一種利用釀酒酵母表達北非蠍毒素的方法

2023-07-19 06:16:41 5

專利名稱：：一種利用釀酒酵母表達北非蠍毒素的方法
技術領域：
：本發明屬生物
技術領域：
，特別是涉及釀酒酵母表達北非蠍毒素的方法。
背景技術：
：黏蟲(Mythimnas印erataWalker)是鱗翅目昆蟲，又稱剃枝蟲、行軍蟲，是我國糧食作物的重要害蟲，每年南北往返遷飛，大發生時可把作物葉片食光，造成大面積減產或絕收，且其沒有滯育、繁殖率高、體形較大，具有一定的代表性。在國內，許多農藥研究機構將其作為新農藥篩選的靶標。目前，黏蟲的防治措施主要是施用化學農藥。然而化學農藥的大量生產和使用又引出三大難題(1)環境汙染，殘毒上升，人畜均遭毒害；(2)害蟲抗藥性直線上升，用藥濃度不斷提高；(3)殺傷天敵，破壞了生態平衡。(4)高殘留的傳統化學農藥的使用已引起了農畜產品殘留嚴重超標，導致出口受阻。這些都給生態環境、經濟建設、食品安全、人民健康、城市品質和面貌帶來了嚴重的危害。生物農藥是直接利用生物產生的生物活性次生代謝產物或生物活體開發而成的農藥。生物農藥主要包括生物化學農藥(生物源農藥)、微生物農藥、轉基因生物農藥和天敵生物農藥等四類。由於生物農藥來源於自然，多數具有選擇性強，對人畜等生物比較安全，環境相容性好，對天敵較安全，不易產生抗性，生產工藝比較簡單，開發與登記費用較低等特點。北非蠍毒素是從北非蠍子(Androctonusaustralis)中分離出的一種活性成分，是由70個胺基酸組成的多肽。AaHIT1毒素主要毒殺鱗翅目昆蟲，特別對夜蛾科的一些重要的農作物害蟲有效。它特異性地作用於昆蟲神經系統，使昆蟲產生收縮麻痺,而對甲殼動物、哺乳動物等其他動物均無毒性，具有高效、特異性強、安全性好等優點。通過原核表達北非蠍毒素的工作正在進行中，目前存在的問題是表達產物的活性較低，主要原因在於AaHIT1是一段真核基因，真核基因在原核系統中表達容易出現包涵體、產生活性較低的表達產物。釀酒酵母菌是基因工程中常用的一種宿主菌，重組酵母菌能夠穩定地表達外源基因所編碼的目的蛋白，並可對目的蛋白進行翻譯後加工和修飾以產生功能性蛋白產物。而且具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物加工修飾及分泌的能力。釀酒酵母是與人們日常生活密切相關的益生菌，不會構成對環境的威脅；儘管本領域的研究人員能夠按照現有基因工程原理推測北非蠍毒素基因作為真核生物的基因，應該在真核表達系統裡表達時具有較高的活性，但至今還未能夠找到一種利用釀酒酵母高效表達北非蠍毒素及利用其殺滅黏蟲的方法。
發明內容所要解決的技術問題本發明所要解決的技術問題是提供一種利用釀酒酵母表達北非蠍毒素的方法，以填補現有技術尚無法利用真核細胞高效表達北非蠍毒素的技術空白。技術方案5本發明的技術方案之一是提供一種利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，依次包括如下步驟a)提供北非蠍毒素基因AaHIT1;b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質粒pYES2/AaHIT1;c)將重組質粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1並鑑定；e)培養轉化菌株AINVSC1，表達北非蠍毒素蛋白。上述的利用酵母菌表達北非蠍毒素方法的優選方案之一為，所述的重組質粒pYES2/AaHIT1含有GAL1啟動子。上述的利用酵母菌表達北非蠍毒素方法的優選方案之二為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為20°C-37°C。上述的利用酵母菌表達北非蠍毒素方法的優選方案之三為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為28°C。上述的利用酵母菌表達北非蠍毒素方法的優選方案之四為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養時間為14-28小時。上述的利用酵母菌表達北非蠍毒素方法的優選方案之五為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養時間為20小時。