利用rna幹擾技術使杜氏藻累積高含量番茄紅素的方法

2023-07-19 09:10:26

專利名稱：利用rna幹擾技術使杜氏藻累積高含量番茄紅素的方法
技術領域：
本發明涉及生物合成番茄紅素的方法，尤其是利用RNA幹擾技術使杜氏藻 (Dunaliella)累積高含量的番茄紅素的方法。
背景技術：
番茄紅素(Lycopene)是一種脂溶性天然色素，其分子是由11個共軛雙鍵和2個非共軛雙鍵組成的直鏈型碳氫化合物，屬類胡蘿蔔素類。主要存在於番茄、西瓜、紅色葡萄柚等植物中。近十年來的研究表明，番茄紅素極強的抗氧化活性，其清除單線態氧的能力是維生素E的100倍、是β -胡蘿蔔素的2. 2倍，清除羥自由基的效果比β -胡蘿蔔素強32 倍，為目前自然界中被發現的最強抗氧化劑之一。研究發現，番茄紅素具有優越的生理功能，它不僅具有抗癌、抑癌的功效，而且對於預防心血管疾病、動脈硬化等各種成人病、增強人體免疫系統以及延緩衰老等也有良好的效果。2009年全世界番茄紅素的總用量約2300 噸，據有關機構預測，番茄紅素的需求量在未來數年仍將以約10%的速度增長。目前世界上番茄紅素的生產方法有天然提取法、化學合成法和發酵法三種。俄羅斯和美國羅氏藥業有化學合成的番茄紅素產品，生產成本較低，但其結構為非全反式，生理功能差，而且人們對化學合成品毒副作用有相當的疑慮，因此化學合成番茄紅素很少用於藥物和食品添加劑。目前市場上的番茄紅素大多是從番茄中提取的天然產物，但由於番茄中番茄紅素的含量僅為0. 002%左右，提取難度大、成本高、純度低，而且大量種植番茄用於番茄紅素提取需要消耗很多的土地資源。利用微生物發酵法製備番茄紅素的研究方面也有一些報導，美國專利US3097146、 US3369974及中國專利200510090996. 0提出了利用三孢布拉氏黴菌發酵製備番茄紅素的方法，但這些方法均需要添加氨基吡啶等化學藥劑幹擾黴菌的生物合成路徑來實現番茄紅素的積累，化學添加劑在產品中的殘留對人體的健康會產生不利影響。中國專利 20071012^95發明了一種利用細菌(龜裂鏈黴菌)發酵累積番茄紅素的方法，但由於受到其合成前體供應量的限制，依照此方法生產番茄紅素產率僅在0. 4% 0. 7%細胞乾重範圍，仍沒有實質性的突破與提高。通過基因工程和代謝工程的方法來提高番茄中番茄紅素的含量方面也有一些有益的嘗試。如以色列Lycored Natural Product hdustries公司率先選育出番茄紅素含量為普通番茄4 5倍的雜交番茄。英國將細菌八氫番茄紅素脫氫酶基因crtl導入番茄細胞中，培育出了番茄紅素含量為普通番茄3. 5倍的轉基因番茄新品種。這些研究雖然在一定程度上提高了原料中番茄紅素的含量，但總體水平仍很低。杜氏藻(Dimaliella)，為綠藻門多鞭藻科的一屬，是鹽生的、無細胞壁的單細胞綠藻，能高效率地生物合成β-胡蘿蔔素，其中的鹽生杜氏藻(Dimaliella salina)細胞中累積β-胡蘿蔔素的量最高可達乾重的14%，是β-胡蘿蔔素含量最高的生物體，遠遠高於其它生物。此外杜氏藻可以在露天開放環境下利用陽光和二氧化碳快速生長，其中鹽生杜氏藻的增殖速度達約IOg/(m2 天)，因此杜氏藻是生產天然β -胡蘿蔔素的很好資源，全球有不少公司利用杜氏藻來生產胡蘿蔔素，用作藥物或健康食品的成分。番茄紅素和胡蘿蔔素都是類胡蘿蔔素物質，它們有相近的化學結構，讓杜氏藻像生物合成胡蘿蔔素那樣直接合成、累積番茄紅素的想法非常有吸引力的，因為迄今為止世界上還沒有發現過能夠以如此高的效率來合成、累積番茄紅素的生物。

發明內容
本發明的目的是建立一種使杜氏藻(Dimaliella)能夠累積高含量的番茄紅素的方法。植物生物合成β -胡蘿蔔素途徑的相關研究表明，番茄紅素是生物合成β -胡蘿蔔素的前體，番茄紅素在番茄紅素-β-環化酶(Lycopene β-cyclase, LycB)的催化作用
