一個麻瘋樹鹽誘導轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法

2023-08-06 21:55:21

專利名稱：一個麻瘋樹鹽誘導轉錄因子及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物中一種與脅迫相關的轉錄因子及其編碼基因與應用，特別是涉及及一個來源於EREBP/AP2家族的麻瘋樹鹽誘導轉錄因子及其編碼基因與其在培育抗逆性提高的植物中的應用。
背景技術：
自然界的植物經常會遭受乾旱、鹽鹼和低溫等惡劣環境的脅迫危害，使其生長發育受到抑制，甚至導致植株死亡。土壤鹽漬化是影響植物生長量的一個主要的環境脅迫因子。據統計，鹽鹼地佔地球陸地面積的7.5％，目前世界上大約有三分之一的可灌溉土壤由於含鹽量較高而不再適合作物生長。我國約有15億多畝鹽漬化土地，主要分布在山東、河北、東北、新疆、甘肅等沿海及乾旱和半乾旱地區。隨著我國人口的劇增及工業的高速發展，可耕地急劇下降，而不合理灌溉、耕作等又造成了大量良田的次生鹽漬化。導致我國耕地逐年急劇下降，嚴重威脅著我國的糧食和林木生產。因此，如何利用和開發我國上億畝鹽漬化土壤，培育能夠在鹽漬化土壤上生長良好的耐鹽新品種，儘量避免或減輕不良環境因素的危害，是當前生物和現代農業技術領域的研究熱點，也是當今我國以及世界農業急需解決的重大課題。
植物對脅迫的抵抗或忍耐能力稱為抗逆性，是植物在長期演化過程中形成的對不良環境的適應性。多年來，人們從各個角度對植物與高鹽脅迫之間的關係進行了研究。從最初的生理現象的研究到生態、遺傳的研究，再到生理生化、代謝的研究，已積累了豐富的資料。特別是隨著分子生物學的發展，使人們能夠在基因組成、表達調控及信號傳導等分子水平上認識植物對脅迫的耐性機理，並且為利用基因工程手段改良植物抗鹽脅迫性能開拓了新的途徑。由於植物抗逆性狀的複雜性，採用傳統的育種方法提高植物的抗逆性十分困難，隨著分子生物學的發展，通過基因過程手段改良植物的抗逆性開闢了植物抗逆育種的新途徑，但高效抗逆基因的分離成為限制植物抗逆基因工程的主要因子。過去，克隆和應用的主要是單一的功能基因，如甜菜鹼合成酶基因和脯氨酸合成酶基因等，雖然取得了一定的效果，但植物的抗逆性沒有得到全面的提高。
植物抗逆性受多基因控制，要使眾多對植物抗逆性狀產生影響的功能基因充分表達和發揮作用，才能有效地改良植物抗逆性。隨著生物技術的不斷發展，研究重點已從一般的功能基因轉向各種專一性或高效性的調控因子(如啟動子和轉錄因子)。由於一個轉錄因子可以調控植物中多個與抗逆性相關基因的表達，增強一個轉錄因子的作用，就可使植株抗逆性狀獲得綜合改良。

發明內容
本發明的目的是提供一個受高鹽及乾旱誘導表達的麻瘋樹EREBP/AP2家族的轉錄因子。
本發明所提供的鹽誘導轉錄因子，名稱為JcERF，來源於麻瘋樹(Jatrophacurcas)，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉錄激活功能的調控植物抗逆性的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №1由253個胺基酸殘基組成，自氨基端(N端)第25位-第80位胺基酸殘基為保守的EREBP/AP2結構域，自氨基端第81位-第253位胺基酸殘基為酸性活化區域。
編碼麻瘋樹鹽誘導轉錄因子JcERF的基因(JcERF)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為在6×SSC或(6×SSPE)，0.1％SDS，2×Denhardt溶液中，65℃條件下雜交；在0.1×SSC，0.1％SDS溶液中，65℃條件下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由759個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1位-第759位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №1胺基酸殘基序列的蛋白質，自5』端第76位-第243位鹼基編碼保守的EREBP/AP2結構域，自5』端第244位-第759位鹼基編碼酸性活化區域。
含有本發明基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
擴增JcERF中任一片段的引物對也在本發明的保護範圍之內。
本發明的另一個目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。
本發明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼所述麻瘋樹鹽誘導轉錄因子JcERF的基因導入植物組織或細胞，得到抗逆性提高的植物。