本發明的技術方案之二是提供一種北非蠍毒素，採用釀酒酵母菌表達，其製備方法依次包括如下步驟a)提供北非蠍毒素基因AaHIT1;b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質粒p丫ES2/AaHIT1;c)將重組質粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1並鑑定；e)培養轉化菌株AINVSC1，表達北非蠍毒素蛋白。上述的北非蠍毒素的優選方案之一為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為20°C-37°C。上述的北非蠍毒素的優選方案之二為，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為28"。上述的北非蠍毒素的優選方案之三為，所述的北非蠍毒素蛋白存在於培養酵母菌AINVSC1的菌液上清。本發明是通過以下方式實現的1)將AaHIT1與質粒載體PYES2連接，構建得到PYES2/AaHIT1重組質粒。2)轉化釀酒酵母菌INVSC1，用特定的篩選培養基進行篩選，得到基因工程菌INVSC1-AaHIT1。3)通過SDS-聚丙烯醯胺電泳檢測，證明北非蠍毒素AaHIT1在釀酒酵母菌INVSC1中表達。4)表達北非蠍毒素的釀酒酵母菌INVSC1菌株在YPD培養基上進行液體培養，達到一定的O.D.值後離心取上清，與飼料混合餵養黏蟲。有益效果表達北非蠍毒素的釀酒酵母菌INVSC1菌液有比較好的殺蟲效果(表1)。從表1可以看出，該菌液對黏蟲的生長發育有抑制作用，72小時的致死率在43.8%左右，說明對農業害蟲，黏蟲有較高的毒殺作用。圖1AINVSC1和INVSC1菌株生長曲線圖2pYES2/AaHIT1重組質粒電泳圖譜(Maker:DNAMakerDL2000用入-HindIII酶切；1-5:pYES2/AaHIT1重組質粒PCR產物)圖3pYES2/AaHIT1重組質粒PCR分析(Maker:DL2000用A-HindIII酶切；1-2:pYES2/AaHIT1質粒PCR產物)圖4陽性克隆pYES2/AaHIT1質粒PCR分析(Maker:DL2000;1-2:pYES2/AaHIT1質粒PCR產物)圖5工程菌AINVSC1表達AaHIT1SDS-PAGE電泳圖(1-2:INVSC1產物3:AINVSC1產物)圖6AINVSC1在不同培養溫度中表達AaHIT1圖7AINVSC1在不同培養時間中表達AaHIT1(Maker:蛋白質(低)分子量標準；INVSC1:INVSC1菌液提取液；16小時、18小時、20小時、22小時、24小時分別表示在這些培養時間中的工程菌AINVSC1的菌液提取液。)圖8AINVSC1用不同接種量中表達AaHIT1(Maker:蛋白質(低)分子量標準；INVSC1:INVSC1菌液提取液；1%、3%、5%、7%、10%:分別表示用這些接種量的工程菌AINVSC1的菌液提取液)圖9pYES2/AaHIT1重組質粒的質粒圖譜具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。帶有AaHIT1基因的質粒pMD18-T/AaHIT1由本實驗室保存。AaHIT1基因序列的GeneBank號為P01497。酵母菌株INVSC1來自上海師範大學生環學院。結合劑SolutionSN和SolutionB、3S柱(3Scolumn吸附材料是玻璃基質，柱離心式)均購自博彩公司。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，以及實際的製備都是按照傳統的方法進行，如質粒的抽提、目標基因的獲得、以及試劑的配製都是按照現代分子生物學實驗原理與技術(科學出版社，2006年02月，陳喜文主編，作者陳德富)。測序由上海鼎安生物科技有限公司完成。實施例1以帶有AaHIT1基因的質粒pMD18-T/AaHIT1為模板，以P1(SEQNo.1:5'GCGAAGCTTATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGC3')、P2(SEQNo.2:5'GGCGGATCCTTAGTTGATGATGGTGGTGTCGCAGT3')為引物，PCR擴增AaHIT1基因，PCR反應循環為94°C2分鐘，94°C30秒-62°C30秒-72°C30秒35個循環，72°C5分鐘。