用表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法
2023-08-06 07:21:06
專利名稱::用表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法
技術領域:
:本發明屬於用波長檢測型表面等離子體子共振(Surfaceplasmonresonance,SPR)傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法領域,特別涉及本課題組研製的波長檢測型SPR分析儀及其應用方法。技術背景自從Liedberg等將SPR技術用於化學和生物傳感器研究領域以來,SPR傳感器逐漸成為國際傳感器領域的研究熱點。近年來在分子水平上進行功能研究的技術大量湧現,其中SPR技術比較引人注目。尤其自上世紀九十年代Pharmacia公司(現為BIAcoreAB公司)將這一技術商品化以來,SPR技術用於生物分子相互作用的研究取得了迅猛的發展。短短幾年內,運用此新技術所發表的文獻幾乎包括了現代生物醫學的各個領域,使分子相互作用的研究取得了前所未有的突破,進而全面推動了生命科學研究的各個領域的進展。由於SPR技術具有能實時監測反應動態過程、樣品無需標記、靈敏度較高、無背景幹擾等特點,主要應用於研究大分子之間的相互作用,可得到反應物分子之間每一步的鍵合信息,測定動力學常數,已在生物科學領域應用中取得了長足進展。據粗略的統計,在生物傳感器領域發表的文章中,大約有70%報導了關於SPR傳感器被應用到對生物分子間反應的檢測。已報導的各類SPR商品儀器都是採用固定波長,測定共振角度變化的工作模式,這種工作模式,或者需要有一個機械傳動裝置來改變入射光角度,或者需要通過點光源的發散作用,測定角度的變化。前者在儀器中有一個可動部件,後者測量的角度範圍較小,限制了方法的應用。這類市售的稜鏡型SPR傳感器儀器價格昂貴,不宜普及。自行設計組裝的波長檢測型SPR分析儀容易實現多波長同時檢測,且檢測的波長範圍不受限制,這樣不僅使傳感器表面被檢測物質量的範圍不受限制,即折射率變化的範圍不受限制,而且非常有益於分子間或分子與組織(如細胞)間相互作用的研究;其次,由於現在用于波長選擇的器件比較成熟,且有的器件具有很高的波長分辨能力,所以有望進一步提高SPR分析儀的靈敏度。本儀器特別適於分子間相互作用的研究,對於研究藥物與生物分子的作用、藥物篩選及藥物化學的發展具有重要意義,且對SPR傳感器方法、儀器裝置的發展及應用也具有重要意義。傳統的藥物與蛋白質結合的研究方法有平衡透析法和超濾法。其中平衡透析法為經典的參比方法,由於需建立結合平衡,運用此法耗時長(幾個小時或幾天)。超濾法則由於常需進行放射性或螢光標記而帶來很大不便。這兩種方法均存在膜對藥物的吸附,以及Donnan效應(由於蛋白和藥物均帶電荷,使得膜兩側的游離藥物濃度不相等)等問題,對於高結合率藥物的游離藥物濃度難以準確檢測。其他方法還有免疫分析法,液相色譜法,螢光淬滅法和毛細管電泳法。其中免疫分析法耗時長,而且只能用於定性、半定量,無法滿足深層次藥物與蛋白質結合研究的要求;液相色譜法不僅需要樣品量大、柱吸附嚴重,且常需添加改良溶劑,不能準確評價生理條件下的藥物與蛋白質結合作用;當藥物與白蛋白結合的位點遠離色氨酸時,此時應用螢光淬滅法就不能檢測到藥物與蛋白的結合;毛細管電泳法最主要的缺點是它的靈敏度不高。近年來,SPR已經廣泛應用於藥物一蛋白的結合研究。將一系列藥物作用在已固定的蛋白上,根據藥物與蛋白作用的SPR信號強度來確定藥物與蛋白的結合情況。在SPR的應用中,一般要求作敏感膜的分子一端為可與金或銀鍵合的活性基團,而其另一端為具有分子識別功能的活性基團。巰基丙酸的巰基端可與金膜連接,另一末端的羧基可作為活性基團,用其連接抗體分子,結果良好。
