幼魚苗用飼料及用於其中的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的製造方法
2023-08-06 08:22:51
專利名稱：幼魚苗用飼料及用於其中的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的製造方法
技術領域：
本發明提供使用減少了肌醇六磷酸的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的幼魚苗用飼料。本發明還涉及該減少了肌醇六磷酸的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的製造方法。
背景技術：
以往，一直使用大豆原料(豆餅、豆乳、大豆蛋白等)作為養魚用飼料的蛋白原料。
此外，已知如果除去大豆中所含的肌醇六磷酸的話，能夠提高飼料的效率。
作為除去或者分解肌醇六磷酸的發明，已知(a)飼料(特開平11-000164號公報、特開平8-205785號公報)、(b)脫脂大豆、豆腐渣等大豆由來的飼料材料(特開平9-140334號公報)、(c)大豆蛋白(本申請申請人的特開2000-300185號公報、特開4503002號公報)和(d)豆乳(特開照59-166049號公報、本申請申請人的特開2000-245340號公報)等。
但是，低肌醇六磷酸鈣鎂水解物還沒有用在養魚用飼料中。
一方面，本申請人一直在研究使用用酶水解大豆蛋白原料得到的蛋白水解物作為養魚用飼料。例如，特開平7-227223號公報中記載的提高幼魚苗的存活率的魚飼料的發明、特開平8-51937號公報中記載的發明等。此外，為了進一步提高幼魚苗的存活率，對大豆蛋白水解物的改良也進行了研究。
另一方面，關於大豆蛋白水解物，本申請申請人公開了用於腎病患者的、以樹脂除去肌醇六磷酸的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物(特開平8-092123號公報)。
再一方面，已知接種曲菌使大豆蛋白發酵，進行蛋白分解和肌醇六磷酸酶處理，來製造低肌醇六磷酸鈣鎂蛋白水解物(特開平9-023822號公報)。
其它方面，有以下發明，即酶處理大豆蛋白原料時，由於使用粗酶，蛋白分解酶和肌醇六磷酸酶起相同的作用，或者將蛋白酶分解和肌醇六磷酸酶處理結合的發明，但是沒有公開，也沒有教導酶分解的大豆蛋白用於養魚中等的內容(特開昭51-125300號公報、特開2000-51706號公報等)。
如上所述，本申請人在不斷研究在養魚用飼料中使用大豆蛋白水解物，也一直在研究低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物，但並不知道將它們用在養魚用飼料特別是幼魚苗中。
另外，除去大豆的肌醇六磷酸的方法包括(1)在使用鹽的水提大豆蛋白的過程中除去肌醇六磷酸的方法(特開平8-173052號公報、特開平9-121780號公報等)、(2)用肌醇六磷酸酶等分解肌醇六磷酸的方法、(3)用樹脂等吸附除去的方法(特開2001-163800號公報)等，與(1)和(3)的方法相比，(2)的方法的工序不複雜，在工業上是有利的。
此外，關於該(2)用肌醇六磷酸酶等分解肌醇六磷酸的方法的對象，(a)熟知的是作為飼料等用途的大豆、脫脂大豆等、(b)也已知豆乳、大豆分離蛋白等幾種，但關於(c)植物蛋白水解物混合物不太知道。
已知例如(a)飼料(特開平11-000164號公報、特開平8-205785號公報)、(b)脫脂大豆、豆腐渣等大豆由來的飼料材料(特開平9-140334號公報)、大豆蛋白(本申請申請人的特開2000-300185號公報、特開4503002號公報)和豆乳(特開昭59-166049號公報、本申請申請人的特開2000-245340號公報)等。
但是，關於(c)低肌醇六磷酸鈣酶植物蛋白水解物卻不為人所知，在本申請申請人的特開平8-092123號公報中公開了使用樹脂的方法。
另外，在特開平9-023822號公報中，公開了接種曲菌使大豆分離蛋白發酵，同時進行酶分解和肌醇六磷酸酶處理，得到肌醇六磷酸含量低的肽生成物的方法。
但是，還沒有如本發明所述的使肌醇六磷酸在檢測界限以下的方法。
發明內容
本發明人等在進行研究中發現，為了使用植物蛋白水解物作為消化吸收功能不夠發達的小魚、魚苗、出生後成活的魚用的飼料，肽生成物是不夠充分的，需要消化吸收性優異且肌醇六磷酸含量極少的植物蛋白水解物。因此，本發明的目的在於得到肌醇六磷酸含量極少的低肌醇六磷酸植物蛋白水解物，特別優選得到肌醇六磷酸在檢測界限以下的低肌醇六磷酸植物蛋白水解物。
進一步的目的在於使用這種低肌醇六磷酸植物蛋白水解物的魚苗用飼料。