所述麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF可通過含有所述麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF的植物表達載體導入外植體；用於構建所述植物表達載體的出發載體可為任意一種雙元農桿菌載體或可用於植物微彈轟擊的載體等，如p3301-BI121、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達載體。
使用JcERF構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛生素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
以p3301-BI121為出發載體，構建的含有所述麻瘋樹鹽誘導轉錄因子JcERF基因的植物表達載體為p3301-BI121-JcERF。
攜帶有本發明基因JcERF的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物細胞或組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、菸草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻瘋樹或擬南芥等植物。
本發明提供了一個來源於EREBP/AP2家族的麻瘋樹鹽誘導轉錄因子JcERF及其編碼基因。實驗證明，其編碼基因JcERF受高鹽及乾旱誘導表達，可調控植物抵抗乾旱、低溫及鹽鹼等逆境脅迫的能力，從而顯著提高植物的抗逆性。JcERF及其編碼基因對於培育抗逆性提高的麻瘋樹及其它作物新品種具有重要的理論及實際意義，可應用於農牧業和生態環境治理所需的抗性植物品種的培育與鑑定，具有較高的實際應用價值。本發明在農業領域具有廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。


圖1為經NaCl脅迫處理的麻瘋樹幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖2為3』RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3為5』RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖4為PCP擴增的JcERF全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖5為的JcERF全長cDNA的結構示意6為JcERF與植物中其它已克隆的ERF類蛋白胺基酸序列的同源性分析結果圖7為JcERF與植物中其它已克隆的ERF類蛋白胺基酸序列的系統進化樹分析結果圖8為JcERF的結構域及結構預測結果圖9為JcERF基因組DNA的結構分析結果圖10為Southern雜交分析麻瘋樹基因組中JcERF同源基因的結果圖11為JcERF基因的組織特異性表達分析結果圖12為JcERF在鹽脅迫下的表達模式分析結果圖13為JcERF在乾旱脅迫下的表達模式分析結果圖14為JcERF在低溫脅迫下的表達模式分析結果圖15為JcERF在ABA脅迫下的表達模式分析結果圖16為載體p3301-BI121-JcERF的構建示意17為載體p3301-BI121-JcERF的酶切鑑定結果圖18為載體p3301-BI121-JcERF的PCR鑑定結果圖19為水稻植株再生體系的建立過程具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物及探針均由上海生工合成。
實施例1、麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF cDNA全序列的獲得麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF全長cDNA序列的獲得包括以下步驟一、麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF 3』端序列的克隆1、植物材料處理及總RNA的提取先以麻瘋樹幼苗為材料，用300mM的NaCl溶液處理12小時後提取總RNA，對其進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖1所示，所提取的總RNA有2條明顯的電泳條帶，從上到下分別為28s RNA和18s RNA，表明獲得了純度較高、較完整的總RNA。
2、麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF 3』端序列的克隆比較現已公開的DREB的胺基酸殘基序列，尋找保守區域，並根據保守區域序列設計一對簡併引物，引物序列如下JS15』-AGG(A/T)T(A/T)TGGCT(C/T)GG(A/T/G)AC(A/T)TT-3』
