內膜內皮細胞、泡沫細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞中CD40的表達被顯著地正調節。雙重免疫標記證明許多CD40+細胞共表達ICAM-1、VCAM-1或活性形式的NF-KB。CD40、ICAM-1和VCAM-1表達的程度表明了與疾病的嚴重性和內膜淋巴細胞量的統計顯著相關性。這些研究在一起證明了在CA和TCAD損傷中活化的CD40L+和CD40+細胞的存在，並表明CD40L介導與CD40+巨噬細胞、泡沫細胞、平滑肌細胞和/或內皮細胞的相互作用可導致這些疾病的發病。
一些方面的證據說明細胞介導的免疫機理導致自發冠狀動脈粥樣硬化(CA)(5-10)和與移植相關的冠狀動脈疾病(TCAD)(11-13)特有的炎症損傷(1-4)。例如，表達如CD25和MHCⅡ型分子的活化標記的侵染內膜T細胞早期出現在這兩種疾病的血管損傷進展中(5,14)。通常在這兩種疾病的損傷中發現活化的巨噬細胞，它們為與T細胞依賴性免疫應答相關的細胞因子，包括IFN-γ、IL-1和TNF-α(5-17)。由於進一步的證據表明T細胞可在CA中起著致病作用，已從人纖維粥樣硬化CA斑點中分離了CD4+T細胞克隆，其中當存在自發CA和TCAD損傷的主要組成的氧化的LDL(18)時，人纖維粥樣硬化的斑點增殖並分泌IFN-γ(1,19,20)。而且，在用抗CD4單克隆抗體的小鼠中高脂血誘導的動脈粥樣硬化損傷減少(21)。類似的，當異源移植安排在T細胞遺傳缺失的小鼠品種中(13)或用抗CD413或抗IFN-γ單克隆抗體處理時(22),TCAD的血管損傷顯著改善。這些數據在一起有利地說明T細胞和T細胞衍生效應分子參與這些疾病的發病。
CD40L是一種在將接觸依賴信號遞送到如B細胞(25-29)的CD40+靶細胞的活化CD4+T細胞中表達的30-33kDa分子量的表面分子。CD40L介導的信號在體外和體內T細胞依賴激素免疫應答的過程中極其重要(30)。目前已知CD40L-CD40相互作用還在體外和體內細胞介導的免疫應答中起作用(31,32)。令人感興趣的是，已知參與CA和TCAD的發病的細胞類型的巨噬細胞和內皮細胞也表達CD40(33-37)。而且，在體外，巨噬細胞和內皮細胞中的CD40的連接誘導增強免疫應答和/或促炎症作用的分子產生。例如，在體外，CD40L-CD40相互作用正調節巨噬細胞中MHCⅡ型和共同刺激分子CD86的表達(38)。而且，巨噬細胞中CD40的連接通過誘導NO合成2，促凝血劑蛋白組織因子和基質金屬蛋白酶來誘導細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-12)、化學因子(IL-8、MIP-1α)、氧化氮(NO)的產生(33,34,39-42)。在內皮細胞中，CD40L-CD40相互作用正調節胞間粘附分子CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM-1)和CD62E(E-選擇蛋白)(35-37)。CD40連接的多種作用效果取決於轉錄因子NF-kB的活化(43-45)。
這些結果在一起表明這樣一種想法，即在體內各種靶細胞中的CD40的連接可影響CD4+T細胞介導的炎症反應。支持這種假設的是，在患有狼瘡性腎小球腎炎、IgA腎病和ANCA+T細胞腎小球腎炎的病人的腎以及在患有牛皮癬的病人的皮膚中CD40的表達被正調節(35,46)。而且，CD40L+T細胞侵染患有炎症性腎疾病的病人的腎(46)。由於T細胞與巨噬細胞、內皮細胞和可能的其他細胞的相互作用在CA和TCAD的發病中起作用，因此，在本次研究中，使用免疫組織化學研究CD40L和CD40在這兩種疾病中的表達。CD40L在T細胞中表達，且CD40的表達在這兩種疾病的內膜損傷中的內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和「泡沫」細胞中被正調節。而且，使用雙重免疫染色發現這些損傷中的許多CD40+細胞共表達CD54、CD106和活性形式的NF-kB。方法人冠狀動脈從23個心臟異源移植受體的外植心臟獲得左主冠狀動脈的節段或左前下動脈的近端部分。由於他們已發展成嚴重的與移植相關的冠狀動脈疾病(TCAD)，因此9位病人進行重新移植。在這些病人中，第一次異源移植的存活期在38至103個月之間變化。因為他們已發展成嚴重的冠狀動脈疾病和局部缺血性心肌病，所以10位病人接受了心臟異源移植。從4位病人的外植心臟獲得沒有動脈粥樣硬化變化的對照冠狀動脈；其中3位患有自發性心肌病，1位患有心臟肉瘤。-80℃下，將各血管段驟凍在異戊烷中，在恆冷切片機(Reichert Histostat)中以4mm的厚度進行連續切片。將切片粘貼在唾液酸覆蓋的載玻片上，空氣乾燥，在冷丙酮中固定1分鐘，在1∶1冷丙酮/氯仿混合物中再固定7分鐘，貯藏於-80℃下。將來自各冠狀動脈的一個切片固定在10％福馬林中，用蘇木精和伊紅染色用於組織學評價。一抗抗CD40雜交瘤G28.5(IgG1)從美國典型培養物中心(Rockville,MD)購得。如前所述產生抗CD40L單克隆抗體5C8(IgG2a)。使用蛋白G柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)從腹水中純化G28.5和5C8單克隆抗體。