PCR產物經電泳檢測後回收待用。電泳回收PCR產物，主要的步驟為1)用Agarose膠對PCR產物進行電泳分離。將目的DNA片段與其DNA儘可能分開，然後用乾淨的手術刀割下含所要回收DNA的瓊脂塊，放入1.5mL離心管中。2)按每100mgAgarose膠加入400SolutionSN，置於55-65。C水浴中5分鐘，中途混勻幾次，至膠完全融化。膠融化後每400mLSolutionSN力口入100|jLSolutionB，混勻。3)將3S柱放入2mL收集管中，將融化的膠溶液轉移到3S柱中，開蓋，室溫放置2分鐘。蓋上離心管蓋，10,000rpmx1分鐘室溫離心。4)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，加入600|jL洗滌緩衝液，10,000rpm"分鐘室溫離心。5)重複步驟4)一次。6)取下3S柱，倒掉收集管中的廢液，將3S柱放入同一個收集管中，10,000rpmx2分鐘室溫離心。7)將3S柱放入一根新的1.5mL離心管中，在3S柱子膜中央加30|jLTE緩衝液，不要蓋上離心管蓋，室溫放置2分鐘。8)蓋上離心管蓋，10,000rpmx1分鐘室溫離心，離心管中的液體即為回收的DNA片段，保存於-2(TC備用。p丫ES2質粒和pMD18-T/AaHIT1質粒分別用BamHI、HindIII雙酶切，電泳檢測回收。酶切產物經電泳檢測後，回收pMD18-T/AaHIT1質粒的小片段(即AaHIT1片段)以及p丫ES2質粒大片段，將回收的AaHIT1片段和pYES2載體通過T4連接酶連接，獲得pYES2/AaHIT1重組表達載體質粒。pYES2/AaHIT1質粒測序結果顯示上述連接正確。將重組質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞製備大量重組質粒。DH5a感受態細胞的製備及質粒轉化方法如下1)挑取DH5a單克隆置於5mLLB液體培養基，37°C，200rpm搖床培養過夜。2)以1。/。接種量接入新鮮5mLLB液體培養基中，37"搖床至O.D.6000.5。3)將菌液分裝至無菌預冷的1.5mLEp管，冰浴10分鐘，5000rpmx5分鐘，4"C離心。4)棄上清，加入1mL預冷100mMCaCI2，冰浴30分鐘，5000rpmx5分鐘，4'C離心。5)棄上清，加入100iJL預冷100mMCaCl2，重懸，存於4。C待用。按照常規方法抽提大量pYES2/AaHIT1重組質粒。將pYES2/AaHIT1重組質粒轉化酵母菌INVSC1得到基因工程菌AINVSC1。方法如下一、酵母菌INVSC1感受態製備1)INVSC1酵母菌50mLYPD培養基中，3CTC，200rpm搖床至OD600(1.0—1.5)。4°C，3000rpm離心5分鐘，棄上清收集菌體。2)用20mL1倍的TE/LiAC(0.1M/0.1MPh7.5)溶液重懸離心好的菌體，在3CTC搖床45分鐘。3)加入0.5mLDTT溶液，3(TC搖床15分鐘。4)《C離心機中3500rpm離心5分鐘，棄去上清。5)加入20mLddH2〇，4°C3000rpm離心5分種，棄去上清。6)加入1mL預冷的山梨醇重懸細胞。二、pYES2/AaHIT1電轉化酵母菌INVSC11)將3pL上述連接產物加入40mLinvsc1感受態細胞中。2)在電轉儀上電轉，電轉條件是1.5kv，20mF，200Q。3)將電轉好的細胞加入300|jL山梨醇混勻，在28—3CTC復甦1一2小時後塗布於SC-U(Cm+)培養基平板上。三、p丫ES2/AaHIT1質粒轉入後細胞的培養及鑑定1)轉化後長出的克隆加入3mLSC-U(Cm+)液體培養基中，28'C搖床培養過夜。2)取1.5mL對數生長期晚期的菌體培養液，在4。C離心機中13000rpm離心1分鐘棄上清。3)加入100口LTE緩衝液使細胞懸浮。4)加入200jjL裂解液，200iJL苯酚氯仿異戊醇，輕輕振蕩，在4。C離心機中13000rpm離心5分鐘。5)取上清，加等體積的無水乙醇沉澱DNA，在-2CTC存放0.5小時。6)4。