JS25』-CG(G/T)(A/G)T(T/C)TGG(T/C)T(A/T)GG(G/T)AC(C/T)TT-3』以步驟1提取的經300mM NaCl溶液處理的麻瘋樹幼苗RNA為模板，用PlantRNAtrip Reagent Kit2試劑盒(購自北京普利來基因有限公司)並參照試劑盒說明書反轉錄合成其第一鏈cDNA，反應體系及條件為oligodT(10uM)1ul，DEPC處理水10ul，RNA 2ul，5×AMV緩衝液4ul，dNTP(10mM)2ul，AMV 1ul，42℃反應1小時。將合成的第一鏈cDNA貯存於-20℃備用。
再以獲得的第一鏈cDNA為模板，用上述兩條簡併引物分別與dT-Adaptor引物配對進行套式PCR擴增，PCR反應體系為引物1ul，dT primer 1ul，模板cDNA 2ul，10×Taq緩衝液2ul，dNTP(10mM)2ul，Taq(2.5U/ul)0.2ul，水11.8ul，反應條件為先94℃，5min；然後94℃30s，57℃30s，72℃50s，共30個循環；最後72℃10min。反應結束後，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示(泳道M為分子量標準Marker III，泳道1為3』RACE產物)，經PCR擴增獲得了長度約800bp的目的片段。回收並純化3』RACE產物，連接入pMD-18T載體中，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆提質粒，得到含有3』-JcERF的重組質粒，分別命名為pMD-3』-JcERF，對其測序並對測序結果進行BLAST分析，結果該片段長度為792bp，具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，與植物中已知的ERF類基因的3′端序列具有較高的同源性，表明該片段可能為麻瘋樹AP2類DNA結合蛋白基因的3′端序列。
二、麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF 5』端序列的克隆根據步驟一獲得的JcERF 3』端cDNA序列設計一對巢式引物JcERF-5-gsp1和JcERF-5-gsp2，序列如下JcERF-5-gsp15』-GATGAATCGGAATCACTGTGG-3』JcERF-5-gsp25』-GTCCGATCCAATCTGCACA-3』以步驟一提取的經300mM NaCl溶液處理的麻瘋樹幼苗RNA為模板，採用Invitrogen公司的5』RACE試劑盒並參照試劑盒說明書反轉錄合成其第一鏈cDNA，反應體系及條件為RNA 10ul，引物JcERF-5-gsp1 1ul，水4.5μl，10×PCR緩衝液2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP 1.0μl，DTT 2.5μl，42℃反應1小時。將合成的第一鏈cDNA貯存於-20℃備用。
再以獲得的第一鏈cDNA為模板，在上述3個巢式引物的引導下進行套式PCR擴增，PCR反應體系為引物JcERF-5-gsp2 1ul，水4.5μl，10×PCR緩衝液2.5μl，25mMMgCl22.5μl，10mM dNTP 1.0μl，DTT 2.5μl，第一鏈cDNA 1ul，反應條件為先94℃5min；然後94℃30s，57℃30s，72℃50s，共30個循環；最後72℃10min。反應結束後，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖3所示(泳道M為分子量標準Marker III，泳道1為5』RACE產物)，經PCR擴增獲得了長度約600bp的目的片段。回收並純化5』RACE產物，連接入pMD-18T載體中，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆提質粒，得到含有5』UTR的重組質粒，分別命名為pMD-5』JcERF，對其測序並對測序結果進行BLAST分析，結果該片段長度為294bp，具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列，序列分析結果顯示該片段與植物中已知的DREB2類基因的5′端具有較高的同源性，表明該片段可能為麻瘋樹DREB類DNA結合蛋白基因的5′端序列。