本發明人等通過不斷悉心研究，結果發現通過減少在飼料中使用的大豆蛋白水解物所含的肌醇六磷酸，可以提高幼魚苗的存活率，可以促進魚苗的生長發育，從而完成了本發明。
另外，通過以下發現，得到低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物。
也就是說，本申請人先完成了通過樹脂處理得到的低肌醇六磷酸鈣鎂蛋白水解物(特開平8-092123號公報)，但為了使肌醇六磷酸含量在檢測界限以下，樹脂處理很麻煩。
另一方面，本申請人用肌醇六磷酸酶處理大豆蛋白，製造低肌醇六磷酸大豆蛋白(特開2000-300185號公報)，但只酶解該低肌醇六磷酸大豆蛋白，也難於得到肌醇六磷酸含量非常低，即在檢測界限以下的大豆蛋白水解物。
因此，進一步悉心研究，發現首先將大豆蛋白酶解至特定的分子量範圍，之後進行肌醇六磷酸酶處理，可以得到肌醇六磷酸非常少(檢測界限以下)的大豆蛋白水解物。
還發現在酶解大豆蛋白時，從大豆原料水提取大豆蛋白後，如果不進行乾燥就進行酶解的話，先進行肌醇六磷酸酶處理，然後進行酶解，也能除去肌醇六磷酸至檢測界限以下。
令人更加意外的是，這些肌醇六磷酸含量在檢測界限以下即肌醇六磷酸含量這樣極其少的大豆蛋白水解物與只經過酶解的大豆蛋白水解物相比，風味優異。
本發明是基於這些發現完成的。
也就是說，本發明的幼魚苗用飼料，其特徵在於在飼料原料中含有肌醇六磷酸含量為0.05重量％或以下(以乾燥固形物計)的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物。
平均分子量是200～10000的植物蛋白水解物是比較合適的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物。
另外，本發明還涉及低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的製造方法，其特徵在於包括(a)用蛋白分解酶分解蛋白質的工序和(b)用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸的工序。
用蛋白分解酶分解蛋白後，優選用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸。
優選用分解肌醇六磷酸的酶分解未乾燥的蛋白後，用蛋白分解酶分解蛋白質。
分解肌醇六磷酸的酶優選肌醇六磷酸酶。
肌醇六磷酸酶處理的pH優選為6～9。
低肌醇六磷酸鈣鎂蛋白水解物的平均分子量優選為200～10000。
低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物中的肌醇六磷酸含量優選以乾燥固形物計，用釩鉬酸吸光光度法(檢測界限5mg/100g)不能檢測出肌醇六磷酸。
實施發明的最佳方式首先就幼魚苗用飼料進行說明。
本發明的用於幼魚苗用飼料的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物以乾燥固形物計的肌醇六磷酸含量為0.05重量％或以下，優選0.01重量％或以下，更優選0.004重量％或以下(檢測界限以下)比較合適。
植物蛋白水解物中所含的肌醇六磷酸的量越少，幼魚苗的存活率越高，是優選的。另外，具有促進魚苗的成長、賦予糞便粘性、防止水由於糞便變渾濁的效果。
本發明的用於幼魚苗用飼料中的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的平均分子量為200～10000(優選300～5000)比較合適。分子量大的低肌醇六磷酸鈣鎂蛋白水解物提高促進幼魚苗的生長發育的效果和存活率的效果差，若分子量減少直至成為胺基酸的話，飼料的滲透壓升高，變得易於溶解，作為飼料不合適。
只要是養魚用飼料，分子量比較大的大豆蛋白水解物也可以，但養的魚是幼魚苗的話，平均分子量小的比較好，尤其是剛從卵孵化的小魚，優選分子量小的寡肽混合物。
本發明的飼料，作為其組成，含有蛋白成分40～70重量％，優選約50～60重量％比較合適。
本發明的飼料含有低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物1重量％～30重量％，優選3～25重量％比較合適。通常，用上述低肌醇六磷酸植物蛋白水解物取代本發明飼料中的蛋白成分的3重量％以上，優選10～80重量％比較合適。取代比例增加的話，該飼料的顆粒化變得困難。
