一種針對dna甲基化監測的定量分析方法
2023-08-06 20:45:06
一種針對dna甲基化監測的定量分析方法
【專利摘要】本發明公開一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，包括如下步驟：（1）根據DNA甲基化迴文序列設計髮夾型DNA次級結構，並在該結構上修飾亞甲基藍電活性物質；（2）將髮夾型DNA與甲基轉移酶、甲基化腺苷共同反應，合成甲基化的髮夾型DNA；（3）用DpnI酶特異性地酶解DNA甲基化位點，釋放出連接有亞甲基藍的DNA碎片；（4）用帶負電的ITO微電極晶片進行樣品監測，多通路電信號讀取裝置收集電化學信號；（5）記錄監測結果。該方法具有操作簡易、便攜低廉、不需要對電極進行複雜修飾等優點；（6）在DNA甲基化過程加入抑制甲基化藥物，進行DNA甲基化抑制劑的藥物篩選。
【專利說明】一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種針對DNA甲基化水平監測的電化學定量分析方法，屬於電化學定 量分析方法【技術領域】。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化是指在甲基轉移酶的催化作用下，甲基基團從腺苷蛋氨酸中轉移至具 有特殊序列DNA的腺嘌呤或者胞嘧啶核苷酸上，常見於基因5' -CpG-3'，5' -G-A-T-C-3'序 列等，甲基化後分別形成5' -mCpG-3'和5' -G-mA-T-C-3'。在表觀遺傳學研究當中，DNA甲 基化是最早被發現的基因修飾途徑之一。DNA的甲基化對原核/真核生物起到了基因保護 作用，並且影響著哺乳動物的基因轉錄和複製，以及胚胎的形成和發育。而對於人類而言， DNA甲基化畸變會抑制DNA的轉錄，使得DNA表達失控，進而引起一系列機體病變。因此， DNA甲基化的監測對其相關的癌症早期診斷和輔助治療具有極大的臨床意義。（1、Goren， A. ; Cedar, H. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4,25-32 ；2>Bernstein, B. E. ; Meissner, A. ; Lander, E. S. Cell2007, 128, 669-681 ；3,Jones, P. A. ; Baylin, S. B. Cell2007, 128, 683-692)。
[0003] 到目前為止，各種檢測手段都被應用與DNA甲基化水平的檢測和監測。市場上比 較成熟的方法主要有甲基化特異性酶聯免疫法（methylation-specific polymerase chain reaction/MSP);亞硫酸鹽測序法（bisulfite sequencing polymerase chain reaction/BSP) 和甲基化特異性及限制性酶聯用酶聯免疫法（methylation-specific restriction enzyme polymerase chain reaction/MS-RE-PCR)等。但這些方法都是基於亞硫酸鹽處理或者酶 聯免疫試驗的基礎上進行的DNA甲基化檢測，該類方法檢測耗時長，檢測工序繁瑣，一定程 度上限制了 DNA甲基化檢測的臨床價值。因此，有必要開發出適應DNA甲基化監測需求的 新方法，以實現該指標對疾病診斷的預測和臨床治療的輔助。（4、Herman, J. G.; Graff, J. R. ; Myohanen, S. ; Nelkin, B. D. ; Baylin, S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93，9821-9826 ;5、Frommer, M. ; McDonald, L. E. ; Millar, D. S. ; Collis, C. M. ; Watt, F. ; Grigg, G. ff. ; Molloy, P. L. ; Paul, C. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992, 89, 1827-1831 ;6、Hughes, S. ; Jones, J. L. BMC Mol. Biol. 2007, 8,91-97)。
【發明內容】
[0004] 本發明針對現有DNA甲基化檢測手段繁複，單體樣品耗用量大等問題，提出一種 基於免修飾ΙΤ0微晶片的靈敏，便攜，操作簡易且耗樣量少的電化學定量監測方法。
[0005] 本發明的技術方案為： 一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，包括如下步驟： (1) 根據DNA甲基化迴文序列設計髮夾型DNA次級結構，並在該結構上修飾亞甲基藍電 活性物質； (2) 將髮夾型DNA與甲基轉移酶、甲基化腺苷共同孵育，即進行DNA甲基化反應，合成甲 基化的髮夾型DNA ; (3) 用Dpn I酶特異性地酶解DNA甲基化位點，釋放出連接有亞甲基藍的DNA碎片； (4) 用帶負電的ITO微電極進行樣品監測，多通路電信號讀取裝置收集電化學信號； (5 )根據電化學工作站的電化學信號，記錄監測結果； (6)根據DNA甲基化的作用機理，在DNA甲基化過程加入抑制甲基化藥物進行DNA甲基 化抑制劑的藥物篩選。