三、麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因JcERF全長cDNA序列的獲得及PCR檢測利用步驟一和步驟一獲得的長度為792bp和294bp片段之間的重疊區，藉助DNA軟體DNAMAM拼接得到JcERF的全長cDNA序列。該序列具有序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列。序列表中的SEQ ID №2由759個鹼基組成，其編碼序列為自5』端第1位-第759位鹼基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列的蛋白質，序列表中的SEQ ID №1由253個胺基酸殘基組成。根據全長cDNA序列讀碼框(open reading frame，ORF)的兩端序列設計全長引物，引物序列如下JcERFW-15』-AAACCCGACCTTCTTTCGCT-3』JcERFW-25』-GAAGTAGCCTGATTTTGA-3』以步驟一經300mM NaCl溶液處理的麻瘋樹幼苗RNA經反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，在引物JcERFW-1和JcERFW-2的引導下進行PCR擴增，反應結束後，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖4所示(泳道M為分子量標準MarkerIII，泳道1為PCR擴增產物)，結果PCR擴增出長度約為759bp的特異片段，對其進行測序，測序結果和上述拼接結果在擴增部分完全相同，其全長為759bp，表明所克隆的3′RACE片段和5′RACE片段屬於同一基因，將該基因命名為JcERF，將其編碼蛋白命名為JcERF。
實施例2、JcERF及其編碼蛋白的生物信息學分析一、JcERF基因的序列分析及其編碼蛋白的結構功能預測利用DNAMAN軟體對實施例1獲得的JcERF的全長cDNA序列進行生物信息學分析，其結構示意圖如圖5所示(單線表示3』-UTR；方框表示開放閱讀框，含有2個功能基序，黑色方框表示AP2結構域，右側陰影線表示酸性激活區域)，該序列全長759bp，自5』端第1位-第759位鹼基為ORF，編碼由253個胺基酸殘基組成的蛋白質，推測其分子量為27.474kDa，等電點pI值9.09。利用SMART工具對推斷的胺基酸殘基序列進行功能預測，結果該蛋白含有一個典型的EREBP/AP2結構域，即序列表中SEQ ID№1自氨基端(N端)第25位-第80位胺基酸殘基，該結構域由56個胺基酸殘基組成。另外，該蛋白的C-端存在一個典型的酸性活化區域(acidic activationregion；AAR)，序列表中SEQ ID №1自氨基端第81位-第253位胺基酸殘基，該區域可能有利於該基因轉錄。上述分析結果表明JcERF是一種轉錄因子，屬於AP2蛋白家族。
二、JcERF與植物中其它已克隆的DREB2類蛋白編碼胺基酸序列的同源性及系統進化樹分析利用DNAMAN軟體對JcERF與植物中其它已克隆的ERF類蛋白的胺基酸序列(GenBank登錄號為AAM19703小鹽芥；AAQ96342夏葡萄；NP_188139擬南芥；AAR84424菜椒；AA034705西紅柿；BAD99476菸草；AAD09248花豆；AAD00708花豆；AAV51938陸地棉；ABB51576捲心菜；AAV66332黃瓜；AAV98701水稻；AAY82590麻瘋樹)進行同源性分析和系統進化樹分析，同源性分析結果如圖6所示，JcERF與單子葉植物ERF類蛋白OsERF3的同源性為39％，其與雙子葉植物擬南芥、棉花、葡萄類蛋白的同源性分別為55％、51％、57％，表明JcERF與單子葉植物DREB類蛋白的同源性非常低，而與雙子葉植物中的蛋白同源性較高。系統進化樹分析結果如圖7所示，從單子葉植物中分離的DREB2類蛋白與從單子葉植物中的分離的該類蛋白的同源性非常低，約為39％，表明ERF類蛋白在進化過程中出現了較大的差異，但在每一類植物中該蛋白相對比較保守。
三、JcERF的結構域及結構預測用SMART伺服器(http//coot.embl-heidelberg.de/SMART/)分析JcERF的結構域，分析結果如圖8中圖A所示，在由254個胺基酸殘基組成的蛋白質序列中，自氨基端第25位-第80位胺基酸殘基為典型的EREBP/AP2結麻瘋域，表明它是EREBP/AP2家族中的一員。用CPHmodels-2.0伺服器(http//genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2_0 Server-3D.htm)預測JcERF的蛋白質結構，結果如圖8中的圖B所示，結果JcERF含有一個典型的α螺旋和三個β摺疊結構。
實施例3、JcERF基因組DNA的結構分析提取實施例1中經300mM NaCl溶液處理的麻瘋樹幼苗的基因組DNA並以此為模板，在引物JcERFW-1和和JcERFW-2的引導下，進行PCR擴增分析JcERF基因的結構，反應結束後，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖9所示(泳道M為分子量標準Marker III，泳道1為PCR擴增產物)，結果PCR擴增出長度約800bp的特異條帶。再以JcERF的cDNA為模板，用上述相同的引物進行PCR擴增，反應結束後，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖9所示(泳道M為分子量標準Marker III，泳道2為PCR擴增產物)，同樣擴增出長度約800bp的特異條帶。進一步對上述兩種特異片段進行克隆和測序，測序結果表明JcERF的基因組序列和對應的cDNA序列完全相同，表明在該基因內部不含有內含子。