C離心機中12000rpm離10分鐘，棄上清，加入600|j70%乙醇清洗。7)4。C離心機中12000rpm離10分鐘，棄上清，烘乾37。C，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。毒素蛋白在工程菌株中表達的檢驗方法挑取工程菌AINVSC1的菌落，置2mLSC-U(Cm+)中，28°C，200rpm搖床培養過夜，從中取出100ML菌液加入SC-U(Cm+)中，28°C，200rpm搖床培養，將取出的菌液4°C，5000rpmx10分鐘離心，棄上清後加入100|jL蛋白加樣緩衝液，混勻，沸水浴處理10分鐘使細胞充分裂解，以INVSC1菌體提取液作為對照，通過SDS-聚丙烯醯胺電泳檢測，電泳結束後用考馬斯亮蘭染色。採用噴葉餵養法噴灑玉米葉餵養黏蟲(MythJmnaseperataWalker)，檢測酵母工程菌AINVSC1表達的蠍昆蟲毒素AaHIT1所具有的殺蟲活性。採用工程菌菌液及菌液上清噴灑餵養黏蟲的方法。第一組，採用樣品1，即工程菌AINVSC1菌液噴灑玉米葉，餵養黏蟲。樣品1的處理是將AINVSC1菌28。C搖床培養24小時。黏蟲共20隻，分別裝在20個塑料管中，用藥前先飢餓餵養12小時，之後每12小時噴灑用藥一次，餵養72小時，處理溫度室溫約25。C，觀察黏蟲死亡情況。實驗重複3第二組，採用樣品2，即工程菌AINVSC1菌液的上清噴灑玉米葉，餵養黏蟲。樣品2的處理是將AINVSC1菌28t:搖床培養24小時，菌液4°C，12000rpmx20分鐘離心，取上清噴灑玉米葉餵養黏蟲。黏蟲餵養同上。上述兩組實驗中，對照為INVSC1菌液(CK1)和清水對照(CK2)，即INVSC1菌液28'C搖床培養24小時後用菌液噴灑玉米葉餵養黏蟲和清水噴灑玉米葉餵養黏蟲。噴葉餵養法的殺蟲實驗結果表明，AINVSC1酵母菌液以及菌體高速離心破碎後的菌液上清對黏蟲都具有觸殺活性，並且菌液上清的觸殺活性明顯高於菌液的觸殺活性(結果見表1)。由表中數據可得出AINVSC1菌液對黏蟲的觸殺作用較弱，校正死亡率為43.8%，然而樣品2即AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺活性卻明顯高於樣品1的觸殺活性，其校正死亡率達到64.8%，比樣品1的校正死亡率提高了很多。表1黏蟲毒性試驗結果平均重量*平均重量(mg)增加淨重量~致死率S(mg)0小時72小時(mg)(%)(小時)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.655樣品113.115.3682.26843.860-72樣品210.2511.7621.51264.848-60*平均重量是以20隻實驗幼蟲計算；CK1:清水對照組；CK2:NVSC1菌液；樣品1:轉化有pYES2/AaHIT1的INVSC1的菌液上清；樣品2:轉化有pYES2/AaHIT1的INVSC1的菌液進一步通過用不同的培養溫度、培養時間、接種量培養AINVSC1比較AaHIT1的黏蟲觸殺活性。培養時間對表達量及活性的影響測定方法分別用16小時、18小時、20小時、22小時、24小時培養工程菌AINVSC1，檢測出工程菌表達AaHIT1的最大表達量的時間。在所選擇的16小時、18小時、20小時、22小時、24小時各種培養時間中，只有在18小時、20小時、22小時、24小時的培養基中AaHIT1表達，而在16小時的培養基中AaHIT1不表達。圖7顯示從表達的條帶中看，18小時、20小時、22小時、24小時培養時間中AaHITI表達量差別不大。因此我們採用噴葉餵養黏蟲的方法進一步比較各培養基中AaHIT1對黏蟲的觸殺活性。表2不同培養時間的表達產物對黏蟲觸殺作用1平均重~平均重"l""""增加淨重致死率(％)LT5。(小時量#(mg)0小時(mg)72小時量(mg)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.65518小時13.32414.7971.47347.560-7220小時12.23114.9622.73150.136-4822小時13.12314.401.27745.836-4824小時".95113.2761.32544.648-60#平均重量是以20隻實驗幼蟲計算，上述實驗數據均為3次重複實驗相近值的平均值)CK1:INVSC1菌液對照餵養黏蟲；CK2:清水對照餵養黏蟲。