本發明飼料中低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物少的話，沒有提高幼魚苗的存活率和魚苗的成長率的效果，過多的話，會引起生長障礙，因此是不優選的。這是加吉魚、比目魚等養殖種苗生產困難的魚共同具有的，與其它魚的養殖不同。
另外，作為低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物以外的蛋白質成分，可以合併使用南極磷蝦、魚類加工產品、雞蛋加工品、牛奶製品、明膠、魚粉、魚介類提取物、酵母提取物、魚卵提取物。
本發明的飼料除含有上述低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物、其它蛋白質之外，還可以含有碳水化合物、脂肪、維生素、礦物質、n-3高度不飽和脂肪酸和大豆卵磷脂等磷脂。
n-3高度不飽和脂肪酸是比目魚等海水魚所必須的脂肪酸，大豆卵磷脂等飼料性磷脂是幼魚苗的養殖所必需的成分，因此可以含在本發明的飼料中。
本發明的飼料的形式優選保持魚易於攝取的粒徑、浮遊性、沉降速度且在水中營養素不溶出，在消化道中被消化吸收這樣的形式，特別用於比目魚和蝦等小魚時，優選通過微膠囊化等，製成微粒飼料。
將平均分子量200～10000的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物微膠囊化的方法可以採用例如將水解物的水溶液噴霧乾燥的方法。另外，也可以根據需要，為了調節對海水的溶出性、浮遊性、分散性，在噴霧前也可以添加油脂，噴霧後，添加硬化油脂後，攪拌並塗覆等來製備。
本發明的飼料可以根據幼魚苗的日齡，在幼魚苗期，與生物飼料結合或者單獨，以30分～1小時間隔，適量給料。
以下描述用於如上幼魚苗的飼料的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的一個製造方法。
(植物蛋白原料)本發明所用的植物蛋白可以使用公知的植物蛋白，穀物、油脂原料的蛋白獲得容易，特別是大豆蛋白工業上可以大量生產，因此是優選的蛋白原料之一。
下面說明使用含有若干肌醇六磷酸的大豆蛋白的例子，但該方法也是可以應用在其它植物蛋白中的方法。
用於製造本發明的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的大豆蛋白原料可以包括豆乳(也包括脫脂豆乳。以下同)、濃縮豆乳、濃縮大豆蛋白、大豆分離蛋白、脫脂大豆等、只要包含大豆蛋白即可。
脫脂大豆優選沒有蛋白變性或者輕度蛋白變性的經加工處理的所謂低變性脫脂大豆，不受品種、產地等限定。一般來說，把正己烷作為提取溶劑進行低溫提取處理的脫脂大豆作為原料比較合適，特別是NSI(氮可溶係數)為60以上，優選80以上的低變性脫脂大豆比較好。
(大豆蛋白的酶解)大豆蛋白的酶解方法可以在含水溶液(大豆蛋白漿料或者溶液)中使用酶水解大豆蛋白。
例如，在使用低變性大豆蛋白的場合，用於酶處理的大豆蛋白溶液的濃度為1重量％～30重量％，優選5～15重量％，較優選8～12重量％比較合適。該濃度低對酶解也無礙，但產率降低，是不優選的。
用於本發明的蛋白分解酶(蛋白酶)可以單獨或者合併使用來源於動物、植物或者微生物的胞外蛋白酶或者胞內蛋白酶。具體地可以使用絲氨酸蛋白酶(動物由來的胰蛋白酶、糜蛋白酶、微生物由來的枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶等)、硫醇蛋白酶(植物由來的木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、波蘿蛋白酶等)、羧基蛋白酶(動物由來的胃蛋白酶等)。進一步具體地為米曲酶起源的「プロチンFN」(大和化成株制)、灰色鏈酶菌起源的「アクチナ-ゼ」(科研製藥株制)、來自地衣芽孢桿菌的「アルカラ-ゼ」(ノボ社制)、來自枯草桿菌的「プロチンA」(大和化成株制)。另外，作為含有胞內蛋白酶的酶，可以舉出天野製藥(株)制的「プロテア一ゼS」、大和化成(株)制的「プロチンAC-10」和「ビオプラ-ゼ(ナガゼ生化學工業株式會社)等，作為含有胞外和胞內蛋白酶的蛋白分解酶，可以舉出天野製藥(株)制的「プロテア一ゼM」。
本發明的水解條件因使用的蛋白分解酶的種類多少不同，一般說來，優選在該蛋白分解酶的作用pH範圍、作用溫度、最佳反應時間下，使用足量的酶以水解大豆蛋白。在同時考慮脂質代謝改善劑和限制鹽分的食物(例如經飼管營養食物等)的用途的場合，如果pH為5～10，優選pH6～9，可以減少中和生成的鹽，因而是優選的。
對於水解的程度，平均分子量為200～10000，優選300～5000比較合適。可以根據目的和用途來調節水解的程度。例如，在食料和飼料的場合，比較大的分子量也無妨，在用作養魚用飼料的場合和用作幼魚苗用飼料的場合，優選易於消化的低分子量，適合的平均分子量為200～5000，較優選為200～2000。