實施例4、JcERF同源基因分析提取實施例1中經300mM NaCl溶液處理的麻瘋樹幼苗的基因組DNA，分別用XbaI、BamH I、Hind III和EcoR I四種限制性內切酶酶解，以Digoxigenin標記的JcERFcDNA為探針進行Southern雜交檢測，檢測結果如圖10所示，表明JcERF是一個單拷貝基因。
實施例5、JcERF基因的組織特異性表達分析分析JcERF的組織特異性表達模式，具體實驗方法為分別提取實施例1中經鹽處理的麻瘋樹幼苗的根、莖、葉三種組織的總RNA，利用全長引物JcERFW-1和JcERFW-2進行RT-PCR分析。以Actin基因作為內標，對所有cDNA模板進行半定量。反應結束後，對RT-PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖11所示(泳道M為分子量標準Marker III，R根，S莖，L葉)，表明JcERF在三種組織中的表達存在差異，以根中的表達量為最低，在莖和葉中的表達量較高。
實施例6、JcERF在不同非生物脅迫因子條件下的表達模式分析分析JcERF在轉錄水平與一些不同非生物脅迫因子的關係，具體實驗方法為將正常生長2周的麻瘋樹幼苗分別進行不同時間(0、0.5、3.0、6.0、12.0、24h)的低溫(4℃)、高鹽(250mM NaCl)、乾旱(20％PEG)及脫落酸ABA(100μM)脅迫處理。分批取材後，提取總RNA，先用Nortern Blot方法分析JcERF在各種脅迫條件下的表達模式，結果該基因在上述不同脅迫條件下表達豐度均較低，Nortern Blot雜交結果無信號或信號較弱，其它處理均無雜交信號。為分析JcERF在其它逆境條件下的表達模式，再用RT-PCR方法分析上述幾種脅迫條件下JcERF的表達模式，以Actin基因作為內標，對cDNA模板進行半定量，RT-PCR結果如圖12-圖15所示，表明JcERF在轉錄水平明顯受鹽誘導，300mM NaCl處理0.5h後就出現雜交信號，隨著處理時間的加長，表達量迅速增加，到6h達到最大值，之後表達水平逐漸降低，到24h又恢復到原初的表達水平(見圖12)。在PEG的誘導下，該基因一開始變化比較微弱，然後表達量迅速上升，2-6h達到最高峰，然後又迅速下降(見圖13)。在低溫和ABA處理下，JcERF的轉錄表達基本上沒有變化(見圖14和圖15)。上述實驗結果表明JcERF的轉錄表達受鹽和乾旱誘導，而低溫和ABA對其不起作用。
實施例7、JcERF轉基因水稻的獲得一、JcERF植物表達載體的構建將實施例1獲得的JcERF克隆入載體pMD18-T(TaKaRa公司)的EcoR V酶切位點之間，得到攜帶有JcERF的重組載體，命名為pMD18-JcERF。對pMD18-JcERF用限制性內切酶Xba I進行單酶切，補平，然後自連，從而去掉pMD18-JcERF上的Xba I酶切位點，再用Sal I和Sac I雙酶切該載體，獲得一條長度約為800bp的含有JcERF的小片斷。用Sal I和Sac I雙酶切質粒pGEX-KG(購自北京泛基諾基因組生物公司)，由於pGEX-KG上有限制性內切酶Sal I和Sac I識別位點，且只相距6bp，故切下的小片斷在瓊脂糖凝膠電泳中顯現不出來，所以只有一條和原來大小几乎相等的條帶，將其與從上述pMD18-JcERF切下的長度約為800bp的小片斷相連，獲得一重組質粒，命名為pGEX-KG-JcERF。用Xba I和Sac I雙酶切質粒pGEX-KG-JcERF和植物表達載體p3301-BI121(購自CAMBIA)，將從質粒pGEX-KG-JcERF上切下的800bp含有JcERF的小片段與從質粒p3301-BI121上切下的11.4kb的大片斷相連，即構建成含有JcERF完整讀碼框架的高效植物雙元表達載體，命名為p330i-BI121-JcERF，其構建過程如圖16所示。對構建好的植物表達載體p3301-BI121-JcERF用Xba I和Sac I進行雙酶切鑑定，對酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖17所示(泳道M為MarkerIII，泳道1為酶切產物)，經酶切獲得一條800bp的條帶，表明目的片段已正確連接入植物表達載體中。再以p3301-BI121-JcERF質粒為模板，利用JcERF特異性引物JcERFW-1和JcERFW-2進行PCR檢測，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖18所示(泳道M為MarkerIII，泳道1為PCR產物)，PCR擴增出一條800bp的條帶，進一步證明JcERF基因片段已正確連接到載體中，獲得了插入序列及位置正確的JcERF植物表達載體。