下，先將番茄紅素分子的兩個末端之一環化成Y-胡蘿蔔素，然後再將另一端環化後形成胡蘿蔔素，LycB是番茄紅素轉化為β-胡蘿蔔素的關鍵酶，如果沒有LycB的參與，番茄紅素就不能環化，生物合成胡蘿蔔素的過程就會終止於番茄紅素合成階段。番茄果實中番茄紅素的累積研究證實，番茄紅素的累積是上遊八氫番茄紅素合成酶基因(psy基因)和八氫番茄紅素脫氫酶基因(pds基因)表達增強及下遊IycB基因表達減弱的結果，其調控方式為相關基因的轉錄調控。杜氏藻生物合成β-胡蘿蔔素的過程中，兩步環化反應同樣都必需LycB參與才能完成，而LycB是IycvB基因表達的產物，因此，通過抑制杜氏藻的IycB基因的表達就可以實現番茄紅素在杜氏藻體內不被轉化為胡蘿蔔素而大量累積下來。抑制杜氏藻IycB基因表達的有效途徑是將杜氏藻基因組中的IycB基因敲除 (knock-out)或者使IycB基因沉默，也就是RNA幹擾(RNA interference, RNAi)。本發明人在中國發明申請201110084892. 4中公開了一種通過敲除杜氏藻IycB基因使其能夠累積高含量的番茄紅素的方法，該方法實施後取得了非常好的效果，所獲得的敲除了 IycB基因的鹽生杜氏藻可以累積高達3. 5%細胞乾重的番茄紅素，是番茄的1000倍以上。與基因敲除技術相比，RNA幹擾技術的優點在於它不僅能夠有效地抑制特異序列的目的基因的表達、操作簡便、迅速，而且不會改變基因組的遺傳組成。本發明將通過構建IycB基因的RNAi表達載體，將其轉入杜氏藻中，並篩選得到能夠有效幹擾IycB基因的表達、累積高含量番茄紅素的杜氏藻，使人類可以通過養殖杜氏藻的新途徑大量、方便地獲取天然番茄紅素。本發明的具體過程是第一步，杜氏藻細胞RNA的提取與反轉錄得到杜氏藻cDNA庫。本發明所說的杜氏藻(Dimaliella)可以是鹽生杜氏藻(Dimaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)或雙杜氏藻(Dunaliella biocuiate)等，其中優選累積β-胡蘿蔔素能力更強的鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，特別是鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)。第二步，RNAi表達載體的構建。1、以杜氏藻cDNA為模板擴增目標片段；杜氏藻的cDNA序列經測序得到或來源於GenBank。
杜氏藻cDNA的測序按照基因工程領域常用的測序方法進行，也可以將測序工作委託給專門提供測序服務的生物技術公司。根據杜氏藻cDNA序列設計特異性引物，克隆目標RNAi片段。本發明特別提出了特異性引物引物Y6-RNAi-F，序列為SEQ ID NO :2，引物Y6_RNAi_R，序列為SEQ ID NO :3。2、構建質粒並測序本操作中能採用的質粒有很多選擇，這是本專業領域的研究人員所熟知的，下述操作中選擇了質粒pMD 19-T，但本發明並不局限於它。按下列步驟構建pMD19-T_RNAi9質粒並測序(1)將目標RNAi片段接入起始質粒PMD19-T(2)轉化感受態細胞(3)菌落PCR篩選陽性轉化子