另外的抗CD40L單克隆抗體(IgG1)購自Calbiochem(SanDiego,CA)。IgM抗CD40單克隆抗體從Caltag(Burlingame,CA)獲得，並用於雙重免疫染色研究。CD3、CD4、CD8、CD34、CD68(Novocastra,Burlingham,CA，所有IgG1)和平滑肌肌動蛋白(SMA)(DAKO,Carpinteria,CA,IgG2a)的單克隆抗體被用來區分內膜斑點的各種細胞類型，包括T細胞(CD3、CD4或CD8)、內皮細胞(CD34)、巨噬細胞(CD68)和平滑肌細胞(SMA)。抗ICAM-1(IgG1)和抗VCAM-1(IgG1)單克隆抗體從CHEMICONTM(Temecula,CA)購得。用與被IKB阻斷的NF-KB的p65亞單位中的表位結合的p65單克隆抗體(IgG3)(BOEHRINGER MANNHEIMTM)證明活化的NF-KB的分布，因此僅當通過解離IKB來活化NF-KB時才可達到(47)。同型對照單克隆抗體(Mopec21,22)從SIGMAQTM(St.Louis,MO)獲得。免疫組織化學用磷酸緩衝鹽溶液(PBS)清洗冰凍切片並將內源過氧化物酶猝滅在0.5％的過氧化氫中。將切片用10％山羊血清和聚集的人Ig(80mg/ml)的PBS溶液「阻斷」，接著與所述第一單克隆抗體或各自對照單克隆抗體一起保溫一小時。帶有濾泡增生的扁桃體的冰凍切片被用作陽性對照以確定各單克隆抗體的最佳稀釋度。將與靶抗原結合的第一單克隆抗體與生物素標記的同型特異性山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG3或IgM(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)相連，然後共軛成親和素-生物素-過氧化物酶複合物(VECTOR ELITE KITTM,VECTORTM,Burlingham,CA)。用顯色劑(紅色)3-氨基-9-乙基咔唑(AEC,VECTORTM,Burlingham,CA)檢測過氧化物酶活性，將切片用Mayer氏蘇木精復染(SIGMATM,St.Louis,MO)。
用雙標記免疫組織化學來鑑定表達CD40的細胞類型以及確定在動脈粥樣硬化損傷中相對於ICAM-1、VCAM-1或活化的NF-KB的CD40的分布。首先將所有切片用IgM抗CD40單克隆抗體進行免疫標記。二抗是隨後與親和素-生物素-過氧化物酶複合物共軛的生物素化的山羊抗小鼠IgM。用來檢測抗CD40 IgM單克隆抗體的存在的顯色劑是3,3』二氨基聯苯胺(褐色)。然後，充分漂洗切片，與靶向用於平滑肌細胞(SMA)或巨噬細胞(CD68)、白細胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)或活化形式的NF-KB的細胞特異性標記的第二初級單克隆抗體一起保溫。所有第二初級單克隆抗體為IgG1、IgG2a或IgG3同型。使用適宜的同型特異性生物素化的二抗並將其與親和素-生物素-鹼性磷酸酶複合物(VECTORTM,Burlingham,CA)結合。用顯色劑Vector Red(VECTORTM,Burlingham,CA)證明鹼性磷酸酶活性。通過使用不同的免疫酶技術(過氧化物酶對鹼性磷酸酶)和各種靶抗原的同型特異性二抗可避免依次使用的染色方法之間的幹擾。而且，製備雙標記對照切片，其中兩種一級單克隆抗體中的一種被同型匹配的對照單克隆抗體替代。損傷的半定量分析通過以0-4等級定義血管腔狹窄的程度來定量各切片中動脈粥樣硬化損傷的程度，其中0代表無狹窄，1代表小於25％,2代表小於50％,3代表小於90％,4代表大於90％的腔狹窄。還統計每個冠狀動脈損傷的內膜巨噬細胞、平滑肌細胞、泡沫細胞、內皮細胞(新血管化)48和T細胞的含量，其中0代表不存在各種細胞類型，1代表很少量分出的細胞，2代表少量細胞，3代表存在集中密度的聚集物，4代表遍及整個斑點中的濃密的聚集物。類似的，以0-4的等級統計CD40、ICAM-1和VCAM-1的存在，其中0代表不存在各種分子，1代表其存在於極少細胞中，2,3和4分別代表其存在於少於50％,90％和大於90％的細胞中(49)。由於陽性樣品中的CD40L的表達局限於分離的細胞中，因此，其存在對於定量評價是不適合的。統計學分析使用非參數Kruskal Wallis法分析各組樣品組織學記分的差別。使用Spearman氏相關性評價可變量之間的關係。結果正常冠狀動脈如H$E染色所證實(圖4A-4B)，來自4位對照病人的冠狀動脈片段未顯示出濃密增厚或炎症。具體講，巨噬細胞、平滑肌細胞、泡沫細胞或淋巴細胞未存在於內膜中，並且沒有細胞與本研究中所採用的任一抗CD40L單克隆抗體發生免疫反應。存在CD40免疫反應性，並局限在沿對照動脈的血管腔排列的內皮細胞中(圖4B)。在對照血管中不表達VCAM-1或活化的NF-KB，並且ICAM-1在極少量的血管內皮細胞中有弱表達。自發CA和TCAD的組織學在10位患有CA的7位中，冠狀動脈片段顯示出具有偏心狹窄，非細胞脂富集核心，膽固醇裂和重疊的纖維帽的凸起的動脈粥樣硬化斑點。損傷的多孔性在含有巨噬細胞和淋巴細胞的「臂」區最大(圖5A)。在內膜損傷中還分散有平滑肌細胞、巨噬細胞、泡沫細胞和新血管形成的病灶。患有中度早期血管損傷的3位病人的斑點為偏心小型的，並富含巨噬細胞、「泡沫」細胞和淋巴細胞。
