方法

2023-07-19 10:17:01 5

專利名稱：：方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於鑑定針對疾病保護性和/或有效的T細胞受體(TCR)的方法。該TCR可用於鑑定能夠誘導保護性和/或有效免疫應答的疾病抗原或抗原決定簇。
背景技術：
：自從18世紀晚期就已知道疫苗接種的概念(給個體接種病原體衍生物質來誘導免疫)。由於種種原因，包括回復成野生型的風險，不想要使用活體減毒的或滅活的病原體的疫苗辦法。為了這個原因，已經對使用「亞單位」疫苗辦法感興趣，由此媒介或載體中僅僅包括病原體的關鍵抗原序列。為了開發亞單位疫苗，需要鑑定病原體中的關鍵抗原。複雜的病原體編碼大量潛在抗原(數百種至數千種)，而且這種複雜性阻礙系列測試方法來鑑定那些誘導保護性和/或有效應答的抗原。迄今，用於評估候選抗原是否具有在疫苗中使用的潛力的主要標準在於其誘導免疫應答的能力。換言之，注意力集中在那些加強最強免疫應答的抗原。然而，誘導應答與誘導保護不同。免疫系統是反應性的，而且在傳染性攻擊期間會響應大量抗原。不幸的是，大多數誘導的應答(尤其是在病原體是抗原性複雜的情況中)無法有效控制病原體。例如，能夠誘導有力的病原體特異性免疫應答且並非必然針對疾病保護性的疫苗候選物可能無法針對隨後的病原體攻擊提供保護(Melby等(2001)69=4719-4725；Hechard等(2004)53861-868；Stober等(2006)同上)。針對抗原性複雜的病原體的DNA庫(pool)疫苗的研究已經顯示僅有少量的疫苗候選物是保護性的，而且有些疫苗候選物實際上加重疾病(Stober等(2006)Vaccine24:2602-2616；Stemke-Hale等(2005)Vaccine233016-3025；Melby等(2000)InfectionandImmunity68:5595-5602)。當使用連續分級來篩選針對真菌病原體粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)的疫苗候選物時，自包含800-1000種基因的cDNA文庫鑑定出一種保護性基因(Ivey等(2003)4359-4367)。有趣的是，已經顯示對於抗原性複雜的病原體(例如寄生物)，保護性抗原定位於基因組內少量的基因座(Blake等(2004)Mol&BiochemParasitoll38143-52；Martinelli等(2005)PNAS102:814_819)。當使用免疫應答產生作為疫苗候選物的選擇標準時，可改進「應答」測定法來測定所謂的「正確」類型的應答(即與保護有關的免疫應答類型)，例如使用IFNy產生作為ThlT細胞應答的指示劑。儘管這些類型的策略用來減少所鑑定的抗原的數目，但是T細胞應答的基礎使得產生「正確類型的應答」的大多數這些T細胞在體內無效。此外，在許多情況中有效或保護性應答針對一個小子集的「所應答的」抗原，但是保護需要多於一種特異性的應答。因而，需要在針對病原體的免疫應答期間產生的有響應細胞的大組庫內鑑定有效3/保護性應答。還需要鑑定造成保護性/有效免疫應答產生的抗原。發明概述本發明人開發了一種體內辦法來鑑定保護性/有效免疫特異性。在第一個實施方案中，本發明提供一種用於鑑定針對疾病保護性和/或有效的T細胞受體(TCR)的方法，其包含下述步驟i)自供體非人動物獲得T細胞；ii)以使得至少一隻受體動物針對疾病受到保護但至少一隻動物仍然未受到保護的量將T細胞過繼轉移入多隻T細胞缺陷型受體非人動物；並iii)確定僅僅在受到保護的動物中存在的TCR。由於提供給受體動物的免疫組庫(immuner印ertoire)受限，因此隨後的感染引起克隆受限的免疫應答產生。換言之，與由具有完整組庫的動物產生的免疫應答相比，在接受受限免疫組庫的受到保護的動物中產生的免疫應答含有更大比例的保護性/有效T細胞。因此，由於減少了總TCR組合(portfolio)，使用本發明的方法有可能區分保護性/有效的與無保護性/無效的有響應T細胞，從而確定那些介導保護性/有效免疫的TCR。本發明的方法較體外篩選具有如下優點其完全聚焦於保護性/有效T細胞應答，而非所有抗原刺激的T細胞應答。因此，它提供針對疾病保護性和/或有效的TCR的無價fn息ο通過本發明方法鑑定的TCR可用於鑑定引發保護性和/或有效應答的抗原。TCR(或其序列)可因此用於篩選「相關」抗原序列。在第二個方面，本發明提供一種用於篩選能夠誘導保護性和/或有效免疫應答的抗原或抗原決定簇的方法，其包括下述步驟(i)通過依照前述權利要求任一項的方法鑑定保護性和/或有效的TCR；(ii)生成表達保護性/有效TCR的細胞；(ii)使用表達TCR的細胞來篩選候選抗原/抗原決定簇(iv)選擇受到保護性/有效TCR識別的抗原/抗原決定簇。抗原可衍生自病原體。或者，抗原可「模擬」病原體衍生抗原(或其一部分)，但在化學上是不相似的。在第三個方面，本發明提供一種製造亞單位疫苗的方法，其包括下述步驟(i)通過依照本發明第二個方面的方法鑑定一種或多種有效的抗原或抗原決定簇；(ii)將該抗原/抗原決定簇摻入亞單位疫苗。在第四個方面，本發明提供一種針對艾美球蟲(Eimeria)感染保護性和/或有效的TCR，其包含下述TCRVβCDR3序列之一FQPPQNFQVDQTPC(SEQIDNO.1)GADICAKTTPSLSFLPH(SEQIDNO.2)GQTSVQKPHPPLF(SEQIDNO.3)。在第五個方面，本發明提供依照第四個方面的TCR篩選能夠誘導針對艾美球蟲感染保護性和/或有效的免疫應答的抗原或抗原決定簇的用途。附圖簡述圖IA是闡明從首次用於實驗、響應和恢復的供體小鼠到T細胞缺陷型受體的淋巴細胞過繼轉移的保護效應的圖解。圖IB是顯示保護性TCR體內分析一般方案的示意圖。圖2是顯示用於尋找⑶4+細胞特異性及其TCR的方法的進度表。圖3顯示了接受300個⑶4+T細胞的TCR(βχδ)-/-小鼠的卵囊輸出。圖4顯示了FACS分析結果，證實了在轉移300個⑶4+Τ細胞後2個月在受到保護和未受到保護的受體小鼠中存在相似數目的CD4+T細胞。