(4)質粒PCR篩選陽性轉化子(5)酶切檢測(6)序列測定本發明特別提出了一種目標RNAi片段，其序列為SEQ ID NO :1。3、RNAi中間載體的構建本操作中能採用的質粒有很多選擇，這是本專業領域的研究人員所熟知的，下述操作中選擇了質粒pHANNIBAL、pBS-KS (+)，但並不局限於它們。酶切上述步驟2得到的pMD19-T_RNAi9質粒，得到pi正向片段，進一步接入內含子pHANNIBAL載體得到RNAi-pl質粒，再酶切得到p2反向片段，p2反向片段再連接入RNAi-p 1質粒得到RNAi-p 1-ρ2質粒，在該中間載體上，幹擾片段正向和反向插入到 pHANNIBAL載體內含子兩側，並置於啟動子CaMV35S啟動子和終止子OCS終止子之間，構建了完整的幹擾表達盒。酶切RNAi-pl_p2質粒，回收4. 2kb的片段，插入到pBS_KS⑴載體的NotI酶切位點，得到PBS-RNAi質粒。4、構建RNAi表達載體在RNAi表達載體中包含用於篩選的篩選標記基因，所述的篩選標記基因是氯黴素抗性基因、阿特拉津抗性基因、螢光蛋白基因等，本發明優選阿特拉津抗性基因。本操作中能採用的質粒有很多選擇，這是本專業領域的研究人員所熟知的。下述操作中選擇了質粒PCAMBIA1301，但並不局限於它。酶切pCAMBIA1301質粒將潮黴素抗性基因(hpt)替換為1. 4kb的阿特拉津氯水解酶基因(atzA)，得到1301-atzA載體。用&icI/BamHI分別雙酶切pBS-RNAi和1301_atzA表達載體，分別回收4. 2kb和 12kb的片段，連接得到1301-pBS-RNAi表達載體，圖1是1301-pBS-RNAi表達載體圖譜，該載體具有卡那黴素抗性以及阿特拉津(atzA)正篩選標記。第三步，RNAi表達載體的轉化。將RNAi表達載體轉化進杜氏藻細胞方法可以是電擊法、農桿菌侵染轉化法、聚乙二醇(PEG)法、基因槍法、玻璃珠攪拌法等，這些方法是基因工程領域所常用的，這些方法在轉化效率方面有所不同，本發明優選簡便高效電擊法。
用電擊法將RNAi表達載體轉化進杜氏藻細胞在冰浴中以3kV/cm 8kV/cm電擊杜氏藻細胞懸浮液。在本發明中電擊法可以達到0. 05% 0. 2%的轉化效率。攜帶抗性標記的的轉化株可以用抗性平板篩選，攜帶螢光蛋白標記的轉化株用流式細胞鑑別分離儀器篩選。圖2是電轉化後利用阿特拉津抗性平板篩選轉化藻。第四步，PCR鑑定陽性轉化子。挑取單藻落擴大到ImL培養，提取微藻基因組，進行PCR鑑定。首先用引物對atzA-5/8鑑定正篩選標記atzA基因，得到0. 8kb的特異性條帶，說明正篩選標記atzA基因已經插入到杜氏藻基因組中。然後用引物對Y6-RNAi-F/R進一步做基因組PCR，鑑定幹擾片段，得到大小約為0. 6kb，說明幹擾片段已經插入到杜氏藻基因組中。之所以可選用Y6-RNAi-F/R這對引物做篩選，原因是實驗獲得的幹擾片段來源於杜氏藻的cDNA序列，不包含內含子序列。非轉化藻基因組中不能得到0.61Λ的條帶，或者可能得到大於0. 6kb的條帶。圖3是引物對atzA-5/8的PCR鑑定圖譜，結果顯示2、4、5藻株基因組存在抗性標記atzA基因；圖4是引物對Y6-RNAi-F/R的PCR鑑定圖譜，結果顯示篩選得到的1、2、3、5、6、8藻株基因組存在幹擾片段，證明RNAi表達載體得到成功轉化。將已PCR確認RNAi陽性的杜氏藻進行放大養殖，用高壓液相色譜(HPLC)檢測藻體中番茄紅素的含量，結果顯示，所得到的杜氏藻能夠累積高含量的番茄紅素。本發明的優點在於通過杜氏藻IycB基因的RNAi表達載體的構建、轉化以及轉化株的篩選，得到IycB 基因被幹擾的杜氏藻，該杜氏藻的IycB基因的表達被抑制，其生物合成β-胡蘿蔔素的過程被阻止於番茄紅素階段，進而在其生物體內大量累積番茄紅素，該累積過程是藻體自然的生物代謝過程，無需額外添加任何化學抑制劑。由本發明得到的IycB基因表達受RNA幹擾的杜氏藻，在3. Omol/L鹽濃度、氮缺乏、強光脅迫下養殖就可以大量累積番茄紅素，HPLC 檢測結果顯示，其番茄紅素的含量增加到起始杜氏藻的14 16倍。