小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpHap5a-like及其蛋白、和載體的製作方法

2023-07-19 16:52:26

專利名稱：：小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpHap5a-like及其蛋白、和載體的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因基因Vapfe-h'Ae及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和轉基因細胞系。
背景技術：
：低溫、乾旱、高鹽是限制植物生長發育、地理分布、形態建成等的重要環境脅迫因素。這些脅迫因素作用的結果均導致植物細胞失水，影響植物細胞的滲透壓，進而影響植物正常的生理代謝，嚴重時導致植物的死亡。通過對一些模式植物的研究發現這三種脅迫因素誘導表達的功能蛋白及轉錄因子相互交差，因此，尋求同時具有忍耐低溫、乾旱、高鹽脅迫的綠色植物來研究植物的非生物脅迫極有必要。對苔蘚植物的基礎研究標明苔蘚植物是極地低溫度環境的先鋒植物之一，同時它也分布在極端乾旱的沙漠。在漫長的生物進化歷程中，苔蘚植物形成了一套獨特的適應低溫乾燥等惡劣環境的機制。對小立碗蘚非生物脅迫研究發現(Frank等，2005)，與其他高等植物相比，小立碗蘚(屍A^co肌'tre"a/3te/s)可以忍耐極端的生態環境。如，擬南芥在100mM的NaCl處理下即受到傷害(Sunkar等，2003)，而小立碗蘚可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐漸提高的鹽處理條件下，小立碗蘚可以忍耐600mM的NaCl脅迫。500mM的山梨醇處理三天後，小立碗蘚仍可以倖存。當小立碗蘚失水92%時仍可恢復正常生長發育。在脫水、鹽漬和滲透脅迫條件下，Frank等(2003)分析鑑定了一系列上調基因，其編碼的蛋白主要有膽鹼脫氫酶(cholinedehydrogenase)、甜菜鹼(glycinebetaine)、三氫吡咯羧酸鹽(deltall-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、f丐依賴蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPkinase)等。在0。C低溫脅迫七天後小立碗蘚仍可恢復生長(Minami等，2005)，且在冷馴化過程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的轉錄，提高了其冰凍耐受能力。因此從苔蘚植物中克隆抗逆相關基因並進一步通過轉基因等技術應用於提高農作物的抗逆性是目前研究的熱點之一。
發明內容為了解決上述問題提出並完成了本發明。本發明的目的是提供一種高效的抗低溫脅迫相關基因。本發明的另一目的是提供上述基因編碼的蛋白質。本發明的再一目的是提供含有上述基因的載體。本發明的再一目的是提供表達上述基因的轉基因細胞系。具體地，本發明的發明人將培養至15葉左右的小立碗蘚莖葉體在O'C下經過不同時間的處理與非處理小立碗蘚莖葉體組成差異材料，通過cDNA-AFLP技術得到差異表達的EST，隨後在分子水平進行表達分析或蛋白質水平的分析，挑選出了一種具有顯著抗逆特性的基因一小立碗蘚抗逆基因屍p〃apfe-7iy^，其鹼基序列如SEQIDNo.1所示，其cDNA序列如SEQIDNo.2所示。進一步，本發明還提供了上述基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQIDNo.3所示。在本發明的完成過程中，還提供了包含上述基因的載體、以及表達該基因的轉基因細胞系。本發明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術，可以利用該基因培育出優質的轉基因農作物，從而提高農作物的抗逆性。圖1為屍p他Afe-力Ae基因的cDNA-AFLP圖譜，其中，Maker:分子量標記；1、未馴化的24小時的材料；2、未馴化的12小時的材料；3、冷馴化的24小時的材料；4、冷馴化的12小時的材料。圖2為屍p處^fe-"'々e基因的Real-timeRT-PCR相對表達量變化圖。具體實施例方式1、小立碗蘚的培養及冷脅迫處理將小立碗蘚培養至15葉左右，移入0。C處理0、3、6、12、24、48、72小時，分別取材用於cDNA-AFLP分析。附小立碗蘚培養基配方及製備大量元素Ca(N03)24H20FeS047H20MgS047H20微量元素CuS045H20ZnS047H20H3B03MnCl24H20CoCl26H20KINa2Mo042H20Glucose酒石酸銨磷酸鹽緩衝液0.8g/L0.0125g/L0.25g/L0.055mg/L0.055mg/L0.614mg/L0.389mg/L0.055mg/L0.028mg/L0.025mg/L5g/L0.5g/Llml/L微量元素配製成1000X母液，4'C存放。