圖5顯示了從受到保護和未受到保護的小鼠到第二組T細胞缺陷型受體的細胞受限組庫連續過繼轉移的結果。圖6顯示了通過RT-PCR進行的TCRVβ分析。使用3隻受到保護和3隻未受到保護的小鼠進行一系列RTPCR。描述了RTPCR的實例(右圖)，並且以表格格式概況了結果(一個記號代表來自一隻小鼠的陽性產物)，在左側注釋Vβ。圖7顯示了來自3隻受到保護和3隻未受到保護的小鼠每一隻的TCR組庫的詳情。圖8來自3隻受到保護和3隻未受到保護的小鼠的TCRVβ4和TCRVβ14的TCRVβ⑶R3序列(胺基酸)的身份。圖9是顯示抗原鑑定一般方案的示意圖。發明詳述本發明的第一方面涉及一種通過從供體動物到受體動物過繼轉移有限數目的T細胞來鑑定針對疾病保護性和/或有效的T細胞受體(TCR)的方法。供體動物供體動物是一種在其完整T細胞組庫之中包含保護性和/或有效T細胞的動物。供體動物可以是首次用於實驗的動物(即之前未經歷疾病或抗原攻擊的動物)。供體動物可被處理以擴增循環T細胞數目。這可通過例如會引起合適的免疫系統刺激及相關的T細胞群擴增的處理程序或「疫苗株」得以進行。該動物可用疾病或與疾病有關的抗原製備物攻擊，這應當引起「特異性」T細胞擴增及提高潛在相關細胞在總淋巴細胞群中的比例。該動物可例如通過直接感染(如在實施例中所顯示的已用艾美球蟲病原體所進行的)或給予減毒生物體製備物或其它疫苗粗製備物來攻擊。優選地，該動物是「主動響應的」，即處於產生針對病原體或其抗原製備物的免疫應答的過程中。或者，動物可以是「恢復的」，即之前產生過針對病原體或其抗原製備物的免疫應答但不再主動響應的動物。如果合適的T細胞群被擴增，那麼這應當意味著有可能通過較少轉移細胞的過繼轉移對T細胞缺陷型受體賦予保護。還更容易找到僅有小比例(比方說10-20%)的受體動物受到保護的合適轉移細胞數目(TCN)。由於免疫應答的隨機特性，因此很可能在不同的供體動物中會產生不同的保護性/有效T細胞。如果期望確定儘可能多的抗原決定簇和/或保護性/有效T細胞特異性，那麼可選擇多隻供體動物。或者，如果目標在於確定(最小數目)造成免疫的TCR，那麼優選使用單只供體動物，以容許直接比較受體動物及避免系統過度複雜化。受體動物受體動物是「T細胞缺陷型」，即其不具有有效的內源性T細胞。T細胞缺陷型動物可以例如是TCR或RAG敲除、SCID或「裸」動物。有限數目的T細胞從供體動物轉移到受體動物。然後可給予受體動物T細胞擴增處理，例如感染(用活的或減毒的病原體或其製備物)或未表徵的疫苗製備物。複雜表達文庫也可用作疫苗用於擴增處理(1，20)。在給定一段時間(諸如1個月)後，用野生型病原體攻擊受體動物並在攻擊後適當時間評估抗性/敏感性。供體和受體動物可以都是人MHC轉基因的。動物可以是人I類和/或人II類MHC轉基因的。其具有這樣的優點，即存在證據提示T細胞應答的精確的肽特異性會更準確地表現人應答(即動物會響應與人免疫應答中相同的表位)。轉移的細胞將來自供體動物的T細胞過繼轉移到受體。T細胞可作為細胞群的一部分(諸如自供體小鼠獲得的細胞或組織樣品的一部分)轉移。可處理自供體小鼠獲得的細胞樣品以提高其響應T細胞或特定類型T細胞的比例。例如，細胞樣品可被為「正」(對於T細胞)或「負」(用於除去其它細胞類型)分選(例如通過FACS或使用磁珠)。T細胞可通過例如它們的TCR、⑶3、⑶4或⑶8的表達而得以選擇。轉移到受體的T細胞可代表來自供體動物的總T細胞的一個子集。例如，該群可分選⑶4+或⑶8+T細胞。如果已經知道一種或其它類型的應答與體內保護有關，那麼這可能是有利的。為了提高T細胞或潛在相關T細胞的比例，可離體刺激細胞群。轉移細胞數目(TCN)將自供體動物衍生的包含T細胞的細胞樣品轉移到受體動物。細胞樣品應當代表一個不完整或受限的T細胞組庫。該組庫應當充分受限以致於擴增的T細胞群(在隨後的感染或抗原攻擊後)以相對少量的有效/保護性TCR為主。保護性/有效TCR的數目(其可例如低於50、40、30、20或10個/受到保護的動物)應當足夠低至所有TCRVi^序列的測序在實際上切實可行。在本發明第一方面的方法中，可以以使得至少一隻動物針對疾病受到保護但至少一隻動物仍然未受到保護的量將T細胞轉移到受體動物。因此，TCN處於在基本上所有受體動物都將受到保護的情況中的轉移細胞數目和在非常小比例的將受到保護的情況中的數目量(意味著在用於實驗的動物數目中，可以不產生受到保護的動物)之間的閾。期望相對低比例的接受給定TCN的動物顯示受到保護的表型。這使造成保護的轉移T細胞數目減至最少並因此當鑑定單個TCR時簡化了圖像。例如，可選擇TCN使得至少1隻，但少於50%、40%、30%、20%或10%的受體動物顯示受到保護的表型。優選地，兩隻或更多隻受體動物受到保護，使得可以比較它們的TCR表達樣式。為了針對給定系統確定最適TCN，可進行有限稀釋分析。這樣，可以以不同的6TCN(例如介於10-100百萬個細胞之間)給予受體動物以供體細胞。然後可選擇導致例如10-20%的受體動物受到保護的TCN(或最低TCN)作為最適TCN。作為實施一個單獨的步驟來確定能賦予免疫的最小T細胞數目的替代，可以在小範圍的每一個TCN(例如100、300、1000和5000個細胞)用大量受體動物進行實驗。然後，取自給予保護所需要的最低細胞數目的受到保護的動物可直接用於確定保護性和/或有效TCR。「受到保護的」的定義會取決於疾病和動物模型而改變。一般而言，當與未受到保護的等同動物相比時，受到保護的動物會顯示降低的死於疾病的傾向，降低的疾病嚴重性，明顯的疾病症狀改善或降低的病原體負載。在艾美球蟲系統中，當與沒有接受細胞的TCR缺陷型動物相比其產生統計顯著的較少卵囊時，動物被認為是「受到保護的」。TCN可低於5000、1000或500個T細胞/受體動物。對保護性/有效TCR的分析為了鑑定針對疾病保護性/有效的TCR，確定在受到保護的動物中存在的TCR。這可例如通過比較在受到保護的和未受到保護的受體中表達的TCR來完成。可在離體分析之前刺激細胞，例如使用抗原粗製備物或活病原體。