本發明成果將為人類大量、廉價地獲取番茄紅素提供全新的解決方案。本發明所提出的特異性引物Y6-RNAi_F和Y6_RNAi_R用於克隆杜氏藻IycB基因 RNA幹擾的目標片段，由此得到的RNAi目標片段有很好的幹擾效果，引物Y6-RNAi-F的序列為 SEQ ID NO :2，引物 Y6-RNAi-R 的序列為 SEQ ID NO :3。克隆得到的鹽生杜氏藻RNAi目標片段序列為SEQ ID NO :1，該鹽生杜氏藻是商業化生產β-胡蘿蔔素的最常用的杜氏藻品種，在強光、高鹽等脅迫環境下能夠累積胡蘿
卜素的量最高可達到生物體乾重的10% 14%，因此，該RNAi目標片段應用於使鹽生杜氏藻IycB基因沉默，具有很好的應用價值。


圖1是1301-pBS-RNAi表達載體圖譜。圖2是電轉化後利用阿特拉津抗性平板篩選轉化藻。圖3是引物對atzA-5/8的PCR鑑定圖譜，M為NTKV_3marker，1為陰性對照，2-5 為不同單藻落，6為陽性對照。圖4是引物對Y6-RNAi-F/R的PCR鑑定圖譜，M為NTKV_3marker，1-8為不同單藻落，9為陰性對照，10為陽性對照。
圖5是鹽生杜氏藻Y6中類胡蘿蔔素成分的HPLC分析，峰I為β -胡蘿蔔素，峰II
為番茄紅素。圖6是經RNA幹擾獲得的1-Α4藻中類胡蘿蔔素成分的HPLC分析，峰I為β -胡蘿蔔素，峰II為番茄紅素。
具體實施例方式下述實施例中所涉及的方法如無特殊說明均為該技術領域的常規方法，所用的酶製劑如無特別說明均為TaKaRa公司的產品，所涉及的引物的DNA序列在序列中表相應列
出ο實施例一、鹽生杜氏藻RNAi表達載體的構建1、鹽生杜氏藻RNA提取與反轉錄鹽生杜氏藻Υ6為中國商業化生產生產β-胡蘿蔔素的常用的杜氏藻品種。採用TRIzoI試劑提取鹽藻細胞的總RNA，反轉錄得到cDNA庫。反轉錄採用TaKaRa 公司的 M-MLV 型 cDNA Synthesis Kit。2、表達載體1301-pBS-RNAi的構建(1)以鹽生杜氏藻cDNA為模板擴增目標片段根據GenBank報導的cDNA序列(登錄號EU327876)設計特異性引物Y6_RNAi_F、 Y6-RNA1-R,從鹽生杜氏藻cDNA中克隆目標片段RNAi9。(2)構建 pMD19-T-RNAi9 質粒並測序A.將RNAi9目的片段接入pMD19_T載體酶連體系如下a) RNAi9 目的片段4. 8 μ Lb) pMD19-T 載體0. 4 μ Lc)T4 連接酶0.2yLd) IOXligation buffer 0. 6 μ L總體系6yL上述體系16 °C連接過夜B.轉化感受態細胞C.菌落PCR篩選陽性轉化子D.質粒PCR篩選陽性轉化子E. Xbal/Clal、EcoRI/XhoI 酶切檢測F.序列測定對經PCR鑑定和酶切鑑定均正確的菌株測序。C3)pKS_RNAi中間載體的構建用鹼裂解法提取pMD 19-T-RNAi9質粒及pHANNIBAL質粒載體，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度。首先用^(bal/Call雙酶切以上兩種質粒，將膠回收得到的Pl正向片段與 pHANNIBAL載體連接，轉化，經PCR、酶切鑑定篩選得到陽性轉化子RNAi-pl質粒，再用BioI/ EcoRI雙酶切pMD19-T-RNAi9和RNAi-pl，回收0. 6kb的p2反向片段連接到RNAi-pl中，得到RNAi-pl-p2質粒。在該中間載體上，幹擾片段正向和反向插入到pHANNIBAL載體內含子兩側，並置於CaMV35S啟動子和OCS終止子之間，構建了完整的幹擾表達盒。凍融法回收酶切得到的基因片段a.