二、水稻植株再生體系的建立及篩選劑和篩選濃度的確定消毒後的水稻種子在N6D培養基(Chu，C.C，C.S.Wang，C.C.Sun，C.Hsu，K.C.Yin，C.Y.Chu.1975.Establishment of an efficient medium ofr anther cultureof rice through comparative experiments on the nitrogen sources.Sci.Sinica，18659-668)上黑暗培養2天後開始發芽(見圖19中的圖A和圖A1)，5天後開始有愈傷組織出現，2周後，將愈傷組織切下，挑選其中白色或淡黃色的緻密而沒有水化的小塊(見圖19中的圖B和圖B1)，將其分成直徑為3-5mm的小顆粒置於分化培養基(Hiei，Y.S.Ohta，T.Komari and T.Kumashiro.1994.Efficient transformationof rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA.Plan J.6271-282)上進行分化培養，15天繼代一次，30-40天後，個別狀態好的愈傷組織塊上出現綠色細胞團，並由此發育為完整植株(見圖19中的圖C和圖C1)。
將水稻水稻愈傷組織分別接種含100mg/L卡那黴素、(25mg/L、50mg/L)潮黴素、(5mg/L、10mg/L)ppt的分化培養基中進行抗生素敏感性實驗，結果三種篩選劑中，卡那黴素對水稻愈傷組織生長的抑制作用較弱，在卡那黴素濃度為100mg/L的培養基上，沒有明顯觀察到水稻愈傷組織的生長受到抑制，也沒有出現褐化現象。然而，水稻愈傷組織對潮黴素比較敏感，在含有潮黴素的培養基上培養，10天後觀察，其中的愈傷組織塊明顯比對照沒有加抗生素的要小，而且在潮黴素濃度為50mg/L的培養基上，一些愈傷組織開始褐化，2周後，在潮黴素濃度為25mg/L的培養基上也出現褐化的愈傷組織，而在潮黴素濃度為50mg/L的培養基上，褐化的愈傷組織達到40％。水稻愈傷組織對ppt也比較敏感，在ppt濃度為10mg/L的培養基上，10天後，愈傷組織開始褐化，20天後，褐化愈傷組織達到50％，在ppt濃度為5mg/L的培養基上，15天後，愈傷組織開始褐化，20天後，褐化愈傷組織達到30％。上述實驗結果表明水稻抗性愈傷組織的篩選採用含25-50mg/L的潮黴素或5-10mg/L的ppt比較合適。
三、JcERF轉基因水稻的獲得將步驟一構建的植物表達載體p3301-BI121-JcERF通過凍融法導入農桿菌EHA105中，篩選陽性重組子。水稻種子在N6D培養基上黑暗培養2周後，切下愈傷組織，挑選其中白色或淡黃色的緻密而沒有水化的小塊，用轉化有質粒p3301-BI121-JcERF的農桿菌EHA105陽性重組菌菌液侵染，將侵染後的愈傷組織接種於N6D培養基上25-28℃下暗培養，3天後，愈傷組織周圍出現菌落，洗淨愈傷組織，然後轉接到ppt濃度為5mg/L的分化培養基上篩選，15天後，少量愈傷組織開始褐化，然後再將愈傷組織轉接到ppt濃度為10mg/L的分化培養基上篩選，直到褐化愈傷組織死亡，取出未褐化的具有抗性的愈傷組織，置於無菌濾紙上，25-28℃乾燥培養2天，經乾燥後的愈傷組織脫水皺縮，再將其轉入分化培養基，2天後，皺縮的愈傷組織恢復，15天後，愈傷組織表面出現綠色芽點，待小芽長至5cm時轉入生根培養基MS0上生根。待幼苗長至8-10cm左右時，其根系已比較發達，打開三角瓶封口膜進行溫室移栽前的馴化練苗，3天後，將這些苗移栽到溫室，對轉基因植株進行檢測，結果共獲得陽性轉基因植株15株。
實施例8、JcERF轉基因水稻的抗鹽性實驗將野生型水稻種子(對照)和實施例7獲得的JcERF轉基因水稻種子分別播種於1/4MS和含10mg/L ppt的抗性平板上，使其萌發，在抗性平板上生長兩周後，將幼苗載入土中，在室溫中培養兩周後進行NaCl脅迫處理，用300mM的NaCl澆灌植株，兩天澆灌一次。兩周後觀察表型，並將上述供測植株從培養土中取出，取地上部分測鮮重、乾重，同時，取上述植物材料在70℃烘烤至恆重後稱乾重。
結果轉基因水稻幼苗在300mM的NaCl處理兩周都沒有出現黃葉現象，而對照出現了黃葉。兩周後轉基因水稻的鮮重和乾重均比對照重，呈顯著關係。上述實驗結果表明本發明的JcERF可以增強植物的耐鹽性，從而可作為植物耐鹽基因工程的侯選基因加以應用，用來改良植物的耐鹽性狀。