它們還可被刺激以提高CD4+或CD8+細胞的比例，或被分選以分離這兩個亞群(使得可以僅考慮一種細胞類型，或使得可以獨立考慮這兩種細胞類型)。可以自受到保護和未受到保護的小鼠收穫T細胞(諸如脾T細胞，或來自固有層、上皮內區室或腸繫膜淋巴結的T細胞)，然後通過PCR和序列分析對TCRVβ表達進行分析。從來自候選「保護性」TCR觀點看感興趣的TCRVii是在受到保護的受體中表達，但在未受到保護的受體中不表達或未被充分代表的那些。特別感興趣的是在一隻受體動物中(表明單克隆性)或在兩隻或更多隻受體動物之間(表明該TCRVii序列與受到保護的表型的一般關聯)僅顯示單一序列的TCRVii。TCRα為了鑑定完整的TCR，期望從與「保護性」TCRVβ相同的細胞分離TCRVa鏈。這可通過使用本領域已知的技術來進行，諸如使用FACS或利用Vβ特異性抗體的磁分選(通過νβ分子分析指示)，繼之以PCR來鑑定TCRVα鏈。如果TCRVa鏈難以分離，那麼TCRVβ可用於製備會與發育期間胸腺中各種TCRVa有關的轉基因動物。使用基於應答或保護的測定法，可自這些動物分離TCRVa鏈。或者，可使用包含已知TCRVii而不知TCRVa鏈的TCR轉基因。一種替代方法是進行T細胞的離體克隆，然後對所得克隆進行TCRVii篩選。表達TCR的細胞一旦知道了TCRVα和β，就可通過標準技術製造表達TCR的轉染子。例如，可將基因轉染入合適的受體細胞系以給出表達TCR的報導細胞。TCRVα和β序列(或僅僅是TCRVβ序列-參見之前章節)可用於製備表達TCR的轉基因非人動物。這些動物提供了用於抗原篩選的細胞來源。另一項選擇是使用自受到保護的受體動物衍生的原始細胞，TCRVii序列就是自它衍生的。例如，初始原種可用於製備T細胞雜交瘤，以獲得穩定的表達TCR的細胞系。抗原篩選在第二方面，本發明提供了一種篩選在誘導有效/保護性免疫應答中有效的抗原或抗原決定簇的方法。在適應性免疫應答中，T淋巴細胞能夠識別自蛋白質抗原衍生的肽。抗原呈遞細胞(APC)攝取蛋白質抗原並將它們降解為短肽片段。肽可結合細胞內部的主要組織相容性複合體(MHC)I或II類分子並被攜帶至細胞表面。當與MHC分子一起在細胞表面呈遞時，肽可為T細胞(通過T細胞受體(TCR))所識別，在這樣的情況中該肽是T細胞表位。該篩選方法可用於確定為保護性/有效TCR識別的表位。或者，該篩選可鑑定包含所識別表位的抗原(或其一部分)，無需精確地限定表位自身。抗原決定簇是造成T細胞活化的抗原的一部分。該篩選可用於鑑定例如複雜抗原混合物(其可被分級)、表達文庫或基於組合化學的肽文庫(以尋找模擬肽)中的候選抗原。疾病本發明的方法可用於任何如下疾病(i)疾病的合理動物模型存在，和(ii)T細胞特異性是疾病過程的有效部分。所有能適應動物系統的傳染性、變應性、自身免疫性和腫瘤疾病對於該系統都是合適的靶標。在此使用的術語通常適用於傳染病。然而，正如對於本領域技術人員清楚的是，將該系統應用於其它疾病(諸如變態反應、自身免疫等)可能需要使用替代的(但類似的)術語。例如，在傳染病抗原可衍生自病原體的情況中，對於變態反應，其可以是變應原，而對於自身免疫病，其可以是自身抗原。針對的人傳染病包括單純皰疹病毒(HSV)衣原體(Chlamydiaspp.)巨細胞病毒(CMV)呼吸道合胞病毒(RSV)單核細胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)白色假絲酵母(Candidaalbicans)分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)利什曼蟲(Leishmaniaspp.)皰原蟲(Plasmodiumspp.)鞭蟲(Trichurisspp.)隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)鼠弓形體(Toxoplasmagondii·)。術語「保護性」用於表示抗原引起的或T細胞介導的是針對疾病提供保護或針對疾病有效的免疫應答。因此該效果可以是預防性的、治療性的或兩者皆有。方案一般方法概述於圖9中。該圖描述了鑑定針對一般病原體的保護性和/或有效T細胞的情況，但可修改該方法以鑑定實現變態反應、自身免疫性或腫瘤排斥的T細胞。第1階段建立「保護性/有效單位」最佳的第一步是確定能在擴增階段後賦予免疫性的最小T細胞數目。這通過有限稀釋過繼轉移來實現。該階段可省去，處理時間受限於以100、300、1000和5000個T細胞的細胞轉移數目使用大量受體小鼠執行實驗，並自給予保護所需的最低細胞數目取出小鼠。其目的在於使用保護大約10%受體小鼠的細胞數目。根據傳染系統及自供體小鼠取出細胞的時間，實際的細胞數目可不同。對於大多數感染，文獻中早已確定了T細胞轉移最有效的時間，但是如果不可得的話，那麼可容易地通過用大量細胞(例如IO7個細胞)進行實驗性轉移來確定。每次實驗使用單一供體小鼠是最有用的，原因在於在不同的個體中免疫誘導的隨機特性會產生不同的保護性/有效T細胞克隆。實際上，該技術不是用來確定能給出效果的每一種T細胞特異性，但是會確定免疫所需的最小T細胞受體群。對於該技術而言，這是一項重要的額外益處，因為其會確定成功的亞單位疫苗中需要包括的特異性(及抗原)數目。其它有用信息可包括關於CD4+或CD8+T細胞應答在效果(例如保護)表達中的相對重要性的先驗知識。該信息通常可獲得自文獻，但並不是本研究的先決條件。此分析的價值的一個實例是通過在過繼轉移前分選細胞或通過在受到保護的動物鑑定後分選細胞，將分析限制於最有效的細胞子集。後一種辦法可能耗時更多，但能從CD4+和CD8+細胞中鑑定有效TCR。在這些細胞子集之間的相互作用複雜的情況中，有效的最小組庫可能比基於這兩個細胞群的組合頻率選擇單一細胞群的情況要大。在這些情況中，分析可能需要更多的測序工作。下遊抗原鑑定受表達有效TCR的T細胞類型影響並代表其它附加價值。第2階段在受到保護和未受到保護的動物中界定受限組庫從主動響應的供體小鼠中取少量的T細胞並過繼轉移到T細胞缺陷型受體小鼠(例如ΤΟΚβχδ)-/-或RAGl-/-或裸鼠或SCID小鼠)中。