9位患有TCAD的病人的冠狀動脈損傷表明內膜隨著腔的明顯狹窄而纖維狀增厚(表2)。
表2自發冠狀動脈粥樣硬化(CA)和移植冠狀動脈疾病(TCAD)的內膜損傷中的細胞組成和對CD40、ICAM-1和VCAM-1的免疫反應性的半定量評價(等級0-4)。值以平均值+標準偏差表示
通過Kruskal-Wallis試驗，p,0.05,CA或TCAD與對照比較損傷由平滑肌細胞和間質基質的同心層組成，並且沿著新血管形成區域有大量的巨噬細胞和淋巴細胞的侵蝕。在4個冠狀動脈中，除平滑肌細胞的同心層外，還觀察到富含脂質的動脈粥樣硬化損傷和「泡沫」細胞(圖6A-C)。淋巴細胞的內皮下集中(「內皮炎」)和淋巴細胞在外膜的聚集也是在TCAD損傷中注意到的特徵。CA和TCAD中CD40L表達的免疫組織化學分析與缺乏侵染淋巴細胞或CD40L表達細胞的正常冠狀動脈明顯相反，CA和TCAD損傷含有CD40L+細胞。在自發動脈粥樣硬化中，CD40L的陽性免疫染色局限於少數內膜淋巴細胞中。CD40L染色通常很弱，並在小的胞質顆粒或在細胞表面被觀察到(圖7A-D)。在自發CA中，大多數內膜淋巴細胞為CD4+T細胞；僅存在極少CD8+T細胞(圖7A-D)。用抗CD4或抗CD8單克隆染色的連續切片的分析表明CD40L+淋巴細胞主要為CD4+T細胞。內皮細胞，平滑肌細胞，巨噬細胞和「泡沫」細胞不與本研究所採用的任何一種抗CD40L單克隆抗體反應。用同型對照單克隆抗體未觀察到染色。
在TCAD損傷中，CD40L的陽性免疫染色也僅僅與淋巴細胞相關(圖8A-C)。與CA相反，CD8+和CD4+T細胞均存在於TCAD損傷中。然而，CD8+T細胞主要在「內皮炎」的內皮下區域發現(圖9A-B)，而CD4+T細胞集中在與內彈性膜相鄰的內膜深處(圖8A-C)以及冠狀動脈外膜的聚集物中。CD40L的表達在空間上與患有TCAD的冠狀動脈的內膜和外膜中的CD4+T細胞相關。TCAD中的CD40L+T細胞的數目高於自發CA損傷中的。類似於CA,TCAD損傷中的內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和「泡沫」細胞不與本研究中採用的任一抗CD40L單克隆抗體反應(圖9A-B)。這些數據表明可能為CD4+T細胞的CD40L表達細胞存在於自發CA和TCAD的損傷中。CA和TCAD中CD40表達的免疫組織化學分析與局限在正常冠狀動脈中的腔內皮細胞的弱CD40表達相反(圖4A-B),CD40免疫反應性在自發CA的損傷中被正調節，並廣泛分布(圖5A-B)。在內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞和「泡沫」細胞中觀察到CD40的表達。在自然CA的內膜損傷中CD40陽性細胞的平均數目明顯高於對照動脈(2.2+0.7對0.5+0.6，表2)。用巨噬細胞或平滑肌細胞特異性標記的雙重免疫染色證實兩種譜系的這些細胞和「泡沫」細胞表達CD40(圖10A-B)。令人感興趣的是，CD40+平滑肌細胞存在於靠近炎症侵染的內膜中，而動脈基質中的平滑肌細胞未顯示出對CD40的陽性免疫反應性(圖10A-B)。對用CD40或內皮標記物CD34染色的連續切片的分析表明沿內膜新血管和外膜血管排列的內皮細胞也為強的CD40+(圖11A-D)。
在來自患有TCAD的病人的動脈中，CD40表達的分布圖類似於自發CA。然而，TCAD中的CD40免疫反應性的平均值明顯高於自然CA或對照動脈(表2)。雙重免疫染色表明內膜平滑肌細胞和巨噬細胞表達CD40(圖10A-B)。而且，沿血管腔、內膜新血管和外膜血管排列的泡沫細胞(圖6A-B)和內皮細胞明顯地為CD40+。這些數據結合在一起證明在自發CA和TCAD中內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞表達CD40。在CA和TCAD損傷中CD40的表達與胞間粘附分子和NF-KB的活化的關係CA和TCAD中的巨噬細胞和內皮細胞表達調節將淋巴細胞運輸到損傷的胞間粘附分子。由於在體外CD40的連接誘導細胞中胞間粘附分子的正調節和NF-KB的活化，因此人們關注CD40的表達是否與CA或TCAD損傷中的胞間粘附分子或NF-KB的共表達相關。首先在自發CA中證明腔內皮細胞顯示出對帶有極少表達VLAM-1的內皮細胞的ICAM-1的病灶陽性免疫染色。相反，沿內膜新血管和外膜血管排列的內皮細胞對ICAM-1和VCAM-1為強陽性(圖11A-D)。內膜平滑肌細胞、巨噬細胞和「泡沫」細胞對ICAM-1和VCAM-1也為中等強陽性(圖12A-C)。在CD40值與ICAM-1(r=0.85)和VCAM-1(r=0.72)的那些值之間具有顯著的相關性(p＜0.05)。內膜淋巴細胞的數目與CD40和白細胞粘附分子的值顯著相關(表3)。表3:CA(n=10)或TCAD(n=9)的內膜損傷的各種細胞類型的值(0-4)與CD40和粘附分子(ICAM-1,VCAM-1)的表達值(0-4)的相關性。值以Spearmen相關性係數表示(範圍為-1至1，其中「0」為不相關，「-1」或「1」為極為相關)。