(用肌醇六磷酸分解酶分解肌醇六磷酸)作為用於本發明的分解肌醇六磷酸的酶，可以使用來自小麥和馬鈴薯等植物的酶，或者來自腸管等動物內臟的酶、來自細菌、酵母、真菌、放線菌等微生物的且具有肌醇六磷酸分解活性的肌醇六磷酸酶和磷酸酶等酶。
作為分解肌醇六磷酸的酶，肌醇六磷酸酶和磷酸酶比較合適，較優選肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶可以使用麴黴屬、根黴屬、酵母屬、毛黴屬、地絲菌屬等各種具有產肌醇六磷酸酶能力的菌株。優選來自麴黴屬的酶比較合適，較優選的麴黴屬(Aspergillus)可選自來自無花果麴黴(Aspergillus ficuum)的肌醇六磷酸酶、來自黑麴黴(Aspergillus niger)的肌醇六磷酸酶和土曲酶(Aspergillus terreus)的肌醇六磷酸酶。為了把大豆中的肌醇六磷酸分解為肌醇，需要切斷酯基，進行切斷的酶是肌醇六磷酸酶。
另外，也可以使用作為酸性磷酸酶的真菌類由來的酸性磷酸酶。也就是說，可以選自無花果麴黴(Aspergillus ficuum)由來的酸性磷酸酶、黑麴黴(Aspergillus niger)由來的酸性磷酸酶和土曲酶(Aspergillus terreus)由來的酸性磷酸酶。
酶處理的肌醇六磷酸的分解反應可以在非常溫和的條件下實施，因此對蛋白質的影響極其小。例如，本發明的酶反應在30～60℃下進行0.1～30小時即可。
在本發明中，肌醇六磷酸分解反應時的pH特別重要，在pH6～9，優選6.2～8.5，進一步6.2～7實施比較好。在低於pH6.0下處理的大豆蛋白其溶解性降低，風味變差，是不優選的。另外，pH超過9.0，風味也變差，也不是優選的。在上述pH範圍內分解肌醇六磷酸，可以更好地製造減少了肌醇六磷酸的大豆蛋白。
因而，在本發明中適合使用的酶優選在pH6以上的中性乃至鹼性pH範圍可以分解肌醇六磷酸和肌醇六磷酸鹽的酶，對其來源沒有特別的限定，可以使用上述酶。
可以在無論粉末狀、液體狀的形式下使用酶，相對於大豆蛋白中的粗蛋白重量，以0.01～10重量％，優選0.05～2重量％，更優選0.1～1重量％進行添另而實施，但作為酶效價，添加0.1～100U/g粗大豆蛋白、優選0.5～20U/g粗大豆蛋白，較優選1～10U/g粗大豆蛋白的肌醇六磷酸酶比較好。另外，對於酶活性，在37℃，使由0.5ml含4mM肌醇六磷酸鈉的0.2Mtris-HCl緩衝液(pH6.5)、0.4ml蒸餾水和0.1ml酶液組成的反應液反應30分鐘，加入1.0ml 10％TCA並停止反應。用Fiske-Subbarow方法對該反應液中的無機磷酸含量進行定量。在上述條件下，把在1分鐘內使1μmol的無機磷酸游離的酶量作為1個單位(U)。
在本發明中，只要包括用蛋白分解酶分解蛋白質的工序和用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸的工序，其順序無論什麼樣的組合均可，經過這些工序，可以使低肌醇六磷酸鈣鎂化，即植物蛋白水解物中的肌醇六磷酸含量以乾燥固形物計為0.5％或以下，優選0.2％或以下。而且，為了使肌醇六磷酸含量在檢測界限5mg/100g以下，在酶分解蛋白質後，進行肌醇六磷酸酶處理，對於製造低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物是較優選的。另一方面，對蛋白質進行肌醇六磷酸酶處理後，即使酶解蛋白質，也難於使肌醇六磷酸含量在檢測界限5mg/100g以下。但是，如果在使用前述未變性大豆蛋白的場合，使前述肌醇六磷酸酶作用於該大豆蛋白溶液(沒有粉末乾燥)分解肌醇六磷酸後，進行前述的蛋白酶分解，可以得到肌醇六磷酸含量在檢測界限以下的所需低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物。
如上得到的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的平均分子量為200～10000，優選300～5000比較合適。
另外，肌醇六磷酸含量以低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的乾燥固形物計，用釩鉬酸吸光光度法(檢測界限5mg/100g)，檢測為0.5％或以下，優選沒有檢測出肌醇六磷酸。
(實施例)下面通過實施例說明本發明的實施方式。
首先，對飼料進行說明。
