一種獲得並繁育羊草無性系的方法
2023-07-19 11:48:01
專利名稱：一種獲得並繁育羊草無性系的方法
技術領域：
本發明涉及一種獲得並繁育羊草無性系的方法。
背景技術：
羊草隸屬單子葉植物綱、禾本科、禾亞科、早熟禾系、大麥族、野麥亞族、賴草屬植物，是歐亞大陸草原區東部的重要草原建群種之一。主要分布於俄羅斯、朝鮮、蒙古及我國東北、內蒙古、河北、山西、陝西、新疆等省區。羊草是多年生根莖型禾草，對不同的生境條件表現出很強的生態適應性，對改善我國北方草原生態環境和西部鹽漬化土地治理具有重大生態意義。同時，羊草是一種重要的牧草資源，蛋白質含量高，營養價值高，適口性好，耐踐踏，是一種優質牧草。
「體細胞變異somatic variance」也稱「克隆變異clone variance」，是指體細胞在繁殖過程中出現的各種變異。細胞誘變是獲得植物體細胞變異的方法之一，是植物育種，研究與開發植物種質資源，特別是牧草及草坪草育種的重要途徑之一。羊草體細胞誘變是創造新的變異品種的方法之一，通過體細胞變異誘導植株，進行高品質品種篩選，提高資源豐度。獲得植物體細胞變異的方法有組織培養和原生質體培養，化學誘變及物理誘變法等。目前，人們利用這些誘變方法已經獲得了多種植物的突變體。但到目前為止，尚沒有一種方法成功地用於羊草的誘變研究並獲得突變體。
低能重離子(簡稱低能離子)是指能量在10keV-100keV之間，原子序數大於氦的剝離原子核。19世紀70年代，低能離子束被廣泛的應用於物理材料表面的修飾，它與生物體的相互作用研究是近十幾年的事情。科學家應用不同的材料進行離子注入的生物效應和作用機理的研究，揭開了一個新的生命科學研究領域，如低能離子束與生命起源和進化的關係，環境中低劑量輻射的危害以及低能離子束對生物遺傳物質的修飾作用等。
發明創造內容本發明的目的是提供一種獲得並繁育矮化，返青早，根莖生長快的羊草的方法。
本發明所提供的繁育羊草無性系的方法，是使用N+離子輻照羊草愈傷組織，再培養經N+離子輻照後的愈傷組織，得到矮化，返青早，根莖生長快的羊草；所述N+離子輻照中N+的能量可為20-30keV、脈衝劑量可為1.4-3.4×1016N+/cm2，優選為N+的能量為25keV、脈衝劑量為2.6×1016N+/cm2。
其中，進行N+離子輻照的羊草愈傷組織可由常規方法得到，最好是以羊草幼穗為外植體，以含0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培養基為愈傷組織誘導培養基培養得到的羊草愈傷組織，且最好為緊密型愈傷組織。
經N+離子輻照後的愈傷組織的分化培養基最好為含有1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6培養基，培養條件最好為25℃，光照強度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。
本發明將低能離子誘變法應用於羊草愈傷組織，獲得了矮化，返青早，根莖生長快的羊草無性株系。本發明方法的特點是實用性強，誘變效率高，具有重要的理論意義和實際意義。
具體實施例方式
實施例1、一種獲得並繁育羊草無性系的方法繁育羊草的工藝流程為原材料無性繁殖→幼穗培養→繼代培養→低能離子輻射→植株再生→幼苗移栽→大田形態鑑定→分子鑑定。具體方法和過程如下1、植物材料來源及特徵本實施例採用的羊草「無性系3號」原產於河北省沽源牧場蒙古大營，它是經以下篩選得到的先從河北省沽源牧場蒙古大營的13個種質中選擇形成68個無性克隆系，然後將25個無性系移栽到中科院植物研究所試驗田(北京)，最後通過預備實驗篩選出植株(試管苗)再生能力較強的「無性系3號」羊草作為本實施例的實驗材料。「無性系3號」的特點是4月30日前後返青，5月營養枝高46cm，生殖枝高72cm，葉色深藍，葉毛少，葉寬0.41cm，葉長18cm，群體抽穗率42％，每平米的枝數230，穗型復生，穗長18cm，每穗小花數114，莖葉比1.64，產草量(鮮重)約2.6kg/平方米。
2、幼穗培養(1)羊草外植體處理採集孕穗期的羊草幼穗，長度為4-7cm，幼穗完全被葉鞘緊密包裹。從田間取回的材料在超淨工作檯內用75％的酒精將包裹幼穗的葉鞘擦拭幾遍，然後小心剝出幼穗，葉鞘中的幼穗一般是無菌的，無需消毒。
(2)培養基培養基的基本成分是N6培養基，在誘導愈傷、繼代、誘導分化、生根等培養基中需添加適當激素、蔗糖和瓊脂，所有培養基的pH均調整為5.8，培養基先分裝，然後在120℃高壓鍋內滅菌20min。
(3)愈傷組織的誘導將無菌幼穗切成3mm左右的小段，接種在含有0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培養基上。25℃恆溫暗培養，培養4周統計結果。
3、愈傷組織的繼代愈傷組織形成後，將緊密型愈傷組織轉到含有2，4-D 0.5mg/1的N6培養基上繼續培養，每4-5周繼代1次。
4、低能離子輻照選取繼代的緊密型愈傷組織，將其分為對照組和處理組，將處理組放在無菌的培養皿內，置於靶室中進行離子注入。小靶室本身消毒，並在樣品進出時通入無菌空氣，保證樣品不受雜菌汙染。處理組N+離子能量為25key，脈衝劑量分別為1.4×1016，1.8×1016，2.2×1016，2.6×1016，3.4×1016N+/cm2；對照組除沒有N+離子注入外，其他條件同處理組。