序列表16042101211253212PRT213麻瘋樹(Jatropha curcas)4001Met Lys Trp Leu Gln Glu Arg Ser Asn Ser Thr Gly Asn Asn Leu Asn1 5 10 15Gln Asn Ser Asn Thr Ala Glu Thr Arg Tyr Arg Gly Val Arg Lys Arg20 25 30Pro Trp Gly Arg Tyr Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Gly Lys Lys Thr35 40 45Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala50 55 60Tyr Asp Ala Ala Ala Arg Glu Phe Arg Gly Ser Lys Ala Lys Thr Asn65 70 75 80Phe Pro Thr Val Thr Glu Leu Asn Asn Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala85 90 95Ala Gly Ala Val Thr Val Ala Arg Ser Pro Ser Gln Ser Ser Thr Val100 105 110Glu Ser Ser Ser Pro Thr Pro Pro Arg Ala Ala Ser Pro Pro Pro Pro115 120 125Leu Asp Leu Thr Leu Asn Ile Pro Ser His Gln His His His Leu Arg130 135 140His Gly His Phe Pro Thr Gly Val Ile Phe Pro Gly Gly Ala Trp Ile145 150 155 160Ser Leu Ala Ala Glu Ala His Pro Val Phe Phe Phe Asp Ala Phe Ser165 170 175
Val Gln Gly Glu Ser Asn Asn Asn Asn Lys Asn Asn Ile Ile Asn Asn180 185 190Asn Lys Ile His Ser Lys Asn Ile Asn Leu Cys Arg Leu Asp Arg Thr195 200 205Val Met Val Ser Ser Gly Val His Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Val210 215 220Val Val Asp Tyr Asp His Asp Arg Ser Pro Cys Asn Lys Gly Leu Ser225 230 235 240Leu Asp Leu Asp Leu Asn Phe Pro Pro Ala Glu Val Ala245 2502102211759212DNA213麻瘋樹(Jatropha curcas)4002atgaaatggc tccaagagag atctaacagc actggcaata accttaacca gaactccaat60accgccgaga cccgctacag aggcgttagg aaacgacctt ggggccgata cgccgccgag120atccgagacc ctggcaagaa aactagggtc tggcttggta cttttgatac tgctgaagag180gcggcgcgtg cttacgacgc tgctgctcgt gaatttcgtg gctctaaggc taagacgaat240tttcctacag ttacggagct gaacaacgcg gctgcagccg ccgttgccgc gggagcagtc300accgtcgcac gaagtcctag ccaaagtagc accgttgagt cttcatcacc tacacctcca360cgcgctgctt ctcctccacc gcctcttgac cttactctca acattcctag tcatcaacat420catcatctcc gccacggcca tttccctacc ggtgttattt ttcctggtgg cgcgtggatt480tcactggcgg cggaggctca tccagttttc ttcttcgatg cgttctctgt tcaaggagag540agtaataaca acaacaaaaa taatattatc aacaataata aaattcactc taaaaatatt600aacttgtgca gattggatcg gacggtgatg gtgagcagtg gggtccacag tgattccgat660tcatcatctg ttgtggttga ttatgaccac gatcgtagtc cttgtaacaa gggattatca720cttgatcttg atcttaactt tcctccggct gaagtagcc 7592103