給予小鼠以T細胞擴增處理，可以是感染(如上所述用減毒病原體或藥物處理方案)或未表徵的疫苗製備物。在合適的一段時間(例如大約1個月)後，用野生型病原體再攻擊受體小鼠並在攻擊後適當時間評估抗性/敏感性。通過個體與沒有接受T細胞的一組10-20隻小鼠(真實數目將取決於病原體或其它系統)的統計比較來評估保護。10%-20%的動物展示針對感染的保護，則轉移T細胞數目是最佳的，因為這容許鑑定賦予大比例T細胞完整但未受到保護的小鼠以效果/保護的最小T細胞群。所需要的受到保護的小鼠的數目取決於保護性和/或有效組庫的特性，但不太可能超過10-15隻小鼠個體(使用艾美球蟲系統時，此分析在一次實驗中有可能用到低至3隻受到保護的小鼠)。第3階段分析保護性和/或有效TCRVii組庫此分析階段包括從受到保護的和未受到保護的小鼠收穫脾T細胞，如果合適的話，可通過磁分離成⑶4和⑶8子集用於進一步分析。細胞分成三組；一組通過在RLT或類似的緩衝液中破裂進行加工，用於分子分析，第二組在液氮中冷凍，用於可能的下遊分析，而第三組連續轉移入T細胞缺陷型小鼠「停放」(用於將來驗證「保護性」表型)。通過FACS分析評估來自每隻小鼠的小等分量的細胞以確定在每一隻受體中存在的T細胞的比例。分子分析將破裂細胞的樣品以等分試樣冷凍保存。使用寡dT和/或T細胞受體恆定區引物製備多批cDNA。對這些cDNA樣品使用設計成擴增每種鼠TCRVβ-TCRCβ產物的引物通過PCR評估不同TCRVii的存在並通過瓊脂糖凝膠電泳顯影。將陽性PCR產物克隆入TEasy質粒並用於轉化合適的大腸桿菌菌株，然後鋪在合適的選擇性培養基上。最初，挑取20個陽性細菌菌落並使用合適的引物(例如TCRCii引物)獲得插入物的序列。對所有「受到保護的」個體及對挑選的(優選至少6隻)「未受到保護的」個體進行初次分析。此序列數據確定了在受到保護和未受到保護的個體這兩個群中都存在的T細胞克隆的身份。細胞分析使用來自分子分析的信息來獲悉用在隨後的細胞分析的最好策略。細胞分析的目的在於分離與所鑑定的TCRVii鏈在同一細胞中的TCRVa鏈。例如，在保護相關TCRVii是單克隆的或以單個克隆為主的情況中，可對來自連續轉移「停放」細胞或冷凍原種的細胞進行FACS或用Vβ特異性抗體進行的磁分選。細胞分析還可包括快速克隆「保護相關」T細胞，通過PCR來篩選正確的TCRVβ，然後使用此樣品來鑑定TCRVα鏈。用於細胞的刺激取決於所考慮的細胞類型(CD4或CD8)及所考慮的病原體。這包括用抗原粗製備物或活病原體離體刺激。具有TCR的兩條鏈使得能產生帶有在實驗中分離的正確TCR的轉染子。這些代表了基於已知的給予保護的能力的靶向篩選。更詳細地Va鑑定1.樣品在淋巴細胞群(脾、淋巴結及可能的其它免疫組織)樣品收集時，細胞可分成三個樣品組，第一組用於TCRVii分析，第二組在液氮中冷凍，用於隨後的復甦，而將第三組連續轉移(停放)入別的受體動物中(該第三組是任選的)。在已鑑定了保護性TCRVii組庫之後，通過分析樣品2和3幫助鑑定TCRVα的方法。2.Va分析一旦知道保護性TCRVii，則可使用TCRVii家族特異性抗體通過螢光激活細胞分選術(FACS)分離冷凍的或「停放的」細胞，從而提供受限的起始細胞群。如果「保護相關」TCRVii序列的數目是低的(<3)，那麼有可能使用引物來鑑定所有與該群體有關的TCRVa，並使用隨後的配對轉染法來鑑定合適的TCRViiTCRVa配對。或者，可通過FACS來分選合適的TCRVii+細胞並作為單細胞沉積入微量滴定板的孔中。然後可通過單細胞RTPCR來直接分析細胞，或者通過抗原特異性觸發或非特異性刺激諸如板結合的抗CD3或促分裂原來擴增細胞。可通過傳統的T細胞克隆方法來擴增細胞(最佳地，使用自T細胞缺陷型動物衍生的抗原呈遞細胞)。通過經典的克隆及在混合的抗原製備物上體外維持而衍生的T細胞可直接用於抗原篩選(見下一節)。該分析起始於從克隆孔(單細胞或單克隆擴增)中鑑定合適的TCRVβ序列；這可能需要多於一輪的PCR，尤其是單細胞。第一輪RTPCR和PCR可包括使用TCRVa、TCRCa和TCRVi3、TCRCi3序列中保守的、簡併的或特異性的引物，或基於單條引物的線性擴增(3，5)或類似方法來產生足夠產物用於隨後PCR反應分析(6，21)。一旦鑑定了合適的細胞，則RTPCR法可用於鑑定自同一細胞衍生的TCRVα序列。TCRVα分析的第一步是通過標準技術來擴增TCRVa(該擴增步驟可以與TCRVβ擴增同時進行)。在表達「正確的」TCRVii的細胞中存在的TCRVa的身份可採取簡單PCR辦法的形式，其使用簡併的或特異性的引物，例如那些之前描述的(3，5)。或者，可設計別的TCRVa引物並應用於該分析。可將PCR產物克隆入合適的載體中並用於轉染大腸桿菌，之後使用標準的DNA測序方法對多個菌落中的質粒測序。一種替代的辦法包括最初鑑定在線性或非特異性擴增樣品中存在的正確的TCRVa或TCRVii，這使用包括將樣品應用於固相結合的TCRVii特異性寡核苷酸並檢測結合的樣品的方法來進行。該檢測系統可包括在擴增步驟中摻入生物素化核苷酸或以其它方式標記的核苷酸並使用酶的、基於螢光染料的或其它類似的技術進行檢測(例如9，12，17，29)。一旦鑑定了正確的TCRV家族，則特異性PCR引物可與原始樣品的等分試樣一起用於產生TCRVα或TCRVβ⑶R3序列，然後可對序列直接測序，或者將其克隆入合適的載體中並轉化入大腸桿菌中，之後進行菌落選擇和測序。可將TCR轉染入任何會在抗原呈遞至轉染的TCR後導致發信號的報導細胞系統。可通過標準技術來實現TCR轉染(2，4，7，13，18，25，30)。受體細胞可以是雜交瘤(11，14)，或胸腺瘤(諸如來自ATCC的s49.1胸腺瘤)。如果受體細胞是⑶4-ve和⑶8-ve(諸如D011-10的TCR缺陷型衍生物)，那麼⑶4或⑶8需要靠含TCR的載體轉染(25)。業已使用逆轉錄病毒載體證明了轉染的TCR的功能性(23)。轉基因動物如果TCRa鏈更難於分離，那麼可使用TCRVβ序列來創建表達合適的TCRVβ的轉基因小鼠，並且這些會在轉基因小鼠的胸腺中在發育期間與TCRVa相結合。