發明內容本發明的目的是採用波K:檢測型SPR傳感器,研究藥物分子與生物分於的相互作用。本發明通過以下技術方案來加以實現採用波長檢測型SPR傳感器,研究藥物分子與生物分子相互作用的方法,涉及下列步驟1.釆用本課題組研製的波長檢測型SPR分析儀由光源l、導光系統2,3,4,10,11、傳感元件5,6、流通池7,8,9、分光檢測系統12和數據處理系統組成;2.傳感器的製備採用下列步驟在波長檢測型SPR分析儀中,選用玻璃稜鏡5作為傳感器的傳感元件;採用真空鍍膜法,在稜鏡5的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜,作為傳感器的傳感膜6;3.在傳感膜6底部的流通池7中注入巰基丙酸(MPA)溶液,待MPA在金膜表面自組裝完成後,將磷酸鹽(PBS)緩衝溶液注入到流通池7中反覆衝洗,以清除傳感器表面的非特異性結合;4.待共振波長不再變化後,向流通池7中注入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)隱carbodimidehydrochloride,C8H17N3'HC1,分子量為191.7,簡稱EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide,C4H5N03,分子量為115.1,簡稱NHS)溶液,觀察SPR光譜隨時間的變化,當共振波長基本穩定時,用PBS緩衝溶液反覆衝洗傳感器表面至共振波長不再發生變化;5.注入血清白蛋白溶液,記錄共振波長隨時間的變化情況,當血清白蛋白形成穩定的單分子層後,共振波長穩定時,此時將PBS緩衝溶液注入到流通池7中反覆衝洗至共振波長不再發生變化;6.將藥物分別用PBS緩衝溶液稀釋為n個不同濃度,依次注入到流通池7,記錄共振波長隨時間的變化。每個樣品監測完畢後,均注入PBS緩衝溶液衝洗流通池7。7.通過藥物的濃度[D]、波長變化A入、波長變化的響應信號AXmax,,通過以下方程(1)可計算出反映藥物分子與生物分子相互作用的結合速率常數ka和解離速率常數kd。dA入/dt=ka[D](Almax—AX)—kdA人(1)本發明還可以在MPA自組裝完畢後,引入用以提高傳感器靈敏度的金納米粒子。本發明還可以在MPA自組裝完畢後,引入用以提高傳感器靈敏度的一層或多層除血清白蛋白之外的蛋白,構成三明治夾心式傳感器。本發明所採用的儀器由光源、導光系統(透鏡、偏振片、光纖)、傳感元件(玻璃稜鏡、傳感膜)、流通池、分光檢測系統(CCD檢測器)和數據處理系統組成用滷鎢燈或發光二極體作為光源,從光源發出的白色光經過平行偏振光管(由二個透鏡和一個偏振片組成)後變成平行偏振光,以一定的角度照射到稜鏡的側面上,經折射後光線到達稜鏡的底部。採用真空鍍膜法,在稜鏡的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜,採用分子自組裝法在金屬膜表面塗一層對待測物有特異結合能力的分子,組成敏感膜,光線在稜鏡與金屬的界面處發生全內反射,然後從稜鏡的另一個側面折射出去,通過下一個透鏡聚焦耦合進入光導纖維,由光纖將信號光再傳輸至光柵和電荷耦合器件(CCD)檢測器,當溶液中含有待測物及待測物濃度改變時,共振波長有明顯變化,據此對待測物進行研究。實驗方法是將傳感器固定在流通池口上面,流動注射進樣,當試樣通過流通池時傳感器鍍膜一面與被分析試液接觸,複色光通過偏振片及透鏡後照射在稜鏡上,發生共振,產生強烈的共振吸收,通過繪製反射光強度隨波長的變化曲線,對被測物質進行研究。