〔製造例1〕(低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物的製造)往10重量份脫脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，攪拌提取30分鐘後，用離心分離機分離豆腐渣和豆乳，用硫酸將豆乳調節至pH4.5後，通過離心分離等，分離成等電點沉澱蛋白質和乳清蛋白質後，相對於等電點沉澱蛋白質，加4倍水後，用NaOH調節至pH6.0，製備8％濃度的大豆蛋白溶液50重量份。
將該大豆蛋白溶液加熱至50℃，添加新日本化學工業(株)制的0.04重量份肌醇六磷酸酶分解酶「スミチ-ムPHY」，使之反應60分鐘。在150℃將該反應液殺菌7秒後，冷卻至50℃，用NaOH調節至pH7.0，添加天野製藥(株)制的0.16重量份「プロテア一ゼM」，使之反應5小時。調節至pH6.5，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，沒有檢測出(檢測界限5mg/100g)。平均分子量用電泳法測定的結果約500。
〔製造例2〕(沒有除去肌醇六磷酸的大豆蛋白水解物的製造)把100重量份(以下為「份」)大豆分離蛋白(不二制油(株)制的「フジプロ-R」)製成pH7的5％水溶液，用プロチンFN(大和化成(株)制麴黴屬起源)1份，在50℃酶解5小時後，在70℃加熱30分鐘使酶失活，將冷卻後離心分離得到的上清液噴霧乾燥，來製造大豆蛋白水解物。另外，該水解物的TCA(三氯醋酸)可溶率(15％TCA可溶氮/全氮的值乘以100的值)為100，且平均分子量為676。
〔實施例1和對比例1〕·實施例1從預備飼養水槽將38日齡的比目魚移至300尾宛100L實驗水槽中，準備5個這樣的槽，作為實驗水槽。在實驗期間，海水的溫度保持在17℃。
作為實驗飼料，在表1的比目魚養殖飼料中，如表1所示，添加0、2.5、5.0、10.0、20.0重量份酪蛋白代替和上述製造例1一樣製造的低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物，用常規方法製成微粒飼料。實驗飼料組成示於表1中。單位為重量份。第5組為對照組。
從39齡開始實驗，從上午9時開始，每1小時給料，給料8次，直至16時，在17時，給予アルテミア作為生物飼料，每天給料9次。飼料量隨著日齡的增長，把養殖飼料定為0.31g～0.50g/次/魚，把アルテミア定為55～80隻/次/魚。
實驗開始後14天，測定約50尾52齡的幼魚苗的體長、存活尾數、色素異常率。
·對比例1作為實驗飼料，使用和上述製造例2一樣製造的沒有除去肌醇六磷酸的大豆蛋白水解物，用和實施例1一樣的方法，養殖比目魚。
(表1)
實施例1和對比例1的結果如表2所示。
(表2)52日齡測定結果
從實施例1的結果可知，添加了低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物的1～4組與作為對照的5組相比較，生長均得到促進，特別是在1～3組沒有發現顯著差別。即使對於存活數，與5組相比，在1～4組可以看到良好的傾向。另外，色素異常率各組沒有差別，在給予大豆蛋白水解物的組，也沒有發現異常。
另外，與下述比較例1相比較，肌醇六磷酸含量低的大豆蛋白水解物(寡肽混合物)的存活率也顯著上升。
〔製造例3〕將100重量份大豆分離蛋白(不二制油(株)制「ニュ-フジプロ-R」)溶解在水900份中，往其中加入2份蛋白質分解酶(大和化成株式會社制「プロチン」)，在50℃培養5小時後，用離心分離(5000rpm×30分鐘)除去不溶物，進一步在80℃加熱30分鐘，使酶失活和殺菌，進行冷凍乾燥，得到酶分解物(SH)。
往直徑1.4cm的柱中填充丙烯酸類弱鹼性陰離子交換樹脂(住友化學工業(株)制「KA890」)直至高度15cm(樹脂容積23cm3)，通入50ml 5％苛性鈉液和500ml離子交換水，進行洗滌。
另一方面，用離子交換水溶解上述酶解物，用10％鹽酸調節pH至4.5，用離子交換水調節以使最終蛋白濃度達到10％。
以51ml/hr從填充KA890並洗滌的柱的上部通入上述調製液，從柱的下部分離獲得洗脫的處理液。
通入酶解液，收集其量最終為1219ml(作為蛋白量為121.9g，每1ml樹脂為5.3g)的酶解液，即肌醇六磷酸完全被樹脂吸附除去的洗脫液，冷凍乾燥，得到低磷含量的酶解物(SHR)。用穆罕默德等人的方法(Cereal Chem.63.475.1986)測定肌醇六磷酸含量。其結果沒有檢測出肌醇六磷酸(檢測界限0.005重量％)。