*p＜0.05,**p＜0.01和***p＜0.001,Spearman相關顯著性水平在所有所列細胞類型中，只有內膜淋巴細胞的值與CA和TCAD中的內膜斑點中的CD40的表達和ICAM-1和VCAM-1的程度顯著相關，這表明淋巴細胞參與這兩種疾病中的CD40和粘附分子的誘導。在CA和TCAD中，巨噬細胞和新血管形成也顯示出與CD表達的顯著的相關性。
用抗CD40單克隆抗體和抗ICAM-1單克隆抗體或抗VCAM-1單克隆抗體的對CA損傷的雙重免疫染色表明CD40和這些粘附分子共存在於許多細胞中(圖1A-C)。此外，在新內膜內皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞的核中觀察到活化的NF-KB(圖13)，並且雙重免疫標記證明許多CD40+細胞也表達活化的NF-KB。
在TCAD中，對ICAM-1和VCAM-1的強陽性免疫染色存在於腔內皮細胞中，尤其是靠近內皮炎病灶的那些中。內膜新血管外膜血管的內皮細胞對ICAM-1和VCAM-1為強免疫反應性。TCAD中的粘附分子的免疫染色值高於CA或正常冠狀動脈(表2)。在CD40值與ICAM-1值(r=0.82)和VCAM-1值(r=0.89)之間具有顯著的相關性(p＜0.05)。內膜淋巴細胞的數目也與CD40、ICAM-1和VCAM-1的表達顯著相關(表3)。類似於CA，雙色免疫組織化學研究證明TCAD損傷中的許多CD40+細胞共表達ICAM-1或VCAM-1(圖12A-C)。與自發CA比較，活化的核類型的NF-KB的免疫染色更廣泛地分布於TCAD中。NF-KB陽性巨噬細胞和平滑肌細胞一致為CD40+(圖13)。這些數據一起證實在自發CA和TCAD的損傷中，CD40和胞間粘附分子和/或NF-KB在許多細胞中共表達。討論自然動脈粥樣硬化(CA)和與移植相關的動脈粥樣硬化(TCAD)為由活化T細胞，內皮細胞，巨噬細胞和平滑肌細胞之間複雜的相互作用介導的炎症性疾病(2,8,12,13,17)。T細胞被認為在CA和TCAD的發病中起作用，然而，對它們參與這些過程的機理還未充分了解(5,9,50)。研究表明為活化誘導的CD4+T細胞表面分子的CD40L將接觸依賴活化信號遞送到表達CD40的內皮細胞和巨噬細胞中，這將導致促炎症分子的產生，如胞間粘附分子ICAM-1和VCAM-1(31,32,35-37)和轉錄活化因子NF-KB的活化(43-45，體外)。令人感興趣的是，鼠模型中的TCAD至少部分依賴於CD40L-CD40相互作用(51)。在Larson和其同事的研究中，抗CD40L單克隆抗體治療明顯抑制異源異位移植排斥和部分阻斷相關的血管病。而且，通過給予抗CD40L單克隆抗體和阻斷T細胞助刺激途徑的CTLA4-Ig融合蛋白質(為分子)的混合物可幾乎完全防止了該模型中的TCAD(51)。CD40L-CD40相互作用可能參與了人CA和/或TCAD的發病中。
為了證實這種假設，進一步將免疫這種化學方法用於正常和動脈粥樣硬化的冠狀動脈中以研究CD40L和CD40的表達和細胞分布。正常冠狀動脈不含有CD40L表達細胞，CD40免疫反應性局限於這些血管中的腔內皮細胞中。相反，CD40L在自發CA和TCAD的損傷中的淋巴細胞中表達。發現CA損傷含有少數CD8+T細胞，而TCAD損傷在內膜和外膜較深處的腔內皮(「內皮炎」)和CD4+T細胞附近含有CD8+T細胞。根據用抗CD40單克隆抗體或抗CD8單克隆抗體的定位和染色，推出在兩種疾病的損傷中CD40L+淋巴細胞幾乎類似於CD4+T細胞。使用兩種不同的抗CD40L單克隆抗體，發現CD40L免疫反應性弱，且與顆粒和胞質或細胞表面相關。在腎小球腎炎中的CD40L和CD40表達的研究中觀察到相似類型的CD40L免疫反應性(46)。炎症組織中CD40L表達的微弱常見的胞質染色類型可能與活化T細胞的CD40L表達的暫時性(27-29)和靶細胞中的CD40的參與通過受體介導的胞吞作用(52)和釋放作用(53)誘導CD40L的負調節的這一事實相關。這些調節機理可能起著將CD40L介導的信號事件集中於適宜的相關靶細胞中的作用。
發現在兩種疾病損傷中CD40表達在許多細胞中明顯被正調節。表達CD40的巨噬細胞和「泡沫」細胞在富含脂質斑點的「臂」區的炎症侵染中尤其突出，其中這些斑點已知含有濃密的炎症滲液(54,55)。在兩種疾病的腔內皮細胞中CD40表達也被正調節，這在TCAD中尤其突出。兩種疾病中的內膜新血管和外膜血管內皮細胞為強CD40+。表達CD40的平滑肌細胞存在於CA和TCAD的內膜中，通常在炎症滲液附近。令人感興趣的是，相同血管基質中的平滑肌細胞為CD40-。在體外，IFN-γ正調節包括平滑肌細胞在內的許多細胞中的CD40的表達，並且如IL-1β和TNF-α的細胞因子增強這種作用(36)。因此，這些損傷中的許多細胞類型中CD40表達的明顯正調節可能是由損傷T細胞，巨噬細胞和其他細胞釋放細胞因子的結果。雙重免疫染色表明許多CD40+細胞也共表達胞間粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及活化形式的NF-KB。總之，本研究證實了在自發CA和TCAD的血管損傷中CD40L+T細胞和活化的CD40+靶細胞的存在。