本發明研究的藥物分子和生物分子相互作用的結合速率常數ka和解離速率常數kd的計算方法如下前述方程(1)中AX是共振波長的變化,即SPR的信號,其代表了傳感器表面血清白蛋白(P)和藥物(D)的濃度。dA入/dt是SPR信號的變化速率。A入max是傳感器表面結合藥物飽和時的響應信號,即相當於傳感器表面形成的PD複合物的最大濃度。方程(1)的積分形式為AX={ka[D]A、ax/(ka[D]+kd)}{1-exp(-([D]ka+kd)t)(2)解離過程可用下列方程表示d扁t--kaA入(3)它的積分形式為InAVA入c^-kd(t-10)(4)式中t。是反應開始的時間,其所對應的SPR信號為AX。,而A人是任何時刻t的SPR信號。根據實驗數據和方程(1)—(4),可求出動力學數據ka,kd和熱力學數據結合常數KA和解離常數Ko。圖1為波長檢測型SPR分析儀的結構示意圖;1為光源,2、3和10為透鏡,4為偏振片,5為玻璃稜鏡,6為傳感膜,7為流通池,8為進樣口,9為排廢口,ll為光纖,12為CCD檢測器。圖2為流通池結構示意圖;5為玻璃稜鏡,6為傳感膜,7為流通池,8為進樣口,9為排廢口,13為水浴,14為水浴入水口,15為水浴出水口。圖3為傳感器連接示意圖,也是摘要附圖;6為傳感膜,16為玻璃基底(稜鏡底面),17為巰基丙酸和NHS、EDC修飾層,18為血清白蛋白層,19為藥物分子連接層。圖4為不含MPA及含有MPA溶液引入樣品池時得到的SPR光譜;20為不含MPA時得到的SPR光譜;21為含有MPA時得到的SPR光譜。具體實施方式實施例l:抗生素類藥物與人血清白蛋白相互作用的研究抗生素又稱抗菌素。是由一些微生物合成的、能抑制或殺滅某些病原體的化學物質。抗生素是微生物的一種次生代謝產物,少量低濃度使用時能對另一種微生物的生長和代謝起抑制或殺滅作用。現已發現400多種抗生素,各種抗生素的抗菌機理和作用各不相同。如青黴素和桿菌肽能阻礙細菌細胞壁的合成;多肽類抗菌素可破壞細菌的質膜;氯黴素、鏈黴素等可抑制蛋白質的合成或幹擾核酸的合成等。有的抗菌素作用範圍小,如青黴素只對革蘭氏陽性細菌有效,叫做狹譜抗菌素。有些抗生素作用範圍較廣,如四環素對多數細菌均有抑制作用,稱做廣譜性抗生素。目前廣泛應用的抗生素約IOO多種,如青黴素、鏈黴素、慶大黴素等都普遍用於醫療。在農業上春雷黴素、井崗黴素已廣泛用於水稻病菌的防治,滅瘟素用T防治稻瘟病,赤黴素用於促進植物的生長等等。但在使用抗生素時要針對病症、不可亂用。有的抗生素能產生一些副作用,如連續使用鏈黴素、慶大黴素都會引起耳聾,服用過量的氯黴素可造成白細胞減少等。也有些人對某種抗生素有過敏反應,嚴重時甚至有致命危險。本發明應用自行設計並組裝的波長檢測型SPR分析儀,釆用氨基耦聯的方法將血清白蛋白固定在傳感器表面,研究了青黴素VK,苯唑西林,阿莫西林,頭孢哌酮,頭孢噻肟鈉,依諾沙星,諾氟沙星七種抗生素藥物與人血清白蛋白(HSA)的相互作用。測定了反應的動力學常數及平衡常數,同時計算了它們的鍵合百分率。1.儀器採用本課題組研製的波長檢測型SPR分析儀;試劑3—巰基丙酸(MPA),NHS,EDC青黴素VK,苯唑西林,阿莫西林,頭孢哌酮,頭孢噻肟鈉,依諾沙星,諾氟沙星標準品人血清白蛋白、牛血清白蛋白其它所有試劑均為國產分析純試劑2.傳感器的製備採用下列步驟在波長檢測型SPR分析儀中,選用直角玻璃稜鏡的底面作為傳感器的傳感元件;採用真空鍍膜法,在稜鏡的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜,作為傳感器的傳感膜;3.