〔實施例2和對比例2〕用在製造例3中得到的低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物和在製造例2中得到的沒有除去肌醇六磷酸的大豆蛋白水解物，孵化來自母蝦的受精卵，用預備飼養至水蚤幼蟲l期的飼料，進行飼養實驗。
飼養條件如表3所示，在1升燒杯中收入100尾水蚤幼蟲1期，用微粒飼料在室溫下飼養。試驗飼料的組成如表4所示。
作為試驗飼料，往表4的對蝦養殖飼料中分別添加10.0重量份酪蛋白(對照)來代替和製造例3和製造例2一樣製造的各大豆蛋白水解物，用常規方法製成微粒飼料。
另外，以幼苗的生長指數(Growth index達到成長期)和存活率判斷添加效果。結果如表5所示。
(表3)對蝦幼苗的飼養條件
(表4)試驗飼料組成
※1(20∶5ω3)∶(22∶6ω3)＝3∶2(表5)對蝦幼苗的飼養實驗的結果
·生長指數(Growth index)＝(1n1+2n2+3n3+4n4+5n5+6n6+7n7)/N(條件是，N＝n1+n2+…+n7)
·n1、n2、n3、n4、n5、n6和n7表示水蚤幼蟲1期、水蚤幼蟲2期、水蚤幼蟲3期、糠蝦幼體1期、糠蝦幼體2期、糠蝦幼體3期和後期幼體1幼苗的尾數該結果發現，後期幼體的體長(第11天測定的)在製造例3的低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物添加區與無添加區或者製造例2的大豆蛋白水解物添加區之間沒有差別，但發現低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物添加區在存活率、生長指數方面有良好的傾向。
〔實施例3〕將生後第70～80天的比目魚移到20L實驗水槽中，每個區20尾，準備3個這樣的水槽，進行飼養實驗。實驗期間，飼養水溫保持在18℃。
作為實驗飼料，將市售的比目魚飼料((株)ヒガシマル制的EP飼料、種苗用S-6)調製成基料。也就是將市售的飼料加熱，進行塗覆使在上述製造例1中製造的低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物和在製造例2中製造的未經肌醇六磷酸酶處理的大豆蛋白水解物與其粘附後，乾燥製成實驗飼料。市售飼料的組成和添加了大豆蛋白水解物的實驗飼料的組成示於表6中。
(表6)
用全長平均80.3mm、魚體重4.4g、體重/全長＝55.5mg/mm的魚苗開始實驗，給料從上午9時開始，每6個小時給料，每天給4次。實驗開始後經過10天、20天後，測定幼魚苗60尾的體長、魚體重，從測定結果算出體重/全長。
(表7)測定開始第0天(試驗魚數60尾)
備註內相對於對照區的增減
(表8)測定開始第10天(試驗魚數60尾，存活率60尾)
備註內相對於對照區的增減(表9)測定開始第20天(試驗魚數60尾，存活率60尾)
備註內相對於對照區的增減從該結果發現，與對照組區、添加大豆蛋白水解物相比較，在低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物添加區，在第10天，以平均體重/體長(mg/mm)計的生長率高，具有促進生長的效果。進一步在第20天，對於體重/體長(mg/mm)，也觀察倒最大的固體。最小的與對照區、添加大豆蛋白水解物相比，值也比較高，這大概是由於飼料集中在固體大的魚中，固體間的差異大，平均值與對照區沒有太大區別。
(飼養過程)飼養期間的水溫、給料量、攝取狀況記載如下。
糞便的狀況，對照區給料後的糞便的狀況為拉稀便，水槽的水渾濁，與此相反，在大豆蛋白水解物和低肌醇六磷酸大鈣鎂豆蛋白水解物添加區，糞便為保持形狀的軟便狀，且水槽的水保持乾淨。而且，低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物的飼料，存在糞便粘稠，糞便多的傾向。
(表10)
下面說明低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物的實施例。
〔實施例4〕往10kg脫脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，攪拌提取30分鐘後，用離心分離機分離豆腐渣和豆乳，用硫酸將豆乳調節至pH4.5後，通過離心分離等，分離成等電點沉澱蛋白質和乳清蛋白質後，相對於等電點沉澱蛋白質，加4倍水後，用NaOH調節至pH7.0，製備50升8％濃度的大豆蛋白溶液。
往該大豆蛋白溶液中分別添加「プロテア一ゼS」和「プロテア一ゼM」(天野製藥(株)制)各160g，在50℃使之反應5小時，加水分解(15％TCA可溶率85％)。然後，將pH調節至6.0，添加新日本化學工業(株)制的40g肌醇六磷酸分解酶「スミチ-ムPHY」，在50℃使之反應60分鐘後，用NaOH調節至6.5，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，沒有檢測出(檢測界限5mg/100g)，可以極好地低降低肌醇六磷酸。