在TCRVβ基因座處運轉的等位基因排斥現象會戲劇性地限制內源性TCRVii表達，並且可從這些小鼠中分離合適的TCRa鏈或者細胞可具有保護性/有效能力，而不知TCRVα鏈。在後一種情況中，可直接使用來自TCRii轉基因小鼠的細胞。可用標準轉基因方案(10)或使用製成將轉基因靶向TCRii基因座的敲入系統的ES細胞(8，19)來產生轉基因動物。最終的報導系統可以以TCRa和TCRi^鏈雙重轉基因形式製成並在RAGl-/-或RAG2-/-背景上回交。與RAG-/-回交是有利的，因為儘管在TCRii基因座處發生等位基因排斥，但是其不會在TCRa基因座處發生，因此沒有這種背景(其停止了所有TCR和Ig重組)，內源重排的TCRa可能會成問題。保護性/有效T細胞群鑑定的體內確認為了檢驗T細胞的鑑定和保護性/有效能力，可進行來自之前鑑定的「受到保護的」和「未受到保護的」個體的細胞的連續過繼轉移。該方法基本上如為使用蠕形艾美球蟲(Eimeriavermiformis)所描述的來進行。簡言之，將細胞從所有受到保護的和一些(3-6隻)未受到保護的小鼠轉移到至少5隻受體小鼠中，然後用病原體再攻擊以在平行分子分析下評估持續的細胞效力。這些動物中的細胞還可用作在之前章節中概述的細胞研究的材料來源，並代表了另外的擴增細胞群，其可提供用於通過平行分子分析鑑定的下遊研究的存檔材料(冷凍細胞、DNA和RNA)。已知的保護性/有效TCR基因作為抗原篩選的用途該系統的目的在於鑑定與保護或效果有關的T細胞受體，從而容許實質性精煉對合適抗原的下遊搜尋。TCR的分子鑑定容許創建T細胞轉染子或產生TCR轉基因動物，作為用於標準抗原篩選的細胞來源。具體的系統取決於所研究的病原體/疾病及T細胞子集，但基於在刺激T細胞的抗原的學術性和商業性篩選中常規使用的技術。非常簡單的說，該系統使得篩選能鑑定用於在疫苗或免疫治療計劃中包括的合適且有效的抗原。該篩選可包括分級複雜抗原混合物，使用表達文庫或使用基於組合化學的肽文庫(在此情況下尋找模擬肽)。更詳細地抗原篩選1.TCR識別為了確定TCR識別哪種抗原，需要由合適的MHC分子來呈遞抗原決定簇(通常是肽，但可以是修飾的肽或甚至基於非肽的模擬物)。TCR在T細胞或另一合適的細胞諸如轉染子(見上文)上表達，並且活化測定法可用作報導系統(例如測定細胞因子生成)。一項考慮是呈遞至TCR需要的呈遞途徑。對於大多數TCRaβT細胞，TCR限於MHCI類(CD8+T細胞)或MHCII類(CD4+T細胞)。MHCI類呈遞途徑呈遞自胞質溶膠衍生的內源加工抗原，而MHCII類途徑呈遞自細胞外部衍生並在專門化的內體中加工的外源抗原。就有些細胞類型諸如樹突細胞而言，可發生一種稱為交叉敏化的現象，藉此外源抗原駛入內源途徑中並加載到MHCI類上。對於大多數應答檢測T細胞測定法(或TCR識別)，抗原需要由合適的抗原呈遞細胞經正確途徑呈遞到響應T細胞。對於⑶8+Τ細胞，抗原經胞質溶膠途徑呈遞入MHCI類途徑中。這可通過將抗原編碼序列轉染入表達正確MHCI類分子的靶細胞中以實驗來實現。由於幾乎所有細胞都能經MHCI類呈遞途徑加工，因此靶細胞的選擇是廣泛的(只要應答細胞被恰當武裝來應答即可(可能需要考慮多條招募幼稚和響應T細胞的規則))。CD8+T細胞可通過細胞因子生成、細胞表面標誌物改變、細胞分裂或殺死靶細胞能力得以測定。這可能類似於或涉及轉染子或雜交瘤系統中還可包括合適的標誌物/報導系統的其它系統。通常，TCR轉染子或T細胞雜交瘤就好像它們業已部分活化且具有較不嚴格的活化要求(例如無需預敏化)的那樣運轉。用於篩選⑶8+Τ細胞相關TCR的方法可包括例如a)在具有正確的MHC的細胞中建立潛在抗原的胞質溶膠表達文庫(可通過轉染至靶細胞來提供)。b)使用來自靶抗原的肽(可以是預測的或隨機重疊的)，然後用於脈充帶有正確MHC的細胞，以這樣的一種方式將肽置換到表面表達的MHC上。c)在具有可溶性重組MHC分子的環境中使用肽(通常以多聚體試劑例如四聚體形式存在)，然後可通過TCR驅動的功能或通過FACS來測定(四聚體試劑可以這樣使用)。四聚體可涉及來自隨機庫的重摺疊測定法，之後與帶有克隆TCR的細胞起反應並接著被分離，再衍生肽，並通過蛋白質測序方法和/或質譜術來確定肽的序列。d)使用肽負載或可溶性MHC方法並聯合組合肽文庫(這不會找到病原體肽但能找到模擬物)。e)使用添加到合適細胞(例如DC)的全抗原，這可介導交叉敏化並在MHCI類途徑中呈遞(這樣用於篩選MHCII類響應細胞的方法可適用於MHCI類)(例如見下文方法)。用於篩選⑶4+T細胞相關TCR的方法可包括例如對於⑶4+T細胞相關TCR，抗原通常由MHCII類途徑呈遞，並且如果涉及細胞，那麼該細胞需要表達合適的MHC(可通過轉染來改造)且應當具有合適的途徑用於以結合MHCII類的形式(在全抗原暴露的情況中)保存抗原。a)可使用一系列標準的分子分離方法包括層析(例如陰離子交換)、凝膠過濾、製備性電泳或其它分離方法來分離來自病原體各階段的蛋白質製備物。然後將抗原製備物的級分應用於合適的抗原呈遞細胞，並通過暴露於表達感興趣TCR的細胞(很可能還需要⑶4+)來評估應答。b)創建能分泌感興趣抗原的克隆表達文庫，並接著可在使用合適的抗原呈遞細胞(APC)和報導細胞的測定法中測試上清液。c)在自表達抗原的克隆獲得裂解產物的情況中，創建克隆表達文庫，然後將這些作為外源抗原應用於APC和報導細胞。d)使用具有合適的MHCII類結合特徵的組合肽文庫。e)使用肽預測來鑑定來自病原體基因組內的潛在的肽，合成肽並使用MHCII類+APC和報導細胞進行篩選。f)使用具有物理連接至MHCII類分子(2)的肽文庫(15，22，24，26_28)使系統適應人源化小鼠上文概述的研究容許鑑定已知的保護性/有效T細胞受體及鑑定已知有效地刺激這些T細胞的抗原/肽。保護的生物學是這樣的以至於多種特徵決定任何抗原行使保護的能力。這些包括在適當時候於病原體中表達，對於免疫應答的可得性及免疫應答加工並呈遞抗原的能力。