將樣品池中注入PBS緩衝溶液,記錄共振波長,將10mmol/L的MPA溶液注入樣品池中,通過觀測SPR共振波長的位移,從而監測MPA與金結合的動力學過程。圖4為不含MPA及含有MPA溶液引入樣品池時得到的SPR光譜。將含有MPA的溶液注入樣品池後,隨著時間的推移,共振波長不斷向長波方向移動,且在開始的幾分鐘內組裝較為迅速。在5min內,SPR光譜共振波長位移值達總量的99%,30min左右組裝基本完全,共振波長的最大位移值為11.67nm。用PBS緩衝溶液衝洗傳感器表面至共振波長基本不再變化,說明MPA的巰基端與金形成的S-Au鍵很穩定。4.向流通池中加入濃度均為40mg/mL的EDC和NHS混合溶液,EDC可催化MPA和NHS的反應,使MPA的羧基端醯化,以利於血清白蛋白的連接。5.在MPA修飾膜組裝完全後,用PBS緩衝液反覆衝洗傳感器表面,以清除特異性吸附。然後將血淸白蛋白注入樣品池。因MPA的羧基端醯化後對血清白蛋白Fc段能特異性結合,可使血淸白蛋白在敏感膜上定向自組裝。實驗考察/人血清白蛋白(HSA)濃度對其在MPA上進行定向自組裝的影響。將HSA配製成濃度為0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL的溶液,不同濃度的HSA在MPA上自組裝的結果(12h)見表l。綜合考慮,選擇HSA的濃度為0.1mg/mL。表l不同濃度的HSA在MPA上自組裝的結果(12h)tableseeoriginaldocumentpage76.當血清白蛋白存:敏感膜上自組裝成穩定的分子膜後,用PBS緩衝液反覆衝洗流通池,待共振波長不再改變時,向流通池中依次注入不同濃度的青黴素VK,苯唑兩林,阿莫西林,頭孢哌酮,頭孢噻肟鈉,依諾沙星或諾氟沙星(均用PBS配製),實時監測並記錄SPR光譜的共振波長位移值,測定時間為30min。7.根據監測所得數據,經過分析並計算,可得到這些藥物與HSA以及BSA之間鍵合的動力學常數、熱力學常數及鍵合百分率(見表2)。表2藥物與HSA之間鍵合的熱力學常數及鍵合百分率tableseeoriginaldocumentpage7這7種抗生素類藥物與HSA都有不同程度的結合,藥物與《八的鍵合百分率範圍是91.2—41.1%,它們的鍵合能力的順序為,青黴素vio頭抱哌酮〉頭孢噻肟鈉>苯唑西林>阿莫西林>依諾沙星>諾氟沙星。實施例2:蒽醌類藥物與人血清白蛋白相互作用的研究大黃是我國的四大中藥之一,始載於《神農本草經》。我國大黃的產量佔世界第一位,並且質量最優。4600年前我國已開始應用大黃。目前已有十九個國家藥典收載了大黃作為法定藥物使用。人黃主要含蒽醌類衍生物,其含量為35%,一部分為游離狀態,如人黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素等;大部分為結合狀態,其中屬蒽醌甙類的有大黃酸、葡萄糖甙、大黃酚葡萄糖甙等。具有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經的功能。用於實熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽,溼熱黃疸、血熱吐衄、目赤、咽腫、腸癰腹痛、癰腫疔瘡、瘀血經閉、跌打損傷等病症。現代臨床可用於治療流行性腦膜炎、大葉性肺炎、急性膽道感染、急性腮腺炎、急性闌尾炎、急性傳染性黃疸型肝炎、急性腸炎、細菌性痢疾、消化道出血、咽喉炎、牙齦膿腫、皮炎、溼疹、淋病、帶狀皰疹等。研究蒽醌類藥物與血清白蛋白的相互作用的有螢光光譜法、紫外光譜法。