〔實施例5〕往10kg脫脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，攪拌提取30分鐘後，用離心分離機分離豆腐渣和豆乳，用硫酸將豆乳調節至pH4.5後，通過離心分離等，分離成等電點沉澱蛋白質和乳清蛋白質後，相對於等電點沉澱蛋白質，加4倍水後，用NaOH調節至pH6.0，製備50升8％濃度的大豆蛋白溶液。
將該大豆蛋白溶液加熱至50℃，添加40g新日本化學工業(株)制的肌醇六磷酸酶分解酶「スミチ-ムPHY」，使之反應60分鐘後，用NaOH調節至7.0，添加160g天野製藥(株)制的「プロテア一ゼM」，使之反應5小時。調節至pH6.5，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，沒有檢測出(檢測界限5mg/100g)，可以極好地低降低肌醇六磷酸。
〔實施例6〕往10kg脫脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，攪拌提取30分鐘後，用離心分離機分離豆腐渣和豆乳，用硫酸將豆乳調節至pH4.5後，通過離心分離等，分離成等電點沉澱蛋白質和乳清蛋白質後，相對於等電點沉澱蛋白質，加4倍水後，用NaOH調節至pH6.0，製備50升8％濃度的大豆蛋白溶液，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
將該蛋白液調節為8％溶液，加熱至50℃，添加40g新日本化學工業(株)制的肌醇六磷酸酶分解酶「スミチ-ムPHY」，使之反應60分鐘後，用NaOH調節至7.0，添加160g天野製藥(株)制的「プロテア一ゼM」，使之反應5小時。調節至pH6.5，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，肌醇六磷酸被降低至0.5％(檢測界限5mg/100g)。
〔實施例7〕往10kg脫脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，攪拌提取30分鐘後，用離心分離機分離豆腐渣和豆乳，用硫酸將豆乳調節至pH4.5後，通過離心分離等，分離成等電點沉澱蛋白質和乳清蛋白質後，相對於等電點沉澱蛋白質，加4倍水後，用NaOH調節至pH6.0，製備50升8％濃度的大豆蛋白溶液。
將該大豆蛋白溶液加熱至50℃，添加40g新日本化學工業(株)制的肌醇六磷酸酶分解酶「スミチ-ムPHY」，使之反應60分鐘後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
將該溶液調節為8％溶液，用NaOH調節至7.0，添加160g天野製藥(株)制的「プロテア一ゼM」，使之反應5小時，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，肌醇六磷酸被降低至0.2％(檢測界限5mg/100g)。
〔實施例8〕往10kg脫脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，攪拌提取30分鐘後，用離心分離機分離豆腐渣和豆乳，用硫酸將豆乳調節至pH4.5後，通過離心分離等，分離成等電點沉澱蛋白質和乳清蛋白質後，相對於等電點沉澱蛋白質，加4倍水後，用NaOH調節至pH6.0，製備50升8％濃度的大豆蛋白溶液。
將該蛋白液加熱至50℃，添加40g新日本化學工業(株)制的肌醇六磷酸酶分解酶「スミチ-ムPHY」，使之反應60分鐘後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
將該溶液調節為8％溶液，用NaOH調節至7.0，添加160g天野製藥(株)制的「プロテア一ゼM」，使之反應5小時(反應時pH6.2)，之後，再添加40g新日本化學工業(株)制的肌醇六磷酸分解酶「スミチ-ムPHY」，使之反應60分鐘後，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，肌醇六磷酸被降低至0.2％(檢測界限5mg/100g)。
〔實施例9〕把30kg粉末乾燥的大豆分離蛋白(不二制油(株)制，「ニュ-フジプロ-R」)製成pH7.0的10％溶液，使之受1.2kg天野製藥(株)制的蛋白分解酶「プロテア一ゼS」和0.3kg天野製藥(株)制的「プロテア一ゼM」的作用，在50℃水解5小時(15％TCA可溶率85％)後，將pH調節至6.0，添加0.6kg新日本化學工業(株)制的肌醇六磷酸酶分解酶「スミチ-ムPHY」，在45℃水解2小時。