雖然抗原生物學的許多方面通過該核心技術得以解決，但是此系統的一個方面可通過構建兩種表達人MHC組分以代替鼠MHC組分的轉基因小鼠加以改進。近來已表明(Pajot等(2004)EurJImmunol34:3060-9)當在缺乏內源性MHC分子的情況中小鼠表達人MHC分子時，應答的精確肽特異性與在具有那些MHC分子的人應答用C型肝炎病毒攻擊中所見的相同(並不僅僅在相同的抗原方面)。人源化系統需要的兩種小鼠品系是⑴在小鼠MHCI和II類缺陷型背景中具有人源化MHCI和II類的供體小鼠；和(i)受體小鼠，與供體相同，但處於T細胞缺陷型背景(例如TCR或RAG敲除、SCID或裸)上。更詳細地人源化小鼠為了本發明的目的，通過直接將轉基因靶入鼠基因組的特定部分中以產生對小鼠MHC系統組分的直接置換，從而可將已知的人源化MHC小鼠(16)製得更有用。供體小鼠供體小鼠是在內源性β2m和內源性MHCII類缺陷的小鼠背景[稱為hMHCtsgmMHCK0]上人MHCΙ_β2πι類和MHCII類分子轉基因的。最佳的(但並非唯一的)策略是通過靶向誘變(在用於產生小鼠的ES細胞中通過敲除/敲入策略的基因置換)來靶向人MHC轉基因入相關的小鼠β2m和MHCII類基因座中。這戲劇性地簡化了維持及產生所需集落必需的繁殖策略。例如，人MHCI類分子/人β2m雜合分子可被靶入小鼠β2m基因座(由此除去所有內源性小鼠MHCI類分子)。類似地，人MHCII類基因可被靶入小鼠MHCII類基因。受體小鼠受體小鼠與供體小鼠在人和小鼠MHC基因狀況中相同，但在T細胞缺陷型或T和B細胞缺陷型背景(例如SCID、裸、RAGl、RAG2、TCRi3或TCRPxδ)上繁殖。為了說明該系統的目的，將這些小鼠稱為[Τ缺陷-hMHCtsgmMHCKO]以標識它們。人源化小鼠中的保護系統用所選擇的病原體感染供體[hMHCtsgmMHCKO]小鼠以刺激強免疫應答。自合適的器官(通常是淋巴結或脾)衍生的T細胞可被分選以提取各細胞群(例如CD4+或CD8+或者「活化的細胞」)，之後稀釋成合適的細胞數目並施用於受體[T缺陷-hMHCtsgmMHCKO]小鼠。以對標準系統相同的方式處理受體動物，即通過感染/免疫接種/暴露來刺激細胞擴增，並在大約1-2個月後用所研究的感染(或其它攻擊系統)進行攻擊。隨後的對「受到保護的」和「未受到保護的」動物和在這些動物中存在的細胞的分析遵循上文和實施例中描述的標準方法。本發明現在將通過實施例得以進一步描述，實施例意在幫助本領域普通技術人員實施本發明，而不旨在以任何方式限制本發明的範圍。實施例實施例1-體內T細胞組庫的限制腸頂復門(apicomplexan)原生動物艾美球蟲代表了一組重要的家畜病原體。艾美球蟲在種系發生上與包括瘧原蟲(引起瘧疾)、鼠弓形體和腸寄生蟲小球隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)在內的多種人病原體有關。艾美球蟲寄生蟲的基因組為大約60Mbp，並且估計頂復門寄生蟲基因組編碼7，000-10，000種基因產物，它們都是潛在的抗原。艾美球蟲寄生蟲感染誘導針對再攻擊感染的免疫，它特別強且時間長。由於依賴於T細胞殺死胞內病原體的能力，因此針對許多頂復門寄生蟲的保護性和/或有效應答的性質是非常確實的。此實驗研究在蠕形艾美球蟲(小鼠的一種天然寄生蟲)感染期間保護性/有效且響應T細胞組庫的性質。如通過TCRVii擴增及⑶R3長度多態性評估(通過免疫掃描(immunoscope))所判斷的，認為針對此病原體的響應組庫的性質是高度複雜且多克隆的。為了研究此組庫內的有關特異性，本發明人已開發了一種方法，籍此給予T細胞缺陷型受體小鼠以來自致敏供體動物的受限淋巴細胞組庫。該規程將不同數目的細胞過繼轉移入大約6-10隻小鼠的各組中並用蠕形艾美球蟲感染受體兩次。蠕形艾美球蟲系統的一個特徵是感染是自我受限的且寄生蟲的最大複製能力在寄生蟲基因組內編碼。該生物學的這一方面容許攻擊高度免疫缺陷的動物而不產生嚴重的臨床後果(在其它系統中，這種致敏處理可用各種方案來實現，例如通過使用藥物終止)。感染期間產生的寄生蟲的數目是免疫程度的直接結果，而且在第一次攻擊期間對該系統測試賦予免疫需要多少細胞。首次感染還刺激轉移細胞的擴增，使得當動物被再次攻擊時(1或2個月後)，免疫程度與不同TCR(即組庫)的數目有關，而不是與轉移細胞的數目有關。該實驗策略描繪於圖1中。從首次用於實驗的或主動響應的(首次感染後10天；dppi)或從自感染恢復的(30dppi)C57BL/6小鼠中轉移脾和腸繫膜淋巴結細胞混合物。通過物理破壞來自沒有接受感染的原始C57BL/6(6-8周齡，雌性)小鼠、用50個蠕形艾美球蟲成孢子卵囊10天dppi或用50個蠕形艾美球蟲約30dppi恢復的小鼠的脾和腸繫膜淋巴結獲得單細胞懸浮液。通過用無菌蒸餾水「急驟裂解」來除去紅血球汙染並使用臺盼藍排斥用顯微鏡評估活淋巴細胞數目。以合適的濃度製備細胞等分試樣並通過腹膜內注射(200μ1/小鼠)施用入TCR((βχδ)-/-受體小鼠(7-10隻受體/組)。轉移後一周，用50個蠕形艾美球蟲卵囊攻擊小鼠並根據標準方法(31)通過糞便卵囊輸出的顯微鏡分析監測感染。[監測此感染以確保感染所有小鼠，這並不是有效組庫的分析。首次感染用來擴增能響應蠕形艾美球蟲抗原的T細胞數目]。通過在第一次感染後約30天受體小鼠的第二次攻擊感染(50個卵囊)給予有效組庫的測試。通過如之前所描述的(31)糞便卵囊輸出計數來監測感染的程度。在評估組庫的時候(受體小鼠的第二次攻擊)，在IxIO5個細胞的轉移細胞數目(TCN)下那些接受幼稚細胞的受到良好保護，而轉移IO4個細胞的則未受到保護(圖1)。與此相反，自主動響應的小鼠轉移IO2個細胞賦予針對攻擊的免疫，指示驚人的保護性T細胞組庫的擴增。憑藉採自恢復小鼠的細胞，保護受體動物所需要的細胞容量介於來自首次用於實驗或主動響應的小鼠所需要的數目之間，數目更接近首次用於實驗的動物。這是因為響應細胞群的縮小及細胞的記憶庫的建立。就抗原鑑定而言這3組中最感興趣的是從主動響應小鼠接受低數目細胞的組。在此實驗中，在至少有些個體中看見保護所需要的數目介於100和1000個細胞之間。