表2結果顯示20小時培養的AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺效果最好(校正死亡率達50.1%)，18小時次之(校正死亡率47.5。/。)，最後是24小時(校正死亡率44.6。/。)。由此工程菌AINVSC1表達AaHIT1觸殺黏蟲的最優條件為，20小時培養，並且AaHIT1在對數生長期開始表達。接種量對毒素蛋白的表達量及活性的影響測定方法分別用1%、3%、5%、7%、10。/。的接種量培養工程菌AINVSC1，檢出表達毒素蛋白的最適合的接種量。圖8顯示在所選擇的1%、3%、5%、7%、10。/。各種接種量對毒素蛋白的表達量及活性的影響。只有在3%、5%、7。/。的培養基中AaHIT1表達，而在1%、10%的培養基中AaHIT1不表達。從表達的條帶中看，3%、5%、7%接種量中AaHIT1表達量差別不大。因此我們採用噴葉餵養黏蟲的方法進一步比較各培養基中AaHIT1對黏蟲的觸殺活性。表3不同接種量表達產物對黏蟲觸殺作用組平均重量(mg)O小時平均重量(mg)72小時增加淨重量(mg)致死率(%)LT50(小時)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.6553%13.54915細2.43533.660-725%10.68912.1491.4649.836-487%12.30914.8122.50340.848-60CK1:INVSC1菌液對照餵養黏蟲；CK2:清水對照餵養黏蟲。平均重量是以20隻實驗幼蟲計算，上述實驗數據均為3次重複實驗相近值的平均值表3顯示5%接種量培養的AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺效果最好(校正死亡率達49.8%)，7。/。次之(校正死亡率40.8%)，最後是3。/。(校正死亡率33.6%)。由此工程菌AINVSC1表達AaHIT1觸殺黏蟲的最優條件為，5%接種量培養，並且AaHIT1在對數生長期開始表達。溫度毒素蛋白的表達量及活性的影響測定方法分別用12°C、2CTC、28°C、37°C、4rC培養工程菌AINVSC1，檢出最適合培養工程菌的溫度。我們發現28"最好。圖6所示在所選擇的12°C、2CTC、28°C、37°C、4TC各種培養溫度中，只有在20°C、28°C、37°C的培養基中AaHIT1表達，而在12°C、4rC的培養基中AaHIT1不表達。從表達的條帶中看，2CTC、28°C、37'C培養溫度中AaHIT1表達量差別不大。因此我們採用噴葉餵養黏蟲的方法進一步比較各培養基中AaHIT1對黏蟲的觸殺活性。表4不同培養溫度表達產物對黏蟲觸殺作用組平均重量(mg)O小時平均重量(mg)72小時增加淨重量(mg)致死率(％)L丁50(小時)CK112.3537.825.650CK210.9537.626.65520。C12.2914.4532.16336.560-7228。C13.5415.401.8645.736-4837。C11.9113.3641.45442,148-60表4結果顯示28"C培養的AINVSC1菌液上清對黏蟲的觸殺效果最好(校正死亡率達45.7%)，37。C次之(校正死亡率42.1。/。)，最後是20。C(校正死亡率36.5%)。以YPD液體培養基，分別測定AINVSC1和INVSC1菌種的生長曲線。挑取AINVSC1和INVSC1菌株單克隆，分別接種於SC-U培養基和YPD培養基，28°C，200rpm搖床培養。當OD6000.5時，以1%的接種量分別接入新鮮培養基，28°C，200rpm搖床培養，8小時後每隔2小時取一次樣，測OD600[76]。結果如表5和圖1所示。