早期研究表明CD40在一些上皮細胞腫瘤和B細胞中表達(57,58)。最近已注意到在體外在許多細胞類型中CD40被組成性地表達或可誘導(33-37,56)。而且，日趨證實在體內，C40L-CD40相互作用在細胞介導的炎症反應中起著關鍵作用(31,32)。在這方面，最近報導證明了人炎症疾病中的原位CD40L和/或CD40表達(35,46,59)。例如，在侵染患有多發性硬化病人的腦的巨噬細胞中(59)，牛皮癬皮膚內皮細胞和角質細胞中(35)以及患有炎症性腎小球性腎炎病人的腎臟中的許多細胞中(46),CD40表達被正調節。而且，在患有多發性硬化的病人的腦中(59)以及患有炎症性腎小球性腎炎的病人腎臟中(46)的炎性滲液含有CD40L+T細胞。因此有可能在許多炎性疾病中CD40的表達被正調節，並且代表一種允許T細胞將炎症原信號遞送到多種靶細胞中的分子機理。在這方面，這裡提供的研究結果，即在CA和TCAD中CD40表達被正調節以及在損傷中發現CD40L+侵染T細胞作為在免疫介導的炎症反應的證據在這些疾病的發病中起作用(5-7,9,18,21,23,50)。
有關在體外CD40L介導的內皮細胞和巨噬細胞的活化的觀察以及在TCAD鼠模型發病中的CD40L-CD40相互作用研究表明了CD40L-CD40相互作用在CA和TCAD中的可能的致病作用。例如，在體外，CD40L介導的信號正調節內皮細胞中的ICAM-1和VCAM-1的表達(35-37)。調節炎症位點的白細胞的超常狀態和滯留的這些胞間粘附分子在CA和TCAD內皮細胞中被正調節，並在內膜新血管和血管內皮細胞中尤其突出(49,60)。因此，令人感興趣的是，在CA和TCAD中發現了許多CD40+細胞，尤其是內膜和血管內皮細胞共表達ICAM-1和/或VCAM-1。已知ICAM-1和VCAM-1的正調節依賴於NF-KB的活化(61)。在本發明中，還證明了CD40+內膜巨噬細胞、平滑肌細胞和內皮細胞表達活性形式的NF-KB。這些研究表明CD40L+CD4+T細胞可部分通過活化NF-KB來誘導CA和TCAD中CD40+靶細胞上的胞間粘附分子的正調節。
CD40L介導的信號還誘導內皮細胞分泌IL-6和IL-8(62)並通過正調節組織因子和負調節凝血調節蛋白的表達啟動前凝血劑表面。在體外，對於巨噬細胞，CD40L-CD40相互作用誘導這些細胞分泌炎症原細胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6和TNF-α)、化學因子、基質金屬蛋白酶和表達組織因子(33,34,38,41,42)。所有這些炎症原分子可能在CA和TCAD的發病中起作用(10,17,63-66)。巨噬細胞中的CD40的連接也誘導NO的產生(39,40)。令人感興趣的是，在TCAD的鼠模型中阻斷CD40L-CD40相互作用與iNOS表達的負調節和TCAD損傷的減少相關(51)。證明了iNOS在CA(67,68)，心臟異源移植排斥(69,70)和TCAD(71,72)損傷中表達。CD40L介導的信號可能參與促進CA或TCAD中任何分子的產生。CD40L-CD40相互作用顯然在TCAD(51)以及膠原蛋白誘導的關節炎(73)、狼瘡樣腎小球性腎炎(74)和實驗變態性腦脊髓炎(59)的鼠模型中明顯具有炎症原作用。
進行了人頸動脈動脈粥樣硬化中的CD40L和CD40的表達的研究(62)。發現在損傷中CD40被正調節並具有廣泛的細胞分布。CD40L被報導廣泛地在動脈粥樣硬化損傷中的平滑肌細胞、內皮細胞和巨噬細胞中表達，而在使用兩個不同的抗CD40L單克隆抗體分本研究中，CD40L表達局限於T細胞。這裡在任一疾病中的巨噬細胞、內皮細胞或平滑肌細胞中未觀察到原位CD40L表達。類似的，發現在其他炎症疾病中，CD40L免疫反應性局限於T細胞，其中炎症疾病包括腎小球性腎炎(46)、類風溼性關節炎和慢性腸炎。另外，Gerritse等報導在多發性硬化斑點中CD40L的表達局限於CD4+T細胞(59)。這裡的結果與Mach和同事的結果之間的差異目前不清楚，但可能與免疫組織化學方法或損傷性質的細微不同有關。參考文獻1．Nilsson,J.1993移植方法25:2063-2064。2．Munro,J.和R.Cotran.1988實驗室研究58:249-261。3．Cramer,D.等1992心肺移植雜誌11:458-466。4．Billingham,M.1992心肺移植雜誌11:S38-S44。5．Zhou,X.等1996.美國病理學雜誌149:359-366。6．Wick,G.等1995.今日免疫學16:27-33。7．Stemme,S.等1992.動脈粥樣硬化和血栓形成12:206-211。8．Ross,R.1993自然362:801-809。9．Lichtman,A.等1996美國病理學雜誌149:351-357。10．Kishikawa,H.等1993 Virchows考古學423:433-442。11．Krensky,A.1994腎臟研究45；50S-56S。12．Salomon,R.等1991美國病理學雜誌138:791-798。13．Shi,C.等1996.Proc Natl Acad Sci,USA.93:4051-4056。14．Jonasson,L.等1985.臨床研究雜誌76:125-131。15．Russell,P.S.等1994.美國病理學雜誌144:260-274。16．Moyer,C.等1992.病理學雜誌138:951-960。17．Libby,P.和Z.Gallis 1995.Ann NY Acad Sci 748:158-168.18．Stemme,S.