清楚的是，每一供體個體都是不同的，並且基於免疫應答中天然存在的多種隨機事件，在個體之間保護性細胞的準確水平可以是不同的。雖然如此，能賦予保護的介於1000和100個細胞之間的數目戲劇性地不同於在小鼠中存在的T細胞的正常數目(大約1億個)。保護要求低數目的細胞表明有可能鑑定相對於未受到保護的動物的受到保護的動物的「受限組庫」中存在的T細胞受體。因此，有可能鑑定根據定義識別保護性抗原的有效T細胞受體。實施例2-鑑定與保護有關的TCR磁分選自IOdppi感染的C57BL/6小鼠(主動響應)衍生的⑶4+Τ細胞群並以300-600個T細胞/小鼠將這些細胞過繼轉移到TCR(i3χδ)-/"受體中。進度表描繪於圖2中。在每次實驗中，通過用50個卵囊感染致敏單只供體C57BL/6小鼠(雌性，6_8周齡)。通過在IOdppi時純化MLN淋巴細胞並與抗⑶4綴合的順磁珠(例如Miltenyi)混合，然後依照廠商說明書用AutoMACs系統(例如Miltenyi)進行正分選，從而獲得CD4+T細胞級分。受體動物(ΤΟ[βΧδ]-/_)接受300個分選的細胞並在轉移後7天給予第一次「擴增」感染，使之恢復並在約30dppi時給予第二次「測試」感染。通過糞便中卵囊的輸出來監測感染。在圖3中，測試感染的結果表現為個體小鼠的卵囊輸出，使用虛線代表保護的95%置信區間。包括未操作的原始的和TCR(i3χδ)-/"小鼠作為參照。結果表明30隻受體小鼠大多產生與沒有接受細胞的TCR(βχδ)-/-類似數目的寄生蟲(圖3)。在此實驗中30隻小鼠中的3隻與其它小鼠相比產生明顯更少的寄生蟲，因此可被視為針對感染受到保護。在四次獨立的實驗中，大約10%的接受低數目細胞的小鼠顯示保護性表型(見例如圖3)。因此，有可能在給予高度受限T細胞組庫的小鼠中產生「受到保護的」TCR組庫，並且該系統可被操縱以給出約10%受到保護的受體動物。產生約10%受到保護的受體的能力容許比較在受到保護的和未受到保護的個體中存在的T細胞以鑑定那些與保護性免疫有因果聯繫的TCR(即看見保護性抗原的那些)。實施例3-在警到保護的和未警到保護的「警限組庫」警體小鼠中存在相似數目的⑶4+T細胞對於在圖3中所證實的結果的一種平凡的解釋會是轉移的CD4+T細胞僅在3隻受到保護的動物中存活。為了檢驗這一點，可檢查所有受到保護的和未受到保護的小鼠中存在的CD4+T細胞群。如圖4中所示的，在所有小鼠中可檢測到相似比例的CD4+T細胞，與受體小鼠所展示的「受到保護的」或「未受到保護的」表型無關。與27隻未受到保護的動物的脾中的1.08士0.11%相比，在受到保護的動物的脾中看到了一群1.12士0.09%⑶4+T細胞。類似地，在受到保護的動物的腸繫膜淋巴結(其引流寄生蟲感染部位)中所見的CD4+T細胞的百分數為3.31士0.49%，而在未受到保護的動物中為3.50士0.60%。因此，無法通過過繼轉移的CD4+T細胞生存或擴增不同來解釋在針對感染的保護方面受體小鼠的表型。保守估計在分析時CD4+T細胞擴增的水平(僅基於脾和淋巴結中T細胞的數目)應當在300個轉移的T細胞到最終的4百萬個T細胞數目之間。此計算忽略了這樣的事實，即許多「記憶」T細胞位於組織中，主要是固有層，因此必須考慮視為實質性的低估。T細胞的最終數目是轉移的細胞擴增的結果，儘管實際數目相對高，但是這些具有300種不同TCR的最大組庫。事實上，真實組庫要低得多，原因在於供體細胞群中抗原驅動的擴增會導致供體群具有許多重複的表達TCR的細胞。對於「低於300種TCR數值」的第二個原因是並非所有轉移的細胞都經受得住過繼轉移，導致損失額外的TCR並進一步限制受體動物中的組庫。在使用來自蠕形艾美球蟲的可溶性卵囊抗原製備物和採自「受到保護的」和「未受到保護的」兩種小鼠的脾細胞的經典T細胞增殖測定法中，顯示這兩種小鼠都具有相似水平的抗原特異性增殖(數據未顯示)。總之，這些數據顯示響應T細胞存在於所有個體中，與「受到保護的」或「未受到保護的」表型無關，由此支持了針對感染的應答大多無關的假設。儘管如此，在應答中存在一種能夠保護的TCR組庫組分，並且其能與受限組庫中的響應T細胞分開。^MM4-連續過繼轉移ilHtT警服T細朐,群呆護能力為了驗證該系統，從之前鑑定為「受到保護的」或「未受到保護的」小鼠採集細胞並過繼轉移到多組免疫缺陷型受體(τα(βχδ)-/-受體小鼠，ο7個淋巴細胞/小鼠)中。然後用100個卵囊攻擊受體小鼠以測試所鑑定的τ細胞群的功效，通過卵囊輸出定量感染程度。如通過「連續轉移」受體小鼠糞便中產生的寄生蟲數目所判斷的，此「連續轉移」實驗證實了自「受到保護的」小鼠採集的細胞能夠控制感染，而自「未受到保護的」小鼠採集的細胞則無仍然沒有能力控制感染(圖5)。實施例5-與保護有關的TCR的分子鑑定為了評估保護性和/或有效TCR組庫的同一性和複雜性(理論上高達300種TCR，但實際上比此數目少)，採用了簡單的兩步法。在第一種情況中，從自「受到保護的」和「未受到保護的」受體小鼠採集的脾細胞(或來自其它器官的細胞)提取mRNA，並使用標準技術製備cDNA。然後使用設計成鑑定各TCRVβ家族的的引物通過PCR對cDNA測試不同TCRVβ家族的表達。圖6顯示了使用設計成鑑定TCRVii4和TCRVii14的引物的該方法的一個實例。呈現了在3隻受到保護的和3隻所選擇的未受到保護的小鼠中TCRViimRNA表達譜的全分析(圖6)。所有3隻受到保護的小鼠都表達TCRVβ4、Vβ14、Vβ15禾口Vβ19的mRNA，這代表了較3隻未受到保護的小鼠中所見的更加受限的TCRVii分布。在每一種TCRVii中，會呈現許多克隆T細胞群，而且鑑定這些克隆群需要鑑定包含TCR之⑶R3區(高變且負責抗原識別特異性的區域)的序列。因此，將TCRVβPCR產物克隆入質粒中並用於轉染大腸桿菌。對自至少10個獨立的「陽性」菌落衍生的插入物測序。根據所獲得不同序列的數目概括每一種TCRVβ的測序結果(各自代表一個T細胞克隆；圖7)。自「受到保護的」小鼠獲得的TCRVii序列的數目在數目上比自「未受到保護的」小鼠獲得的那些低得多。