[0006] 其中，步驟（1)中設計有修飾了亞甲基藍並包含DNA甲基化迴文序列的髮夾型DNA 次級結構。
[0007] 其中，步驟（2)中的髮夾型DNA，甲基轉移酶（Dam MTase)，甲基化腺苷（SAM)的終 濃度分別為 1-100 μ M，0-70 U/μ 1，50-500 μ M。
[0008] 其中，步驟（2)DNA甲基化反應中，在緩衝液中進行，使用的緩衝液體系為磷酸鹽 緩衝液或Tris-HCl緩衝液。
[0009] 其中，步驟（3)中Dpn I酶的終濃度為5-50 U/μ L。
[0010] 其中，步驟（4)中帶負電的ΙΤ0微電極的製作，具體步驟如下：（1)通過光刻技術 和金屬噴鍍技術加工成三電極體系集成的ΙΤ0微電極晶片；（2)將晶片浸泡在Alconox溶 液中15分鐘，再用異丙醇浸泡15分鐘；（3)最後用二次水浸泡清洗3次，每次15分鐘，自 然晾乾，儲存備用。
[0011] 其中，步驟（4)中的DNA甲基化監測，具體步驟如下：（1)將含有甲基化迴文序列 的髮夾型DNA次級結構，（S-adenosyl-L-methiolnine/SAM)甲基化腺苷、（DTT)二硫蘇糖 醇和（Dam MTase)腺嘌呤甲基化轉移酶和Dpn I酶混合，在Tris-HCl緩衝體系中37°C下反 應；（2)每隔10分鐘取樣2 μ L (6份)，分別滴加到ΙΤ0微電極晶片的檢測區，用多路輸出 電化學工作站進行DPV示差脈衝電信號的收集。通過DPV電信號的變化趨勢來監測DNA甲 基化水平。
[0012] 本發明的優點在於：首先，對於傳統電化學檢測方法，雖然具有較高的靈敏度，但 電極修飾複雜且耗時，而本方法兼具了電化學檢測的高靈敏度，又具備免電極修飾的特性， 簡化了硬體前期準備過程； 其次，利用光刻微加工技術製備的微型ΙΤ0電極晶片，成本低，便攜可拋； 另外，相比於傳統的三電極體系，樣品試劑耗用量少，對於檢測昂貴樣品源或稀少樣品 源有極大的優勢； 再者，多通路模型的設計實現了多個樣品同時檢測的高通量檢測效果，減少了實驗耗 時，提1? 了測樣效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為帶有亞甲基藍的髮夾型DNA構型圖。
[0014] 圖2為ΙΤ0微電極晶片示意圖。
[0015] 圖3為DNA甲基化監測原理圖。
[0016] 圖4為藥物抑制效果柱狀圖。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1 ΙΤ0微電極晶片的製作 使用C〇relDraW12軟體畫出晶片的二維結構，並製作掩膜板。利用軟光刻技術將圖形 轉移到ΙΤ0玻璃板上，顯影去除曝光層後，將晶片置於酸蝕液（HC1:H20:NH03=50 :50:3)中 進行溼法刻蝕45分鐘，即可獲得晶片的ΙΤ0工作電極結構，並去除剩餘的光刻膠。再次光 刻上參比電極和對電極圖形於ΙΤ0玻璃板上，顯影去除曝光層光刻膠後，金屬濺射噴鍍上 金屬鉬層，即可獲得晶片的鉬參比電極和對電極結構，並去除剩餘的光刻膠。用二次水衝洗 微晶片並用氮氣吹乾。把製作好的ΙΤ0微晶片浸泡在Alconox清潔液（10 g/L) 15分鐘，再 用異丙醇溶液浸泡15分鐘，最後用二次水浸泡30分鐘，即可獲得帶負電的ΙΤ0工作電極微 晶片。圖2為最終ΙΤ0微晶片的模擬示意圖。
[0018] 實施例2 DNA甲基化過程的監測 用10mM的Tris-HCl緩衝液(包含10mM的MgCl2,50mM的NaCl，且pH為7. 5)作為溶 劑混合1 μ Μ的髮夾型DNA，160 μ Μ的SAM (甲基化腺苷)，1 mM DTT (二硫蘇糖醇)，50 U/mL 的Dam MTase (甲基轉移酶)和20 U/mL的Dpn I酶。在恆溫37°C下反應，每隔10分鐘取出 2 μ L樣品滴加到ΙΤ0微電極晶片的工作單元上，使用電化學工作站進行其DPV示差脈衝電 信號的收集，DPV電信號的高低即表示DNA甲基化水平的高低，進而實現對DNA甲基化水平 的實時監測。圖3為混合反應的原理示意圖，即髮夾型DNA會先與SAM和Dam MTase共反應 轉化為甲基化的髮夾型DNA，而生成的DNA甲基化位點會被Dpn I酶酶解斷開，從而使得帶 有亞甲基藍的片段核苷酸連結近ΙΤ0工作電極表面，得到增強的DPV電信號。因此，建立起 了 DNA甲基化水平和DPV電信號之間的正相關性。