5、植株再生及幼苗移栽將輻照後和未經輻照的愈傷組織切成2-4mm大小，分別轉移到繼代培養基(含有2，4-D 0.5mg/l的N6培養基)上，1周後成活率如表1所示，結果說明各處理對愈傷組織存活率有顯著影響，劑量越高愈傷組織存活率越低。將存活的愈傷組織接種到附加1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6分化培養基(經過篩選，在這個培養基上愈傷組織的分化頻率最高，平均達到67％)。25℃恆溫，光照強度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。一個半月左右再生頻率如表2所示，結果說明各處理對愈傷組織再生頻率無統計上的顯著影響。將3-5mm長的芽轉移到生根培養基(不含激素的1/2MS基本培養基)中生根，生根後的試管苗移栽到裝有按照1∶1比例混合沙土的小盆中，在溫室中過度一周，成活後轉到試驗田，移栽成活率平均96％。共獲得1280個無性系，其中對照組306個株系，處理組974個株系。
表1 離子注入劑量與愈傷組織存活率的關係
*離子為N+離子，注入能量是25keV/次**相同的字母表示在統計上無顯著差異。
表2 離子注入劑量與愈傷組織再生頻率的關係
*離子為N+離子，注入能量是25keV/次**愈傷組織再生頻率是指存活的愈傷組織的再生頻率***相同的字母表示在統計上無顯著差異。
6、大田形態鑑定在不同發育時期對移栽植株進行了形態記錄。包括株高，葉色，葉長，葉寬，葉數，無性繁殖量，有性繁殖量，穗長，小穗數，小花數，結實率等。植株數目與樣方面積的比值定義為植株密度，並折算為1平方米麵積內的植株密度，莖重與葉重的比值定義為莖葉比；二者重量之和為樣方面積內的產草量，並折算為1平方米麵積內的產草量。始花期對以上性狀重複測量，並記錄營養枝和生殖枝的數量，將二者的比值定義為抽穗率。種子成熟期進行室內考種，包括穗長，每株種子產量，小穗數，小花數，千粒重，結實率等性狀。結果如表3所示，表明N+離子能量為25keV，脈衝劑量為2.6×1016N+/cm2時得到的形態變異(稱「典型無性系」)適合羊草作為優良牧草和草坪草的需要。與對照「無性系3號」相比，本方法獲得的「典型無性系」具有以下顯著特點植株矮化(營養枝高28cm，生殖枝高39cm)，葉色深綠，葉間距縮短，葉形變寬(0.65cm)，穗軸縮短(6cm)，返青早(3月5-15日)，根莖生長快(枝數316/平方米/周年)，產草量提高(3.18kg/平方米)。
表3 離子注入誘導的形態變異概率
注「-」表示未發生新的形態變異6、分子鑑定採用分子標記分析RAPD大田取200mg幼嫩葉片按CTAB法提取基因組DNA。純化後用含0.5g/mL溴化乙錠的0.8％瓊脂糖電泳檢測，模板DNA濃度平衡為100ng/μL。RAPD反應總體積為20μL，其組分為MgSO42mmol/L；(NH4)2SO410mmol/L；KCl 10mmol/L；TrisHCl(PH9.0)50mmol/L；Triton X-100 0.1％；dNTP各200μmol/L；引物0.2μmol/L；基因組模板DNA 100ng；Taq plusI DNA聚合酶0.75U(購自上海生工工程公司)，超純水13.25μl；加16μl石蠟油。PCR擴增程序94℃預變性5min，然後每個循環94℃ 40s，41℃ 90s，72℃ 70s，40個循環後，72℃延伸10min，PCR在N.J.Co.Ltd.AmpGene4800熱循環儀上完成。反應結束後PCR產物在2％瓊脂糖膠[EB(溴化乙錠)含量0.5mg/L]，1×TAE緩衝液為介質中，100V電泳1.5h，電泳結束後，紫外燈檢測並照相。用λDNA/EcoRI+HindIII做分子量標記。
結果如表4所示，表明在對照組306個株系中，沒有發現明顯的形態變異，但檢測到1個株系的DNA發生了變化，即減少了一條RAPD條帶，變異頻率為1/208＝0.48％。而處理組974個株系，發生了14個形態變異，變異頻率為14/974＝1.44％；還檢測到53條RAPD帶發生了DNA水平上的變異，變異頻率為181/3706＝4.88％。
表4 離子注入誘導的RAPD變異效率
權利要求
1.一種獲得並繁育羊草無性系的方法，是使用N+離子輻照羊草愈傷組織，再培養經N+離子輻照後的愈傷組織，得到矮化、返青早、根莖生長快的羊草無性系；所述N+離子輻照中N+的能量為20-30keV、脈衝劑量為1.4-3.4×1016N+/cm2。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述N+的能量為25keV，脈衝劑量為2.6×1016N+/cm2。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於進行N+離子輻照的羊草愈傷組織是以羊草幼穗為外植體，以含0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培養基為愈傷組織誘導培養基培養得到的。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特徵在於進行N+離子輻照的羊草愈傷組織為緊密型愈傷組織。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於經N+離子輻照後的愈傷組織的分化培養基為含有1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6培養基。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於經N+離子輻照後的愈傷組織的培養條件為25℃，光照強度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。
全文摘要
本發明公開了一種獲得並繁育羊草無性系的方法，其目的是提供一種獲得並繁育矮化、返青早、根莖生長快的羊草的方法。本發明的繁育羊草的方法，是使用N
文檔編號A01H1/06GK1543777SQ200310115338
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月19日 優先權日2003年11月19日
發明者劉公社 申請人:中國科學院植物研究所