總之，在受到保護的小鼠中檢測到6條TCRVii序列，而且這些序列的每一條在所有3隻受到保護的小鼠中都有呈現。用TCRVii4獲得3條序列，而用Vβ14、Vi315和VM9中的每一個僅獲得1條序列，表明了TCRVP單克隆性。憑藉「未受到保護的」小鼠完成了序列分析，其中7種TCRVii中的6種在所有3隻所選擇的小鼠中有呈現，而且這些TCRVii家族中的5種中，序列顯示多克隆性(即無論在小鼠中還是在小鼠之間所有序列都是不同的)。針對TCRVii4和TCRVii14的⑶R3靶向PCR編碼的胺基酸序列的實例描繪於圖8中，並在括號中標明了每條序列的頻率。有趣的是，在TCRVii4中，其中用每一隻受到保護的小鼠及無一未受到保護的小鼠獲得3條序列，所有3隻受到保護的小鼠的每條序列的頻率都是相似的。對於TCRVii14，用帶有CDR3胺基酸序列「RRNI」的3隻受到保護的小鼠獲得了單克隆CDR3序列。在此實驗中與保護相關的TCR組庫是相當值得注意的，在這一點上我們能鑑定6條與保護完全有關的TCRViiCDR3序列。在搜尋保護性抗原中這樣低數目的「有效」TCR的存在提供了重大優勢。參考文獻1.Barry,Μ.Α.，D.P.Howell,H.A.Andersson,J.L.Chen,andR.A.Singh.2004.Expressionlibraryimmunizationtodiscoverandimprovevaccineantigens.ImmunolRev199:68-83.2.Boen,Ε.,A.R.Crownover,M.Mcllhaney,A.J.Korman,andJ.Bill.2000.IdentificationofTcellligandsinalibraryofpeptidescovalentlyattachedtoHLA-DR4.JImmunol165:2040-7.3.Currier,J.R.a.R.,M.A.2000.Spectratype/ImmunoscopeanalysisoftheexpressedTCRrepertoire,p.10.28.1-10.28.24.InJ.E.Coligan,Kruisbeek,Α.Μ.,Margulies,D.H.，Shevack,Ε.M.，Strober,W.(ed.)，CurrentProtocolsinImmunology,vol.2.Wiley,NewYork.4.Fleischer,B.,A.Necker,C.Leget,B.Malissen,andF.Romagne.1996.ReactivityofmouseT—cellhybridomasexpressinghumanVbetagenesegmentswithstaphylococcalandstreptococcalsuperantigens.InfectImmun64:987_94.5.Fox,C.J.a.D.,J.S.1997.MolecularanalysisofmouseTcellreceptorexpressionusingPCR，p.10.27.1-10.27.20.InJ.E.Coligan，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevack，Ε.M.，Strober,W.(ed.)，CurrentProtocolsinImmunology,vol.2.Wiley,NewYork6.Gomes，LI.，R.LSilva，B.S.Stolf，E.B.Cristo，R.Hirata，F.A.Soares，LF.Reis,E.J.Neves,andA.F.Carvalho.2003.ComparativeanalysisofamplifiedandnonamplifiedRNAforhybridizationincDNAmicroarray.AnalBiochem321:244_5L7.Goyarts,E.C.，Ζ.Vegh,Α.Μ.Kalergis，H.Horig，N.J.Papadopoulos，Α.C.Young，C.Τ.Thomson，H.C.Chang，S.Joyce,andS.G.Nathenson.1998.PointmutationsinthebetachainCDR3canaltertheTcellreceptorrecognitionpatternonanMHCclassI/peptidecomplexoverabroadinterfacearea.MolImmunol35:593_607·8.Hanks，M.，W.Wurst，L.Anson-Cartwright，A.B.Auerbach，andA.LJoyner.1995.RescueoftheEn-ImutantphenotypebyreplacementofEn-IwithEn-2.Science269:679_82.9.Hazbon，M.H.，andD.Alland.2004.Hairpinprimersforsimplifiedsingle-hueleotidepolymorphismabalysisofMycobacteriumtuberculosisandotherorganism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QKPHPPLF(SEQIDNO.3)13.依照權利要求12的TCR篩選有效誘導針對艾美球蟲感染保護性和/或有效的免疫應答的抗原或抗原決定簇的用途。全文摘要本發明提供了一種用於鑑定針對疾病保護性和/或有效的T細胞受體(TCR)的方法，該方法具有下述步驟i)自供體非人動物獲得T細胞；ii)以使得至少一隻受體動物針對疾病受到保護但至少一隻動物仍然未受到保護的量將T細胞過繼轉移入多隻T細胞缺陷型受體非人動物；並iii)確定僅僅在受到保護的動物中存在的TCR。文檔編號C07K14/725GK101970480SQ200780102286公開日2011年2月9日申請日期2007年12月3日優先權日2007年12月3日發明者阿德裡安·史密斯申請人:艾西斯創新有限公司