一種基於標準樣品的實時螢光pcr相對標定方法
2023-08-07 00:34:16
專利名稱：一種基於標準樣品的實時螢光pcr相對標定方法
技術領域：
本發明屬於光學和生物技術交叉領域，涉及一種實時螢光PCR的標定方法，尤其 是一種基於標準樣品的實時螢光PCR相對標定方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction簡稱PCR)技術是一種在體外模擬自 然DNA複製過程的核酸擴增技術，亦稱無細胞分子克隆技術，其原理類似於天然DNA的復 制，是體外酶促反應選擇性地合成特異性DNA的一種方法。實時螢光PCR技術於1996年由 美國Applied biosystems (ABI)公司推出，它是一種在PCR反應體系中加入螢光基團，利用 對螢光信號積累的實時檢測來檢測整個PCR進程，最後通過校正曲線對未知模板進行定量 分析。該技術在常規PCR基礎上運用螢光標記探針，實時檢測檢測PCR產物。一方面提高了 靈敏度，另一方面利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，建立實時擴增曲線，最後通過 標準曲線對未知模板進行定量分析。實時PCR技術具有較好的優勢，操作簡便、快速高效、 高敏感性、重複性、特異性與多重擴增。目前，實時螢光PCR儀中大多採用CCD作為探測器，它最大的優點是能夠同時掃描 多個螢光信號，速度較快，但是靈敏度低，而且同時檢測樣品間的螢光信號存在幹擾，使檢 測結果受到很大的影響。比較了大量的螢光PCR儀的文獻之後發現，對基於CCD的螢光PCR 儀的標定方面的報導較少，大多集中在如何檢測螢光信號的研究上。這直接影響到生物PCR 產品使用的可靠性、推廣性、實驗結果的社會認可以及產業化生產過程中的質量控制。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提出一種基於標準樣品的實時螢光PCR相對標定方 法。該方法利用被標定的樣品為實時螢光PCR儀提供標準的螢光信號，實現實時螢光PCR 儀螢光檢測精度的標定。因實時螢光PCR儀是一種相對測量的方法，所以本發明也採用相 對標定的方法。本發明是通過下述的技術方案實現的在本發明方法中需要一臺已標定的螢光檢測儀、一臺待標定的實時螢光PCR儀、η 個樣品試管、螢光粉末和環氧樹脂膠水。把由螢光粉末和膠水混合凝固製作而成的樣品試 管放入已標定的螢光檢測儀中，得到螢光光強的標準數據。已標定的螢光檢測儀由單色LED 連接積分球作為激發光源，光電倍增管作為光電探測器，並通過儀器控制系統為儀器供電、 調製光電倍增管的放大倍率以及RS232串口把結果輸出到電腦上。本發明方法的具體步驟為步驟一製作標準樣本1-1將待標定的實時螢光PCR儀最大量程進行η等分，然後取η個相同的透明樣品 試管，依次編號為1至η，其中η > 10。1-2取一個燒杯，在燒杯中加入e mg的螢光粉末和f ml的環氧樹脂膠，攪拌均勻， 使螢光粉末完全溶解在環氧樹脂膠中，形成膠水混合物；然後取一個針筒，將s ml (0 < s<f)的膠水混合物注入第η號試管中，則該試管內的螢光粉末濃度K為 χ e
權利要求
一種基於標準樣品的實時螢光PCR相對標定方法，其特徵在於該方法包括如下步驟步驟一、製作標準樣本1 1將待標定的實時螢光PCR儀最大量程進行n等分，然後取n個相同的透明樣品試管，依次編號為1至n，其中n≥10；1 2取一個燒杯，在燒杯中加入e mg的螢光粉末和f ml的環氧樹脂膠，攪拌均勻，使螢光粉末完全溶解在環氧樹脂膠中，形成膠水混合物；然後取一個針筒，將s ml的膠水混合物注入第n號試管中，則該試管內的螢光粉末濃度δn為 n= e f 為了使這n個試管的螢光強度依次線性增強，則第i號試管內螢光粉末的濃度為 i= i n n= ie nf, 其中1≤i≤n由此完成第i號試管後，燒杯中應加入的膠水體積Δvi 1為 v i-1 = nf-[i+ ( i + 1 )+...+n]s i-1 從而得到螢光強度依次線性增強的n個試管；1 3把n個試管靜置直至膠水完全凝固，從而完成第1至n號標準樣本的製作；步驟二、計算校準標準值2 1打開已標定的螢光檢測儀，調整光電倍增管增益，使儀器穩定；2 2把步驟一中得到的n個標準樣本依次放入已標定的螢光檢測儀中，得到一組標準螢光光強測量值a1、a2、···、an；再計算得到一組對應的校準標準值A1、A2···、An，其中A1＝a1/an、A2＝a2/an、···An＝an/an；步驟三、待標定儀器數據檢測3 1打開待標定的實時螢光PCR儀，等待穩定儀器；3 2把步驟一中得到的n個標準樣本放入待標定的實時螢光PCR儀中，得到一組測量值b1、b2、···、bn；再計算得到一組對應的待標定測量值B1、B2···、Bn，其中B1＝b1/bn、B2＝b2/bn、···Bn＝bn/bn；步驟四、得出標定結果通過校準標準值數據組與待標定測量值數據組比對得到待標定的實時螢光PCR儀的各點偏差Di和平均偏差d，從而完成實時螢光PCR相對標定；其中Di＝|Ai Bi|，FSA00000330900400021.tif
全文摘要
本發明涉及一種基於標準樣品的實時螢光PCR相對標定方法。現有技術中還未見實時螢光PCR標定方法。本發明方法包括標準樣本的製作步驟、校準標準值的計算步驟、待標定儀器數據的檢測步驟和確定標定結果步驟。本發明採用按測量範圍等分的螢光粉末，能使螢光樣本產生的螢光光強覆蓋整個測量範圍。
文檔編號C12N15/10GK101979544SQ20101053051
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月2日 優先權日2010年11月2日
發明者俞曉平, 葉子弘, 孔明, 崔海峰, 程琦 申請人:中國計量學院