等1995.Proc Natl Acad Sci,USA.92:3893-3897。19．Witztum,J.和D.Steinberg 1991臨床研究雜誌88:1785-1792。20．de Lorgeril,M.等1993.美國心臟雜誌125:974-980。21．Emeson,E.等1996.美國病理學雜誌149:675-685。22．Russell,P.等1994.移植57:1367-1371。23．Russell,M.等1996.臨床研究雜誌97:833-838。24．Hancock,W.等1996.Proc Natl Acad Sci 93:13967-13972。25．Graf,D.等1992.歐洲免疫學雜誌22:3191-3194。26．Armitage,R.J.等1992.自然357(6373):80-2。27．Lane,P.等1992.歐洲免疫學雜誌22:2573-2578。28．Lederman,S.等1992.實驗醫學雜誌175(4):1091-101。29．Noelle,R.等1992.Proc Natl Acad Sci USA.89:6550-6554。30．Banchereau,J.等1994.免疫學年述12:881-922。31．Noelle,R.1996.免疫4:415-419。32．Stout,R.和J.Suttles 1996.今日免疫學17:487-492。33．Alderson,M.R.等1993.實驗醫學雜誌178(2)；669-74。34．Caux,C.等1994.實驗醫學雜誌180:1263-1272。35．Hollenbaugh,D.等1995.實驗醫學雜誌182:33-40。36．Karmann,K.等1995.Proc Natl Acad Sci,USA.92:4342-4346。37．Yellin,M.J.等1995.實驗醫學雜誌182:1857-1864。38．Kiener,P.等1995.免疫學雜誌155:4917-4925。39．Stout,R.等1996.免疫學雜誌156:8-11。40．Tian,L.等1995.歐洲免疫學雜誌25:306-309。41．Pardier,O.等1996.歐洲免疫學雜誌26:3048-3054。42．Malik,N.等1996.免疫學雜誌156:3952-3960。43．Berberich,I.等1994.免疫學雜誌153:4357-4366。44．Hess,S.等1995.免疫學雜誌155:4588-4595。45．Karmann,K.等1996.實驗醫學雜誌184:173-182。46．Yellin,M.等1997.風溼性關節炎40:124-34。47．Brand,K.等1996.臨床研究雜誌97:1715-1722。48．Kuamamoto,M.等1995.人類病理學26:450-456。49．O』Brien,K.等1996.循環93；672-682。50．Haraoka,S.等1995.Virchows關節炎426:307-315。51．Larsen,C.等1996.自然381:434-438。52．Yellin,M.J.等1994.免疫學雜誌152(2):598-608。53．Graf,D.等1995.歐洲免疫學雜誌25:1749-1754。54．Bioerkerud,S.和B.Bjoerkerud 1996.美國病理學雜誌149:367-380。55．van der Wal,A.等1994.循環89:36-44。56．Yllin,M.J.等1995.白細胞生物學雜誌58:209-216。57．Pauli,S.等1985.癌症免疫學與免疫治療20:23-28。58．Clark,E.A.和J.A.Ledbetter1986.Proc Natl Acad Sci。USA.83:4494-4498。59．Gerritse,K.等1996.Proc Natl Acad Sci.93:2499-2504。60．Davies,M.等1993.病理學雜誌171:223-229。61．Collins,T.等1995.FASEB J.9:899-909。62．Mach,F.等1997 Proc Natl Acad Sci,USA.94:1931-1936。63．Berliner,J.等1995循環91:2488-2496。64．Libby,P.等1995心血管藥物25增訂版2:S9-12。65．Li,Z.等1996美國病理學雜誌148:121-128。66．Galis,Z.等1994.臨床研究雜誌94:2493-2503。67．Buttery,L.等1996.實驗室研究75:77-85。68．Aji,W.等1997.循環95:430-437。69．Yang,X.等1994.臨床研究雜誌94:714-721。70．Worrall,N.等1995.實驗醫學雜誌181:63-70。71．Russell,M.等1995.循環92:457-464。72．Akyurek,L.等1996.美國病理學雜誌149；1891-1990。73．Durie,F.H.等1993.科學261:1328-1330。74．Mohan,C.等1995.免疫學雜誌154:1470-1480。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人Yellin,Michalel J.