5固體基本培養基，加入濃度為0.8%瓊脂粉。磷酸緩衝液的配製取25gKH2P04溶解於100ml蒸餾水，用4MKOH調整pH7.0，4t:存放。2、cDNA-AFLP分析cDNA-AFLP方法參照Christian,1998。1)小立碗蘚RNA提取(TE3D法)和DNaseI處理2)mRNA的分離mRNA從總RNA中分離，按照Promega公司試劑盒PolyATractmRNAIsolationsystem介紹的方法進行。3)cDNA的合成cDNA按照TaKaRa公司試劑盒cDNASynthesisKit(M-MLVVersion)介紹的方法進行。4)雙酶切採用EcoRI和Msel兩種限制性內切酶對cDNA進行雙酶切。模板cDNA(200ng/ii1)1.25iU緩衝液(10X)2ylEcoRI5U/y11u1Msel5U/ullplddH2014.75ul總體積20ul混勻離心，37°C酶切至少3個小時，最好過夜直至cDNA被完全酶切；酶切完全後，反應混合物置65'C加熱15min，使限制性內切酶失火，之後將反應管置冰上冷卻；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果,呈現均勻彌散為較好酶切效果。5)接頭連接採用EcoRIadaptor和Mseladaptor兩種接頭連接，所用接頭見表2.1。酶切反應液20u1緩衝液(iox)2u1T4-連接酶(10U/ti1)0.:u1ATP(10mM)0.2n1EcoRI接頭50pmo1/y1ly1Msel接頭50pmol/u1lu1ddH205.7u1總體積-30ix1混合離心，37'C至少連接3小時，-2(TC可長期保存。6)預擴增以E0和M0為引物做預擴增，所用引物見表2.1。加入以下試劑於反應管中模板DNA(連接反應液)緩衝液(10X)MgC12(25mM)EcoRI引物(E0，50ng/u1)Msel引物(M0，50ng/u1)Taq酶(5U/u1)dNTP(10mM)H20總體積PCR反應程序94°C、3min;94°C環；68°C、10min;4。C保存。取5ul預擴增產物加入95ulTE稀釋,其餘擴增產物-2(TC保存。2.0y12.0u11.2y10.6u10.6u10.2u10.2u113.2u120p130s，56°C、30s，72。C、lmin，15個循tableseeoriginaldocumentpage8以El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8禾BMl、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8為引物做選擇性擴增，所用引物見表2.1。加入以下試劑於反應管中模板DNA(預擴稀釋物)5.0ul緩衝液(10X)2.0ulMgCl2(25mM)1.2p1dNTP(10mM)0.2nlEcoRI引物(Ex，50pmol/n1)0.6ulMsel引物(Mx，50pmol/n1)0.6nlTaq酶(5U/ul)0.2iilH2010.2u1總體積20ulPCR反應採用"touchdown"策略。程序如下94°Clrain94。C30s65°C30s7個循環(每個循環降低0.7°C)72°Clmin94°C30s20個循環56°C30s72°Clmin68°ClOmin4°C保存8)電泳檢測——銀染技術記錄試驗結果拍照或掃描，統計檢測位點數及其多態性位點。以冷馴化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未馴化Oh的小立碗蘚為材料，進行cDNA-AFLP分析。統計200bp1000bp之間的可讀帶，結果表明小立碗蘚冷馴化和未冷馴化的基因表達存在著明顯差異。有些cDNA片段在冷馴化後表達量逐漸增加，有些cDNA片段表現出先增加後降低，有些cDNA片段表達量先降低後增加，還有少數表達量明顯降低。3、屍p^jpfe-J^:e全長基因的獲得1)RT-PCR分析將由cDNA-AFLP分析得到的差異片段與P.patensEST資料庫(http:〃moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)進行BLAST比對後，進行聚類分析和功能分類，顯示小立碗蘚在冷馴化過程中細胞內的代謝活性和生長狀態發生了極大的變化。特別值得一提的是，發現了與傷害損傷修復相關的轉錄本，編碼屍P泡/fe-7Ae。通過同源序列設計引物，通過RT-PCR反應擴增得到/^yy邵fe-/Ae。/^泡pfe-h'Ae基因的上遊引物序列為AGATTCGAATTAACGCGCACCAAAAAAGTG;下遊引物序列為GGGATTTTACACATTTTCCTACCA。PCR反應體系如下c腿10XLAPCR緩衝液dNTP(2.5mM)primerF(50pmo1/ii1)primerF(50pmol/ul)LAPolymeraseddH20總體積PCR反應程序3n12u11.6u10.15u10.15u10.113u120y195。