本發明應用自行設計並組裝的波長檢測型SPR分析儀,以3—巰基丙酸(MPA)作為固定HSA的連接層,研究了大黃中的主要成分大黃素、大黃酚、及大黃素甲醚與HSA的相互作用,並分別計算了它們的動力學常數、熱力學常數及鍵合百分率。方法同實施例l。結果見表3。表3蔥醌類藥物與HSA的結合的動力學常數、熱力學常數及結合百分率藥物分子量結合速率常數解離速率常數解離常數麼上a£n口百分率大黃素270.232息1(^4.09x10"196,4677.43大黃酚244.234.43x101306.7568.69大黃素甲醚284.004.56x1019.71x10-321375.94實施例3:人參皂甙與血清A蛋白相互作用的研究人參,俗稱"棒槌",屬五加科多年生草本植物,是我國重要特產之一,也是馳名中外的珍貴藥材,被人們稱為"百草之王",屬東北"三寶"之一。人參根、莖、葉、花及果實富含多種人參皂甙,此外人參根含揮髮油0.12%,莖葉含揮髮油0.13%,花含揮髮油0.29%。人參根的非極性部分含人參炔醇、a—人參萜、卜人參萜以及甾醇化合物。人參還含有賴氨酸、組氨酸、精氨酸等多種胺基酸、維生素、多種有機酸、黃酮類化合物以及糖。經過中醫多年的臨床實驗,人參能夠補血養氣、固津生液、調節神經、開心明目、益智安神、降低血糖、健胃、利尿等;對T治療久病衰弱的患者,非常有效。主治神經衰弱症、各種神經病、植物性神經病失調、性神經衰弱、智力減退、貧血、糖尿病、胃病、肝病,以及心血管系統的疾病等。此外,適量久服,還可以使人增加對各種致病因子的抵抗力,對人體並不產生任何副作用和損害。人參的大部分年藥理作用是由人參皂甙來決定的。迄今已分離到人參皂苷單體有40餘種,它對人體的一些組織結構有很大的影響可以保護神經細胞免受一些有害化合物的侵害;可通過降低神經傳導素來調節神經傳輸;在藥物誘導睡眠方面起著很大的作用;還可通過不同的機理對癌細胞產生影響,抑制癌細胞的生長,或轉移癌細胞素。本發明應用自行設計並組裝的波長檢測型SPR分析儀,以3—巰基丙酸(MPA)作為固定血清白蛋白的連接層,研究了6種人參皂甙單體(Rbl,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Re)分別與人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。分別計算了它們的動力學常數、熱力學常數及鍵合百分率,並比較了不同人參皂甙單體與血清白蛋白的鍵合能力。方法同實施例l。結果見表4。表4人參皂武與HSA和BSA結合的動力學常數、熱力學常數及結合百分率蛋白人參皂甙分子裡結合速率常數解離速率常數解離常數結合百分率HSARb,11104.74x1012.31xl0-348.71±3.093.19±0.9Rb210782.26xl039.18xl(T240.62±2.994.37±0.7Rb3翻2.35xl022.35xlO-2100.0±18.088.33±2.3Rc10783.13xl029.71xl0-331.00±2.595.58±0.5Rd9463.50xl022.84xl0-281.23±15.089.23±2.0Re9461.14xl032.31xl0-220.32±1.997.10±0.4BSARb,11106.27xl022.84xl0—245.26±2.993.71±0.8Rb2顧1.63xl047.37x10-345.26±3.193.71±1.0Rb310783.33xl026,76xl0-320.31±1.797.10±0.3Rc10789.40x102.91x10-2309.6±26.068.47±4.8Rd9466,59x109.71xlO-3147.3±23.082.05士4.5Re9461.67xl021.36xl(T281.23±13.089.23±1.8權利要求1.