[0019] 實施例3篩選DNA甲基化抑制藥物 用10mM的Tris-HCl緩衝液(包含10mM的MgCl2,50mM的NaCl，且pH為7. 5)作為溶 劑混合1 μ Μ的髮夾型DNA，160 μ Μ的SAM (甲基化腺苷)，1 mM DTT (二硫蘇糖醇)，50 U/mL 的Dam MTase (甲基轉移酶）和待篩選藥物。在水浴37°C下反應2小時使得DNA甲基化完 全。再加入（20U/mL)Dpn I酶進入樣品，再反應2小時（37°C)。最後取出2 yL樣品滴加到 ΙΤ0微電極晶片的工作單元上，使用電化學工作站進行其DPV示差脈衝電信號的收集。倘若 DPV電信號較強，說明該藥品對DNA甲基化的抑制作用不明顯；反之，則可篩選得較好的DNA 甲基化抑制藥物。根據所設計方案，使用DNA探針(序列：5' -AG GATC CCGC TTCT TTTG AAGC GGGA TCCTC-3'）對阿莫西林，青黴素，硫酸慶大黴素，氧氟沙星，氟尿嘧啶和絲裂黴素等6種 藥物進行篩選，結果顯示青黴素，硫酸慶大黴素和氟尿嘧啶對DNA甲基化水平有接近35% ~ 50%的抑制效果，而另外三種藥物沒有抑制效果。圖4為藥物抑制效果柱狀圖，其中阿莫西 林，氧氟沙星和絲裂黴素與無藥物作用的DPV電信號相近，說明這三種藥物沒有起到抑制 效果，而青黴素，硫酸慶大黴素和氟尿嘧啶有明顯的抑制效果，其中硫酸慶大黴素的抑制效 果最好，達到50%的抑制率。 SEQUENCE LISTING 〈110>福州大學 〈120> -種針對DNA甲基化監測的定量分析方法 1 1 Patentln version 3. 3 1 31 DNA 〈213> DNA 探針 1 aggatcccgc ttcttttgaa gcgggatcct c 31
【權利要求】
1. 一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：包括如下步驟： (1) 根據DNA甲基化迴文序列設計髮夾型DNA次級結構，並在該結構上修飾亞甲基藍電 活性物質； (2) 將髮夾型DNA與甲基轉移酶、甲基化腺苷共同反應，即進行DNA甲基化反應，合成甲 基化的髮夾型DNA ; (3) 用Dpn I酶特異性地酶解DNA甲基化位點，釋放出連接有亞甲基藍的DNA碎片； (4) 用帶負電的ITO微電極晶片進行樣品監測，多通路電信號讀取裝置收集電化學信 號； (5 )根據電化學工作站的電化學信號，記錄監測結果； (6)根據DNA甲基化的作用機理，在DNA甲基化過程加入抑制甲基化藥物，進行DNA甲 基化抑制劑的藥物篩選。
2. 根據權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：步 驟（1)中的修飾有亞甲基藍並包含DNA甲基化迴文序列的髮夾型DNA次級結構設計。
3. 根據權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：步 驟（2)中的髮夾型DNA，甲基轉移酶（Dam MTase)，甲基化腺苷（SAM)的終濃度分別為1-100 μ M, 0-70 U/μ 1,50-500 μ Μ〇
4. 根據權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：步 驟（2)DNA甲基化反應中，在緩衝液中進行，使用的緩衝液體系為磷酸鹽緩衝液或Tris-HCl 緩衝液。
5. 根據權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：步 驟（3)中Dpn I酶的終濃度為5-50 U/μ L。
6. 根據權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：步 驟（4)中帶負電的IT0微電極的製作，包括如下步驟：（1)通過光刻技術和金屬噴鍍技術加 工成三電極體系集成的IT0微電極晶片；（2)將晶片浸泡在Alconox溶液中15分鐘，再用 異丙醇浸泡15分鐘；（3)最後用二次水浸泡清洗3次，每次15分鐘，自然晾乾，儲存備用。
7. 根據權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法，其特徵在於：步 驟（4)中的DNA甲基化監測，包括如下步驟：（1)將含有甲基化迴文序列的髮夾型DNA次級 結構，甲基化腺苷、二硫蘇糖醇和腺嘌呤甲基化轉移酶和Dpn I酶混合，在Tris-HCl緩衝體 系中37°C下反應；（2)每隔10分鐘取樣2 μ L，取6份，分別滴加到IT0微電極晶片的檢測 區，用多路輸出電化學工作站進行DPV示差脈衝電信號的收集，通過DPV電信號的變化趨勢 來監測DNA甲基化水平。
8. -種如權利要求1所述的一種針對DNA甲基化監測的定量分析方法在DNA甲基化抑 製劑的藥物篩選上的應用。
【文檔編號】G01N27/30GK104062334SQ201410328685
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】林振宇, 魏曉峰, 馬小明, 郭隆華, 邱彬, 陳國南 申請人:福州大學