酶切產物用0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分離b.在紫外燈下切下目的條帶，置於大小合適的封口膜上，_20°C放置30minc.擠膠，吸取DNA溶液收集於1. 5mL離心管中d.加等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心IOmine.上清轉入新的離心管中，加2. 5倍體積的預冷乙醇、0.4倍體積的醋酸鈉，-20°C 靜置5h以上f. 14000r/min離心lOmin，沉澱用預冷的75%乙醇洗滌，離心，乾燥，DNA沉澱溶於適量TE中，取0. 5 μ L電泳確定其濃度(4)構建 pBS-RNAi 載體NotI酶切RNAi-pl_p2質粒，回收4. 2kb的片段，插入到pBS_KS (+)載體的NotI酶切位點，得到pBS-RNAi質粒。(5)構建 1301-pBS-RNAi 表達載體以pCAMBIA1301質粒為骨架構建表達載體，首先用BioI限制性內切酶將潮黴素抗性基因(hpt)替換為1.41Λ的阿特拉津氯水解酶基因(atzA)，得到1301_atzA載體。用&icI/BamHI分別雙酶切pBS-RNAi和1301-atzA表達載體，分別回收4. 2kb和 12kb的片段，連接得到1301-pBS-RNAi表達載體，其圖譜見圖2。該載體具有卡那黴素抗性以及阿特拉津(atzA)正篩選標記。利用PCR、酶切驗證載體的正確性。3、電擊轉化法、篩選電擊緩衝液0. 28mol/L NaCl、5mmol/L KCl、25mmol/L CaCl2,20mmol/L H印es、 0. 2mol/L 甘露醇、0. 2mol/L 山梨醇、O. 05% Tween_20、0· 4mol/L 甘油。電擊轉化步驟a.培養鹽生杜氏藻至對數生長期(1.0\10、611/!1^)，41，400017/1^11離心5111士11，
收集細胞。b.冰上操作，ImL電擊緩衝液懸浮細胞，洗滌2次。c.重懸至細胞密度為l.OX 107cell/mL，取90 100 μ L重懸藻液，加終濃度為 IOng/ μ L的載體，混勻，冰浴IOmin0d. 6kV/cm電擊，冰浴lOmin，加入ImL新鮮培養基，暗培養12he.光暗=14 10液體培養Mh，最後鋪板於含0. 2 μ g/mL阿特拉津抗性的固體平板上培養至長出單藻落。4、PCR 鑑定挑取單藻落擴大到ImL培養，然後用簡易CTAB法提取藻基因組，PCR篩選引物分別為atzA-5，序列 SEQ ID NO 4atzA-8，序列 SEQ ID NO 5MD-RNAi-F，序列 SEQ ID NO 6MD-RNAi-R，序列 SEQ ID NO 7
圖4、5分別顯示1301-pBS-RNAi表達載體後得到的轉化藻株的PCR檢測結果，篩選得到的藻株基因組存在atzA基因和RNAi片段，證明1301-pBS-RNAi表達載體得到成功轉化。5、轉化藻類胡蘿蔔素的提取及HPLC分析經上述電轉化、篩選、PCR鑑定操作步驟後，得到到IycB基因表達被幹擾的鹽生杜氏藻1-A4，在3mol/L氯化鈉、氮缺乏、高光誘導條件下養殖該藻，同時以鹽生杜氏藻Y6為對照。按以下方式分離藻體、提取番茄紅素，利用HPLC定量檢測番茄紅素的含量，以確認其是否能夠累積高含量的番茄紅素。微藻類胡蘿蔔素提取方法a.取藻液15mL，4000r/min離心5min，傾去上清液。b.加2mL丙酮重懸藻泥，-20°C黑暗靜置2h，充分萃取。c.在 4°C下，6000r/min，離心 lOmin。d.取上清，0.45 μ m膜過濾，取20 μ L上樣。HPLC 條件色譜柱Comatex C18(5ym, Φ 4. 