Lederman,SethChess,LeonardKarpusas,Mihail N.
Thomas,David W.
(ⅱ)發明題目T-BAM(CD40L)技術在治療涉及平滑肌細胞的疾病中的治療應用(ⅲ)序列數目1(ⅳ)通訊地址(A)地址Cooper unham LLP(B)街道1185 Avenue of the Americas(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家USA(F)郵編10036(ⅴ)計算機可讀形式(A)介面類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申請數據(A)申請號仍然未知(B)申請日同此附上(C)分類
(ⅷ)代理人信息(A)姓名White Esq.,John P.
(B)登記號28,678(C)參考/記錄號48559/JPW/JML(ⅸ)通訊信息(A)電話(212)278-0400(B)傳真(212)391-0525(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度146胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅲ)假設無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser1 510 15Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr20 25 30Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val35 40 45Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser50 55 60Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu65 70 75 80Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr85 90 95His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly100 105 110Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp115 120 125Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu130 135 140Lys Leu14權利要求
1．一種抑制在細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD40配體活化的方法，包括將細胞與能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質接觸，其中該物質以有效抑制該細胞活化的量存在。
2．權利要求1的方法，其中平滑肌細胞為膀胱平滑肌細胞、血管平滑肌細胞、支氣管平滑肌細胞、主動脈平滑肌細胞、冠狀動脈平滑肌細胞、肺平滑肌細胞或胃腸道平滑肌細胞。
3．權利要求2的方法，其中胃腸道平滑肌細胞為食管平滑肌細胞、胃平滑肌細胞，小腸平滑肌細胞或大腸平滑肌細胞。
4．權利要求1的方法，其中該物質抑制CD40配體與細胞上的CD40結合。
5．權利要求1的方法，其中該物質為蛋白質。
6．權利要求5的方法，其中蛋白質包括抗體或其一部分。
7．權利要求6的方法，其中抗體為單克隆抗體。
8．權利要求7的方法，其中單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號為HB10916)特異性結合的表位結合。
9．權利要求8的方法，其中單克隆抗體為單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號為HB10916)。
10．權利要求7的方法，其中單克隆抗體特異性地與CD40結合。
11．權利要求10的方法，其中抗體為人源化，嵌合或靈長類源化的抗體。
12．權利要求7的方法，其中單克隆抗體為嵌合抗體。
13．權利要求7的方法，其中單克隆抗體為人源化抗體。
14．權利要求6的方法，其中抗體的一部分包含輕鏈或重鏈的互補決定區或可變區。
15．權利要求6的方法，其中抗體的一部分包含互補決定區或可變區。
16．權利要求15的方法，其中抗體的一部分包含Fab或單鏈抗體。
17．權利要求5的方法，其中蛋白質包括CD40配體的可溶性細胞外區或其包含保守置換的變異體或其一部分；或CD40的可溶性細胞外區或其包含保守置換的變異體或其一部分。
18．權利要求17的方法，其中CD40配體或CD40的可溶性細胞外區為單體。
19．權利要求17的方法，其中CD40的可溶性細胞外區為寡聚體。
20．權利要求17的方法，其中包含CD40或其一部分或CD40配體或其一部分的可溶性細胞外區的蛋白質進一步包含與CD40或其一部分或CD40配體或其一部分融合的Fc區。
21．權利要求20的方法，其中Fc區能與蛋白A或蛋白G結合。
22．權利要求21的方法，其中Fc區包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE或其亞類。
23．權利要求22的方法，其中IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA為IgA1或IgA2。
24．權利要求1的方法，其中物質為非蛋白質。
25．權利要求1的方法，其中物質選自已知物質庫。
26．權利要求1的方法，其中物質從已知物質修飾而來。
27．權利要求26的方法，其中根據CD40配體的可溶性細胞外區或其一部分與先導抑制劑的複合物的三維結構，通過先導抑制劑的結構最優化來設計被修飾的物質。