用表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法,其特徵在於採用下列步驟(1)採用本課題組研製的波長檢測型SPR分析儀由光源(1)、導光系統(2,3,4,10,11)、傳感元件(5,6)、流通池(7,8,9)、分光檢測系統(12)和數據處理系統組成;(2)傳感器的製備採用下列步驟在波長檢測型SPR分析儀中,選用玻璃稜鏡(5)作為傳感器的傳感元件;採用真空鍍膜法,在稜鏡(5)的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜,作為傳感器的傳感膜(6);(3)在傳感膜(6)底部的流通池(7)中注入巰基丙酸(MPA)溶液,待MPA在金膜表面自組裝完成後,將磷酸鹽(PBS)緩衝溶液注入到流通池(7)中反覆衝洗,以清除傳感器表面的非特異性結合;(4)待共振波長不再變化後,向流通池(7)中注入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodimidehydrochloride,C8H17N3·HCl,分子量為191.7,簡稱EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide,C4H5NO3,分子量為115.1,簡稱NHS)溶液,觀察SPR光譜隨時間的變化,當共振波長基本穩定時,用PBS緩衝溶液反覆衝洗傳感器表面至共振波長不再發生變化;(5)注入血清白蛋白溶液,記錄共振波長隨時間的變化情況,當血清白蛋白形成穩定的單分子層後,共振波長穩定時,此時將PBS緩衝溶液注入到流通池(7)中反覆衝洗至共振波長不再發生變化;(6)將藥物分別用PBS緩衝溶液稀釋為n個不同濃度,依次注入到流通池(7),記錄共振波長隨時間的變化,每個樣品監測完畢後,均注入PBS緩衝溶液衝洗流通池(7)。(7)通過藥物的濃度[D]、波長變化Δλ、波長變化的響應信號Δλmax,,通過以下方程(1)可計算出反映藥物分子與生物分子相互作用的結合速率常數ka和解離速率常數kd。dΔλ/dt=ka[D](Δλmax-Δλ)-kdΔλ(1)。2.根據權利要求1的方法,其特徵在於MPA自組裝完畢後,引入用以提高傳感器靈敏度的金納米粒子。3.根據權利要求l的方法,其特徵在於MPA自組裝完畢後,引入用以提高傳感器靈敏度的一層或多層除血清白蛋白之外的蛋白,構成三明治夾心式傳感器。全文摘要本發明屬於用波長檢測型表面等離子體子共振傳感器研究藥物與生物分子相互作用的方法領域。採用波長檢測型SPR分析儀,選用玻璃稜鏡作為傳感器的傳感元件,採用真空鍍膜法,在稜鏡的傳感面鍍約50nm厚的金或銀膜,在傳感膜底部的流通池中依次注入巰基丙酸(MPA)溶液,1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(簡稱NHS)溶液,血清白蛋白溶液,當共振波長基本穩定時,用PBS緩衝溶液反覆衝洗傳感器表面至共振波長不再發生變化;將藥物分別用PBS緩衝溶液稀釋為n個不同濃度,依次注入到流通池,記錄共振波長隨時間的變化。通過計算,可以得到藥物分子與蛋白分子相互作用的動力學常數、熱力學常數以及結合百分率。文檔編號G01N21/55GK101271066SQ20071005542公開日2008年9月24日申請日期2007年3月19日優先權日2007年3月19日發明者霞劉,穎孫,宋大千,張寒琦,曹彥波,媛田申請人:吉林大學