6 X 250mm)柱溫30°C、流速lmL/min檢測波長502nm流動相A 乙腈和水(9:1，體積比)流動相B:乙酸乙酯進樣量20yL梯度0 16min B:0 60%16 30minB 60%30 35minB :60% 100%標樣β -胡蘿蔔素標準品用三氯甲烷溶解，番茄紅素標準品用二氯甲烷溶解HPLC分析杜氏藻提取樣品的β-胡蘿蔔素和番茄紅素的含量，附圖6、圖7是HPLC 分析的圖譜。HPLC分析結果顯示1-Α4的番茄紅素含量佔總類胡蘿蔔素的42. 7士3. 5%，遠高於 Υ6的2. 9%，是Υ6的14. 74倍；按乾重計算，1_Α4的番茄紅素含量為2. 7 士 0. 6%，超過番茄的750倍以上。
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權利要求
1.一種使杜氏藻(Dimaliella)累積高含量番茄紅素的方法，其特徵是通過RNA幹擾技術使杜氏藻的番茄紅素-β-環化酶(LycB)基因的表達被抑制。
2.根據權利要求1所述的幹擾杜氏藻的番茄紅素環化酶基因的表達的方法，其特徵是包括以下步驟第一步，提取杜氏藻RNA，反轉錄得到杜氏藻cDNA庫。第二步，克隆目標RNA幹擾片段，構建RNA幹擾表達載體的構建。第三步，RNAi表達載體的轉化。第四步，PCR鑑定陽性轉化子。
3.根據權利要求2所述的杜氏藻的RNA幹擾表達載體，其特徵在於含有氯黴素抗性基因或阿特拉津抗性基因。
4.根據權利要求2或3所述的杜氏藻的RNA幹擾表達載體，其特徵在於幹擾片段分別正向和反向插入到載體內含子的兩側，並置於CaMV35S啟動子和OCS終止子之間。
5.根據權利要求2所述目標RNA幹擾片段的克隆，其特徵在於所採用的引物的序列為 SEQID NO 2 禾口 SEQ ID NO :3。
6.根據權利要求1-3任一項所述的杜氏藻是以下杜氏藻的任何一種鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、雙杜氏藻(Dunaliella biocuiate)。
7.根根據權利要求1-3任一項所述的杜氏藻是鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴 1 (Dunaliella bardawil)。
8.根據權利要求1-3任一項所述的杜氏藻是鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)。
9.根據權利要求1-3任一項所述的RNA幹擾，其特徵在於目標RNA幹擾目標片段序列為 SEQ ID NO :1ο
10.根據權利要求4所述的RNA幹擾，其特徵在於目標RNA幹擾目標片段序列為SEQ IDNO 1。
全文摘要
本發明涉及生物合成番茄紅素的方法，特別是利用RNA幹擾技術使杜氏藻(Dunaliella)能夠累積高含量番茄紅素的方法。根據杜氏藻cDNA序列設計特異性引物，克隆目標RNA幹擾片段，然後構建RNA幹擾表達載體，並轉化進杜氏藻細胞，經篩選和PCR鑑定獲取了RNA幹擾的杜氏藻，該杜氏藻的番茄紅素-β-環化酶基因的表達被抑制，細胞生物合成β-胡蘿蔔素的過程被阻止於番茄紅素階段，在3.0mol/L鹽濃度、氮缺乏及強光脅迫條件下能夠在生物體內大量累積番茄紅素，其番茄紅素的含量增加到起始杜氏藻的14～16倍。本發明的方法是大量、廉價地獲取天然番茄紅素的新途徑。
文檔編號C12P23/00GK102251007SQ20111014181
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者劉鑫, 李伯平, 陳喜文, 陳德富 申請人:南開大學