表5AINVSC1和INVSC1菌株生長OD600〇D600時間(小時)INVSC1AINVSC120.1070.06840.1980.11360.3720.18180.7210.407101.2831.021121.6961.356141細1.584161.9271.663182.0311.752tableseeoriginaldocumentpage18SEQUENCELISTING核苷酸序列表上海師範大學—種利用釀酒酵母表達北非蠍毒素的方法—種利用釀酒酵母表達北非蠍毒素的方法2Patentlnversion3.3139DNAMythimnaseperataWalkerAaHIT1基因上遊引物(1).,(39)1gcgaagctt3tgaaga3ga3cggctacgcggtgg3cagc39235DNAMythimnaseperataWalkerAaHIT1基因下遊引物("..(35)2ggcggatccttagttgatgatggtggtgtcgcagt3權利要求1、一種利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，依次包括如下步驟a)提供北非蠍毒素基因AaHIT1；b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質粒pYES2/AaHIT1；c)將重組質粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1並鑑定；e)培養轉化菌株AINVSC1，表達北非蠍毒素蛋白。2、根據權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，其特徵在於，所述的重組質粒pYES2/AaHIT1含有GAL1啟動子。3、根據權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，其特徵在於，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為20°C-37°C。4、根據權利要求3所述的利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，其特徵在於，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為28°C。5、根據權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，其特徵在於，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養時間為14-28小時。6、根據權利要求1所述的利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，其特徵在於,所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養時間為20小時。7、一種北非蠍毒素，採用釀酒酵母菌表達，其製備方法依次包括如下步驟:a)提供北非蠍毒素基因AaHIT1;b)構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質粒pYES2/AaHIT1;c)將重組質粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；d)篩選獲得轉化菌株AINVSC1並鑑定；e)培養轉化菌株AINVSC1，表達北非蠍毒素蛋白。8、根據權利要求7所述的北非蠍毒素，其特徵在於，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為20°C-37°C。9、根據權利要求8所述的北非蠍毒素，其特徵在於，所述的步驟e)中AINVSC1菌株的培養溫度為28°C。10、根據權利要求8或9所述的北非蠍毒素，其特徵在於，所述的北非蠍毒素蛋白存在於培養酵母菌AINVSC1的菌液上清。全文摘要本發明涉及一種利用酵母菌表達北非蠍毒素的方法，依次包括如下步驟提供北非蠍毒素基因AaHIT1；構建酵母細胞中表達AaHIT1蛋白的重組質粒pYES2/AaHIT1；將重組質粒pYES2/AaHIT1轉化酵母菌細胞；篩選獲得轉化菌株AINVSC1並鑑定；培養轉化菌株AINVSC1，表達北非蠍毒素蛋白。所獲得的真核表達的北非蠍毒素蛋白對黏蟲具有良好的殺蟲活性，適用於生物農藥領域的生產。文檔編號C12N15/81GK101649327SQ20091005599公開日2010年2月17日申請日期2009年8月6日優先權日2009年8月6日發明者付盈盈,明肖,黃晶心申請人:上海師範大學