在可連續處理的高速離心分離機中，將該分解液調整至100升/小時的送液速度，分離除去產生的沉澱成分。將所得離心上清液(固形物的收率為70％)調節至pH6.5，在150℃殺菌7秒後，立即用噴霧乾燥機粉末乾燥。
用釩鉬酸吸光光度法測定該粉末中的肌醇六磷酸(內消旋肌醇環己酸)含量，沒有檢測出(檢測界限5mg/100g)，可以極好地低降低肌醇六磷酸。
工業實用性通過將本發明的飼料給料，能夠促進幼魚苗的生長發育，大幅度提高存活率。
特別是能夠提高一般認為養魚困難所在的幼魚苗的存活率，能夠養殖以往一般認為養魚困難的魚。
另外，能夠促進在某種程度上成長的魚苗的生長發育，可以使糞便粘稠，防止水渾濁，生長環境得以改善。
還有，低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物適合於這種飼養量是可能的。
也就是說，根據本發明，肌醇六磷酸含量極少，而且用釩鉬酸吸光光度法檢測為檢測界限以下的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物是可能的。另外，與樹脂吸附法的低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物相比較，本發明方法的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的風味優異(據推測是因為肌醇六磷酸的分解物)。
另外，本發明的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的分子量小，肌醇六磷酸極少，因此用於消化吸收功能不夠發達的魚苗和生後成活的動物用飼料中時，消化吸收性優異，對促進鈣等微量金屬的吸收極其有效。
權利要求
1.一種低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的製造方法，其特徵在於，該方法包括(a)用蛋白分解酶分解蛋白質的工序和(b)用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸的工序。
2.權利要求1所述的製造方法，其中，用蛋白分解酶分解大豆蛋白後，用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸。
3.權利要求1所述的製造方法，其中，用分解肌醇六磷酸的酶分解未乾燥的大豆蛋白後，用蛋白分解酶分解蛋白質。
4.權利要求1～3中任意一項所述的製造方法，其中，所述的分解肌醇六磷酸的酶是肌醇六磷酸酶。
5.權利要求1～4中任意一項所述的製造方法，其中，所述的肌醇六磷酸酶處理的pH為6～9。
6.權利要求1～5中任意一項所述的製造方法，其中，所述的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的平均分子量為200～10000。
7.權利要求1～6中任意一項所述的製造方法，其中，所述的低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物中的肌醇六磷酸含量以乾燥固形物計顯示為，用釩鉬酸吸光光度法、以檢測界限5mg/100g檢測不出肌醇六磷酸。
全文摘要
本發明的目的在於提供適合於提高消化吸收功能不夠發達的幼魚苗的存活率和促進生長發育的飼料，以及獲得用於該飼料中的植物蛋白水解物。為了得到該低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物，提供了低肌醇六磷酸鈣鎂植物蛋白水解物的製造方法，該方法包括(a)用蛋白分解酶分解蛋白質的工序和(b)用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸的工序。例如，植物蛋白為大豆蛋白的場合，低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物的平均分子量優選為200～10000。另外，肌醇六磷酸含量優選為0.05重量％或以下(以乾燥固形物計)。用含有這種低肌醇六磷酸鈣鎂大豆蛋白水解物的小魚用飼料，可以使促進幼魚苗的生長發育、提高存活率的幼魚苗用飼料成為可能。
文檔編號A23K1/16GK101066097SQ200710108198
公開日2007年11月7日 申請日期2003年7月23日 優先權日2002年7月24日
發明者中森俊宏, 古田均 申請人:不二制油株式會社