Clmin95°C45s65°C45s68°C2rain32個循環1072°C10min4°C保存2)純化後的差異片段與pGEM-Teasy(Promega)載體連接3)連接產物的轉化5)陽性克隆的測序以載體兩端的T7或SP6引物進行序列測定。測序儀為ABI3100(AppliedBiosystems)。該基因的基因序列如下SEQIDNo.1:AAATTTACAAATTGAAAAAAATAAAATAATGTTGTCAATATTTTATGTATTGGAGAATTCAAAACCATACACATGAATATTAAAGCATGAAAATTTCCAATACACTCTTTCATCAATGCAAATTTTAAAAACTCACAACAATTGTGATGACACCAGATTCGAATTAACGCGCACCAAAAAAGTGAAAGTAAAAAAGTACCATGAATCTACCGCGGGGTAAGTTCCAGCGGGGGCAAGTTAAACCCGAAAGGTGGGCCAATGAGAGGTCGCCATGTGTCAGCAGCAGAGTTCTCCACAGAACCAATGGCGGTGGTATGGCTGCATGGTCACATAGCTCCAGCATGCATGGGGCCATGGCCATGCGGGCACTCGCGGGCTCATTCAACCGGGAGTTCGCTGGTGCAGAGGTGTGGAGAGAGAGCTTGGCAGCAGCAGTAGCGATGGCGTCGAACCAGCATGGACTTGCGTCTCTTTCCTCTGCTAAACCACAATCCAGCGCCGGAGCTACTACTACGGCGCAGCAGAGTTTCCAGCAAGGGAAGCACCAGGTGAGCGCGTCATTGCAGGAGGGGAGGAGATGATGAGTCCGTCATTTGGTTCATGGTTGTATCTCTCTCTCACAGGAGGCGTGACTAGTGATTTTGGCCTAGTCATGCAGGATTTAATGCATTTCTAGAGTTTTTTTCAGTTTTTTGGATTTCTGGAATTATGAATCATAACTGTGATGGTTGCGTTTTGGTTTAGAGGAGGTGGAGGTGCTGGTGAGGCGATTTGAGGTTGAGTTGAGAATTTAGGAGGTTGCTGACTAGTGCACAACTCTCTCGCTGTGTGTGTGTATGTGTGTGGGTGGTTTTGTGTGTAGATGCAAGGGCAAGGACAGATGAACTCGCACATGCAGCACCAACAGCTGCAGATGTTTTGGCAGCAGCAAAACCAAGAAATGGAGCAGTTAAATGGTGCAGAAACCATTCTTTCCTTCGTGAGTACATATGAACATGTGCCGCTTTAGGCTTGCCTCTCGTCGTCTCGGGTGATTCTGATTGTTATTTTTAACAAGAGTGTTCGGTTTTGAATTGGCTTCTCATTTCATAAGACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAGAGAAATCCAGCAAGTCGGAGCTGCTCATGACACATCTTACAGGTTCTTCATTTTTCCCGACTTATCTATGTGCACCTTGACCTGTAAATCGTGTAAATTTTGAGACACTCTGTAACCAGTTGTTCTATAAGAACGTCCTTGATATTCCCTAGCTCGTCTGTGGAACCTGGATAAAGACTCAGCCAAGTGGATAAGTTCTTATAGGGGATTCGTTATAGTAACTCCTAACGCAGTAAGAAACTTTGATAATGGATCGGCGCACATGATGGATGGAAAGTACAGTCCTGAAGAATGGTGCTAGGTGTGAGATACTTATTCTAACTGTTTCAATTGTTATATGCATCGGTTATTGTTCGATTGGTTTACATGTTGACGCAGAGTCGTAAGAAATGTTCGTGTCAGAAAAACACGCGATGAATGTATTCGTAAAGTGCTTTTAAACTATGCTCAAAGTATTGGCATTCAATTCAAACAAATTTTCAGAGTAGTGAACTGTTTAGGTGTGGAACTTCAAAAGTTCAAGTCCTCGCACATGCAGAGTGCTAACTAATCATTGCAAAACTATGAGGGCTGTACCTGACCTGAGCCAGGCGTTCATTCGTCTAGTCTACGAGTTTTTCGCATCATGGTTTCACTAGAATGCTGTCCCTCAAGTAATATGCCTCTCACTGTTGTCCGAAGTGTTCAATCCTGTAAGGTTGCAGTGCACTATTATATAAGGATTAAAGCAGTAAACTTACGCATGTTCAATTTGTAAATACGCTCTCGGCAACTAACAACGGAGGCTCCTTTGTGGACAGAATTCAAGAACCACCAGCTGCCGTTAGCACGCATCAAGAAAATTATGAAGTCAGATGAAGATGTGAAGGTGAGAATTTCGGTTCCCTACTCCTCATGTGTTAGATAAAGTATTGAATACCTCTTGGACGAAGAAAATGTTAAGCTGAAAACTACTAGAACCGTAAACTTCTGTGAAGAAACTCCAGTGTTGTTGCGTCGGCAATATTTTGGCAGTAGGGTATTGAATTGGTTCGATGAAGTAGTAGCATGAGTACACGAACAACATTTTTCAGACCCCCATTTGTAGGTTATCACCAGCGGACTCTAGTTTGTGTATTTTGTAAGTGCAGATCTTCTCGTAAAGCATAATCGCTCCTAAATGCATAATTTGATTCCGCTGTTACTGCGACTTAAATAATTGTTTCGGAGCTGGGGATCCGAATCATATACTATATCATTGTGACACAAGATTCCTATGTCTGTTCTTTGGCAGATGATTGCAGCTGAGGCTCCAGTTCTGTTCGCGAAGGCATGTGAGATGTTTATTTT12AGAGTTGACTTTGCGGTCATGGATTCACACAGAAGAGAATAAGAGGCGTACACTACAGAGAAATGATATCGCTGGAGCCATAACCAGGGGTGATATCTTTGATTTTCTCGTGGATATTGTTCCTCGCGATGAGCTCAAGGTATGTTTCAAAAATCTCAGAGGGGTTATGATCATCCATCGTTCTCAAAATCTTTTAGTCTGGGGTTGACTTGTTGTGTATTGGTTGGGCCTTTATCTGGGGTTCCATATCGTACATGCGATTCTAAGAACGAAGAATATTCTTGGATTGCGCAAGGGTGCGAATTGGTAGGGATGGTTTTATAAATAATTTGGTAGCACAGAGTGCCATTTAGCTAGACCTTACCTTCAGGTTTGGAGATCATAGTCATGCTGGAAAAAGTGTTGTACTGCTTGAGAAGGAAAGAAAATAAGTGTAAAACAGCATTATTGTATAGTACCTAAATGTACCATTATAGAATTTGAGTGTCAACTTATGGAACAACAGGAGTTTTATATCAGTTGACACCATTGAGACGGCTGCTTCAGAAAGTGACTTTTGAGTCACCTTAAAGTCTTTTACTTCTCCTTGAGAGTCTCTGCCTTGTTATGTGAACGCGTCATTGATATGAAATGGTCATTGCTCTCAGGAAGAGGAGACAGCAGTACCTTGGTCTGGAGGTGGAGGGGAGCAGGTTCAGTATGGAGGCATGTTTTACCCTTCAATGCCACCACAATCCGTGCATTATCCTATGGGGGCTCCTGTAAGTATTTATTGGTTTGTGCTGGAAAGTAGAGAATATAGCAAAAAGTGTTTCTCTTGTTGTACTCAAACAGCGACCGAAATTGGAATTGGCTTGGTTATTTCAACACGTATCTTGCATTCCTGGAAAGAGAAACTATTGAGAAAAGGTTCTTCTCTGCGTGAGCATGCTCTCCTGCTTATCTATCACAGCAGTCAGGTTTTTAGTTTCGGTGAGTCTTCAGCGTTCACCCCTAAGCCAGTGAGTCTGATTTTGCTTGTGTACATCTCTAGAGTTTGTTTTGTTGCAAAAGTAAAATTTTGATGTCTTGTGTGCAGGATGTGATGGTGGTACAGTCTACAATGCCTTCTAATCAGCCATCACTGTATGCAGCGAATCAGGTATTGCCTATTCTTGAGATGCAGATGCGTTCAACTACTGTTAACTAAGCAGAGATTCTGAACAGAGACTATGAGAAATTGCGTAGTATTATTATGCCTTGTAGATCTTGGAGGAGTTGCAGTGGGTAATATTAACAGATCTTGCTTCCGTATATGCAGCAAGGAGACATGCAGTAGCATCCATGGACTATTGGGAGGAGAAAAATAAGTAGTCCTGGTAGGAAAATGTGTAAAATCCCTTTTCATTTGTTCTTTTGGAAACGGTGGTTTGCAAGGGAAGGTAGCATGCTGCAAACTAATGGATGAATTAGCCATCGATGCAGGTTATCTTCCTACACAACTAGGGAGTTACACTGTATTAAGATGCCCTCTGTATATTGGCTTCACACCATTTTTTCCTTTTTGTGTACAT該基因的cDNA序列如下SEQIDNo.2:ATGAATCTACCGCGGGGTAAGTTCCAGCGGGGGCAAGTTAAACCCGAAAGGTGGGCCAATGAGAGGTCGCCATGTGTCAGCAGCAGAGTTCTCCACAGAACTGTCTTTTGTAGGGCTCATCGCCTTCGCGCGCATCAAGATGCCGACACGTATGGTGGTTCCAATGGCGGTGGTATGGCTGCATGGTCACATAGCTCCAGCATGCATGGGGCCATGGCCATGCGGGCACTCGCGGGCTCATTCAACCGGGAGTTCGCTGGTGCAGAGGTGTGGAGAGAGAGCTTGGCAGCAGCAGTAGCGATGGCGTCGAACCAGCATGGACTTGCGTCTCTTTCCTCTGCTAAACCACAATCCAGCGCCGGAGCTACTACTACGGCGCAGCAGAGTTTCCAGCAAGGGAAGCACCAGATGCAAGGGCAAGGACAGATGAACTCGCACATGCAGCACCAACAGCTGCAGATGTTTTGGCAGCAGCAAAACCAAGAAATGGAGCAGTTAAATGAGAAATCCAGCAAGTCGGAGCTGCTCATGACACATCTTACAGAATTCAAGAACCACCAGCTGCCGTTAGCACGCATCAAGAAAATTATGAAGTCAGATGAAGATGTGAAGATGATTGCAGCTGAGGCTCCAGTTCTGTTCGCGAAGGCATGTGAGATGTTTATTTTAGAGTTGACTTTGCGGTCATGGATTCACACAGAAGAGAATAAGAGGCGTACACTACAGAGAAATGATATCGCTGGAGCCATAACCAGGGGTGATATCTTTGATTTTCTCGTGGATATTGTTCCTCGCGATGAGCTCAAGGAAGAGGAGACAGCAGTACCTTGGTCTGGAGGTGGAGGGGAGCAGGTTCAGTATGGAGGCATGTTTTACCCTTCAATGCCACCACAATCCGTGCATTATCCTATGGGGGCTCCTGATGTGATGGTGGTACAGTCTACAATGCCTTCTAATCAGCCATCACTGTATGCAGCGAATCAGATCTTGGAGGAGTTGCAGTGGGTAATATTAACAGATCTTGCTTCCGTATATGCAGCAAGGAGACATGCAGTAGCATCCATGGACTATTGGGAGGAGAA磁TAAGTAG其編碼的蛋白質的胺基酸序列為SEQIDNo.3:顧LPRGKFQRGQVKPERWANERSPCVSSRVLHRTVFCRAHRLRAHQDADTYGGSNGGGMAAWSHSSSMHGAMAMRALAGSFNREFAGAEVWRESLAAAV細ASNQHGLASLSSAKPQSSAGATTTAQQSFQQGKHQMQGQGQMNSHMQHQQLQMFWQQQNQEMEQLNEKSSKSELLMTHL14TEFKN緣PLARIKKIMKSDE薩MIAAEAPVLFAKACEMFILELTLRSWIHTEENKRRTLQRNDIAGAITRGDIFDFLVDIVPRDELKEEETAVPWSGGGGEQVQYGGMFYPSMPPQSVHYPMGAPDVMVVQSTMPSNQPSLYAANQILEELQWVILTDLASVYAARRHAVASMDYWEE認K屍p他/7fe-力'Ae基因的Real-timeRT-PCR分析利用real-timeRT-PCR方法研究了屍p泡/fe-"le基因在冷馴化過程中的表達變化。1)RNA提取和反轉錄利用RNA反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄。試劑盒使用TaKaRa公司的RNAPCRkit，參照試劑盒的說明書，以試劑盒提供的反應體系進行反轉錄反應。2)預實驗反轉錄產物稀釋10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用HSExTaqDNApolymerase,進行PCR反應。PCR反應條件如下94°C2min94°C30s61°C30s72°C20s30個循環20°C5minPCR反應產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇反應產物專一，沒有二聚體等雜帶的樣品進行下一步定量PCR反應。3)定量PCR反應利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit進行螢光定量PCR反應，引物序列見表2.2。PCR儀使用CorbetResearch公司的RotorGene3000Rea:L-TimeThermalCycler。實驗結果利用軟體Rotor-Gene6.0(Donaldetal.,2005)以及Excel7.0進行數據分析處理。採用Pp-actin3基因作對照，屍p〃邵fe-"Ae基因的上遊引物序列為ATGAATCTACCGCGGGGTAAGTTC;下遊引物序列為GCGAAGGCGATGAGCCCTAC。4)標準曲線的生成將預試驗的PCR產物按照10倍濃度梯度進行稀釋，選擇1/1,000，1/10,000，1/100,000，1/1，000,000濃度的稀釋產物作為標準品模版，進行螢光定量PCR反應。通過這四個標準品生成的反應數據，軟體Rotor-Gene5.0根據反應的螢光實時監控數據和標準品的濃度關係，生成標準曲線(參見圖2，轉錄本12)。