28．權利要求1的方法，其中物質通過篩選方法選擇，它包括分離細胞樣品；在允許含有CD40的細胞活化的條件下培養樣品；將樣品與有效活化含有CD40細胞的表達被由具有ATCC登記號HB 10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白的細胞，或有效活化含有CD40細胞且被由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白接觸；如果物質能抑制含有CD40細胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細胞活化的物質接觸；和測定在存在該物質時，表達由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白的細胞，或由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白是否活化含有CD40細胞。
29．權利要求28的方法，其中物質選自已知物質庫。
30．權利要求29的方法，其中已知物質為非蛋白物質。
31．一種在個體中抑制細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD配體活化的方法，包括給予宿主能抑制CD40配體與細胞表面的CD40相互作用的物質，其中該物質以在宿主中有效抑制該細胞活化的量存在。
32．權利要求31的方法，其中平滑肌細胞為膀胱平滑肌細胞、血管平滑肌細胞、支氣管平滑肌細胞、主動脈平滑肌細胞、冠狀動脈平滑肌細胞、肺平滑肌細胞或胃腸道平滑肌細胞。
33．權利要求32的方法，其中胃腸道平滑肌細胞為食管平滑肌細胞、胃平滑肌細胞，小腸平滑肌細胞或大腸平滑肌細胞。
34．權利要求31的方法，其中該物質抑制細胞中CD40配體與CD40結合。
35．權利要求31的方法，其中該物質為蛋白質。
36．權利要求35的方法，其中蛋白質包括抗體或其一部分。
37．權利要求36的方法，其中抗體為單克隆抗體。
38．權利要求37的方法，其中單克隆抗體特異性地與單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號為HB10916)特異性結合的表位結合。
39．權利要求38的方法，其中單克隆抗體為單克隆抗體5c8(ATCC保藏登記號為HB10916)。
40．權利要求37的方法，其中單克隆抗體特異性地與CD40結合。
41．權利要求40的方法，其中抗體為人源化，嵌合或靈長類源化的抗體。
42．權利要求37的方法，其中單克隆抗體為嵌合抗體。
43．權利要求37的方法，其中單克隆抗體為人源化抗體。
44．權利要求36的方法，其中抗體的一部分包含輕鏈或重鏈的互補決定區或可變區。
45．權利要求36的方法，其中抗體的一部分包含互補決定區或可變區。
46．權利要求45的方法，其中抗體的一部分包含F抗體或單鏈抗體。
47．權利要求31的方法，其中為哺乳動物。
48．權利要求47的方法，其中哺乳動物為嚙齒類。
49．權利要求47的方法，其中哺乳動物為人。
50．權利要求31的方法，包括蛋白質包含CD40配體的可溶性細胞外區或其包含保守置換的變異體或其一部分；或CD40的可溶性細胞外區或其包含保守置換的變異體或其一部分。
51．權利要求50的方法，其中CD40配體或CD40的可溶性細胞外區為單體。
52．權利要求50的方法，其中CD40的可溶性細胞外區為寡聚體。
53．權利要求50的方法，其中包含CD40或其一部分或CD40配體或其一部分的可溶性細胞外區的蛋白質進一步包含與CD40或其一部分或CD40配體或其一部分融合的Fc區。
54．權利要求53的方法，其中Fc區能與蛋白A或蛋白G結合。
55．權利要求53的方法，其中Fc區包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE或其亞類。
56．權利要求55的方法，其中IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA為IgA1或IgA2。
57．權利要求31的方法，其中物質為非蛋白質。
58．權利要求57的方法，其中物質為小分子。
59．權利要求31的方法，其中物質選自已知物質庫。
60．權利要求31的方法，其中物質從已知物質修飾而來。
61．權利要求60的方法，其中根據CD40配體的可溶性細胞外區或其一部分與先導抑制劑的複合物的三維結構，通過先導抑制劑的結構最優化來設計被修飾的物質。
62．權利要求31的方法，其中物質通過篩選方法選擇，該方法包括分離細胞樣品；在允許含有CD40的細胞活化的條件下培養樣品；將樣品與有效活化含有CD40細胞的表達被由具有ATCC登記號HB 10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白的細胞，或有效活化含CD40細胞且被由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白接觸；如果物質能抑制含有CD40細胞活化，則將樣品與有效量的抑制含有CD40細胞活化的物質接觸；和測定在存在該物質時，表達被由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白的細胞，或被由具有ATCC登記號HB10916的雜交瘤產生的單克隆抗體5c8特異性識別的蛋白是否活化含有CD40細胞。
63．權利要求62的方法，其中物質選自已知物質庫。
64．權利要求63的方法，其中已知物質為非蛋白物質。
65．一種治療個體平滑肌細胞依賴疾病的方法，包括根據權利要求31的方法抑制細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD配體的活化。
66．權利要求65的方法，其中平滑肌細胞依賴疾病為血管病。
67．權利要求66的方法，其中血管疾病為動脈粥樣硬化。
68．權利要求65的方法，其中平滑肌依賴疾病為胃腸道疾病。
69．權利要求68的方法，其中胃腸道疾病選自食管異常遊動性、炎性腸疾病和硬皮病。
70．權利要求65的方法，其中平滑肌依賴疾病為膀胱疾病。
全文摘要
通過將細胞與能抑制CD40L與細胞表面的CD40相互作用的物質接觸在體內和體外抑制在細胞表面具有CD40的平滑肌細胞的CD40配體(CD40L)的活化。在體內，具有CD40的平滑肌細胞的抑制被用於治療平滑肌細胞依賴疾病。
文檔編號A61K39/395GK1227494SQ97197174
公開日1999年9月1日 申請日期1997年7月3日 優先權日1996年7月8日
發明者M·J·耶林, S·勒德曼, L·徹斯, M·N·卡普薩斯, D·W·託馬斯 申請人:紐約市哥倫比亞大學理事會, 生物基因公司