低溫誘導表達特性說明了〃a;^a-7iAe基因與小立碗蘚的低溫抗性密切相關。小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpHap5a-like及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和細胞系<歸3〈210〉1<211〉4073〈212〉腿小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)〈400〉1aaaaccatacaat111aaaaaacccgsaagctgtcttttgc譜tggcggtgcgggcactgcttggcagcctaaaccaca3gC3CC3ggtatggttgtatttt犯tgcattgtgatggttagttgagaatgtgtgggtggccaacagctgagaaacc3ttgtcgtctcggctcatttcatgc犯gtcggagtgcaccttg6tg犯cgtcctgataagttcttggatcggcgtacttattctttgacgcagaagtgcttttagaactgtttaatcattgcasacgagttttttgttgtccgaagts犯cttatttgtggeicagtcagatgaa城tg犯tacctgtg8agaagttcgatgaatatcaccagctcgctcctaactggggatccgcagatgattagagttgactaaatgatatctcctcgcgatttctcaaaatgttccatatcgaattggtagttaccttcagaaagaaaatatgagtgtc肪CttC3g幼3gcttgttatgtcagtaccttgcaatgccacctgctgg犯agaaattggaattg柳雄ggtttttagttttgtacatctctgtgatggtgggtattgcctgaacagagaccagtgggtaatccatggactattgaaaaaa3catg犯tat3ctcac犯caaaaaagtaccgtgggcc組tagggctcattggtstggctcgcgggctca3gC3gt3gCgatccagcgccgagcgcgtcactctctctcattctagagttgcgttttggtttaggaggttttttgtgtgtcagatgttttctttccttcggtgattctgaaagacgttttgctgctcatg3cctgtei犯ttgatattccct由ggggatcacatgatggaactgtttcagtcgt犯g犯肌ctatgctcggtgtggaac犯ct3tgaggcgcatcatggagtgttcaatcgcatgttcagaattcaagsgatgtgaaggctcttggacgactccagtgtgtagtagcatggactctagtatgcataattg33tC3t3tagcagctgaggttgcggtcatgctggagccagagctcaaggcttttagtctgtacatgcgaggatggttttgtttgg卿tagtgtaaaaccttatggaactgacttttgagaacgcgtcagtctggsggtacaatccgtgtggcttggttttcttctctgcggtgagtcttagagtttgtgtacagtctaattcttgagatatt犯cagaattgggaggaataaaataatattgtgatgaatgaatctacg卿ggtcgccgccttcgcggcatggtcacttcaaccgggatggcgtcgaggagctactattgcaggaggcaggaggcgttttttcagtttt卿ggagggctgactagt3gatgc犯ggggcagcagcatgagtacatattgttatttttnnttutacacatcttacgtgt犯atttagctcgtcttcgttatagtatggaaagtaattgttatatatgttcgtgtaasgtattggttcaa犯gttgctgtacctgtttcactagacctgtaaggtatttgtaaataccaccagcttgagaatttc肌g犯aatgttgttgcgtcggagtacacgattgtgtattttgattccgctctatatcattctccagttctggattcacactaaccaggggtatgtttcaaggggttgactttctaagaacataaataattcatagtcatgagcattattgaacagg3gttgtcaccttaattgatatga^ggaggggagccattatccta8tttc犯caccgtgeigcatgtcagcgttcatttgttgcaacaatgccttctgcagatgcgtgcgtagtattcttgcttccgttgtcaataaaatttccaacaccagattccgcggggtaacatgtgtcagcgcatcaaga3tagctccagagttcgctggaccagcatggctacggcgcaggagg,tggactagtgatttttggattttggaggtgctgcacaactctgcaaggacagtgaacatgtgtaac3agagttmttttttcaggttcttcttgagacactgtgg犯cctgaactcctaaccagtcctgaagcatcggttacattcaattccaagtcctcgacctgagccaatgctgtccctgcagtgcacacgctctcgggccgttagcaggttccctactaagctgaaagcaatattttEicaeiceitttttgt33gtgC3gttactgcgagtgac3caaggttcgcgaagagaag8gaattgatatctttaaatctcagatgttgtgtatg犯g幼tattctggaaaaagtatagtacctttatatcagtagtcttttacatggtcattg3ggttcagtatgggggctccgtttctcttggtatcttgcactctcctgctcccctaagcctaatcsgccattcaactacttattatgcctgtatatgcagtagtcctggtttttatgtattacactctttgaattaacgcgUccagcggcagcagagtttgccgacacgcatgcatgggtgc卿ggtgacttgcgtctgcagagtttcatgagtccgttttggcctagctggaattatggtgaggcgactcgctgtgtatgaactcgcatggagcagtccgctttagggttcggtttttttttttccaatttttcccgctgtaaccaggataaagactgcagtaagaag犯tggtgctttgttcgattCgCgEltg33tcacatgcagaggcgttcatttcaagtaatatattatataac犯ct犯c犯cgcatc犯gatcctcatgtgactactagaaggcagtagggtcagacccccgatcttctcgcttaaataatattcctatgtgcstgtg卿a卿ggcgtagattttctcgggggttatgatggttgggcccttggattgcgagtgccatttgttgtactga犯tgtacc3tgacaccattttctccttgactctcaggaatggaggcatgtgtaagtattttgtactcaattcctggaaatatctatcacagtgagtctgttgatgtctttcactgtatggtt肪ctaagtgtagatcttcaaggagacaaggaaaatgttgg8g犯ttcC3tc犯tgcagcacc犯aaagggc犯gttaCtCC3C￡lga￡ltatggtggttgccatggccatgg卿gagactttcctctgC3gC貼ggg3catttggttctcatgcagg3gaatc3t犯ctttgaggttggtgtgmgtacettgcagcataaatggtgccttgcctctcgaattggcttgag犯3tccaacttatctatttgttctatacagccaagtgactttgataaaggtgtg卿ggttteicstggtattcgt犯tcagagtagtgtgctaactacgtctagtcttgcctctcacggattaaagccggaggctccaaat城g犯ttag3ta犯gccgta犯ctttattgeiattgatttgtaggttgtttcggagctgttctttgtgtttattttcactacagagtggatattgttcatccatcgtttatctggggcaagggtgctagctagacccttgagaaggttatagaattgagacggctggagtctctgcgagg3g3CElgttttaccctttattggtttgacagcgaccggagaaactatagcagtcaggattttgcttggtgtgcaggacagcgaatcacagagattctggaggagttgtgcagtagcagtaaaatccc60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220228023402400246025202580264027002760282028802940300030603120318032403300336034203480354036003660372037803840390017ttttcatttgttcttttggaaacggtggtttgcaagggaaggtagcatgctgcaaactaatggatgaattagccatcgatgcaggttatcttcctacacaactagggagttacactgtattaagatgccctctgtatattggcttcacaccattttttcctttttgtgtacat21092隨小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)3960402040732:atgaatctacgagaggtcgccgccttcgcggcatggtcacttcaiaccgggatggcgtcgaggagctactacaagaaatggtttattttagctacagagaagatattgttcgg3gggg3gCcattstcctaccatcactg"tcttgcttccgcgcggggtaacatgtgtcagcgcatcaagaatagctccagagttcgctggaccagcatggctacggcgcaactcgcacatagcagttaaa3g犯ccacc33g3tg3ttgCagttgactttatgatatcgcCtCgCg3tg3aggttcagtatgggggctcc3tgCELgCg犯tatatgcagcgtt固gcggc兆cagagtttgccgacacgcatgcatgggtgcag柳tgacttgcgtctgcagsgtttcgcagcaccaatg3g犯3tCCgctgccgttaagctgaggctgcggtcatggtggagccatagctcaaggaatggaggcatgtgatgtgatgtcagatcttg犯ggag3catgggc卿ttactccacagaat3tggtggttgccatggccactttcctctgcagc卿ggacEigctgcaga3gC朋gtCgggcacgcatcaccagttctgt8ttcac8cagacc鄉ggtggagg柳c站ttttacccttgtggtacagtgaggagUgcgcagtagcat犯cccga犯gctgtcttttgcc肌tggcggtgcgggcactgCttggC3gCctaaBCcacaagcaccagattgttttggcaagctgctcatagaa犯ttattcgcga鄉casgagaataaatatctttgacagtaccttgcaatgccaccctacaatgccagtgggtaatccatggactagtgggcceiattagggctcattggtatggctcgcgggctcaagcagtagcgatccagcgccgc犯gggc犯gC3gC犯犯Cgacacatcttgaagtcagatstgtg卿tggaggcgtacattttctcgtggtctggaggtacaatccgtgttctaatcagattaacagatttgggaggag<210〉3〈211〉363<212〉PRT<213〉小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)3MNLPRGKFQRGQVKPERWANERSPCVSSRVLHRTVFCRAHRLRAHQDADTYGGSNGGGMAAWSHSSSMHGAMAMRALAGSFNREFAGAEVWKESLAAA麗ASNQHGLASLSSAKPQSSAGATTTAQQSFQQGKHQMQGQGQMNSHMQHQQLQMFWQQQNQEMEQLNEKSSKSELLMTHLTEFKNHQLPLARIKKIMKSDEDVKMIAAEAPVLFAKACEMFILELTLRSWIHTEENKRRTLQRNDIAGAITRGDIFDFLVDIVPRDELKEEETAVPWSGGGGEQVQYGGMFYPSMPPQSVHYPMGAPDVMVVQSTMPSNQPSLYAANQILEELQWVILTDLASVYAARRHAVASMDYWEE腿6012018024030036042048054060066072078084090096010201080109權利要求1、一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpHap5a-like，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNo.1所示。2、一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因屍pVap5a-"'Ae，其特徵在於，其鹼基序列如SEQIDNo.2所示。3、權利要求l所述基因編碼的蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質的胺基酸序列如SEQIDNo.3所示。4、含有權利要求l所述基因的載體。5、表達權利要求1所述基因的轉基因細胞系。全文摘要本發明涉及生物基因工程領域，具體地，本發明涉及小立碗蘚抗低溫脅迫基因PpHap5a-like及其蛋白、和載體。所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQIDNo.3所示。本發明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術，可以利用該基因培育出優質的轉基因農作物，從而提高農作物的抗逆性。文檔編號C07K14/415GK101580840SQ20081011161公開日2009年11月18日申請日期2008年5月15日優先權日2008年5月15日發明者何奕昆,孫銘明,崔素霞,慧王,勇胡申請人:首都師範大學