211792212DNA213麻瘋樹(Jatropha curcas)4003gcggcgcgtg cacacgacgt ggctgctcgt gaatttcgtg gctctaaggc taagacgaat60tttcctacag ttacggagct gaacaacgcg gctgcagccg ccgttgccgc gggagcagtc120accgtcgcac gaagtcctag ccaaagtagc accgttgagt cttcatcacc tacacctcca180cgcgctgctt ctcctccacc gcctcttgac cttactctca acattcctag tcatcaacat240catcatctcc gcctcggcca tttccctacc ggtgttattt ttcctggtgg cgcgtggatt300tcactggcgg cggaggctca tccagttttc ttcttcgatg cgttctctgt tcaaggagag360agtaataaca acaacaaaaa taatattatc aacaataata aaattcactc taaaaatatt420aacttgtgca gattggatcg gacggtgatg gtgagcagtg gggtccacag tgattccgat480tcatcatctg ttgtggttga ttatgaccac gatcgtagtc cttgtaacaa gggattatca540cttgatcttg atcttaactt tcctccggct gaagtagcct gattttgaag agatctgatt600tctatttttg ggaagtcgtt tttgggtata atgcttgtct tttttttgtt tttttttttt660ttgtctcaaa tctcaattcg aagacgagcc aagaaaaatt tagaggataa gcaaggaagc720taacgtattt tttcttttta atgtatatat aaagagagcc aagataacct ctttaaaaaa780aaaaaaaaaa aa7922104211294212DNA213麻瘋樹(Jatropha curcas)4004cgacgattgg ccacgcgtcg actagtacgg ggggggggaa acccgacctt ctttcgcttt60ttctacctgt aacaatttcc tttccatcca aacacgctct cagaatccaa aaacagaaaa120tggctccaag agagatctaa cagcactggc aataacctta accagaactc caataccgcc180gagacccgct acagaggcgt taggaaacga ccttggggcc gatacgccgc cgagatccga240gaccctggca agaaaactag ggtctggctt ggtacttttg atactgctga agag 29權利要求
1.麻瘋樹鹽誘導轉錄因子，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉錄激活功能的調控植物抗逆性的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的麻瘋樹鹽誘導轉錄因子，其特徵在於所述蛋白具有序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列。
3.編碼權利要求1所述的麻瘋樹鹽誘導轉錄因子的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的麻瘋樹鹽誘導轉錄因子的基因，其特徵在於所述基因具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權利要求3所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
6.一種提高植物耐逆性的方法，是將權利要求3所述的麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因導入植物組織或細胞，得到耐逆性提高的植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因通過含有所述麻瘋樹鹽誘導轉錄因子基因的植物表達載體導入植物組織或細胞。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於用於構建所述植物表達載體的出發載體為p3301-BI121、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述植物表達載體為p3301-BI121-JcERF。
10.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述植物宿主為水稻、小麥、大豆、菸草、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、麻瘋樹或擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一個麻瘋樹鹽誘導轉錄因子及其編碼基因與應用，其目的是提供一個麻瘋樹鹽誘導轉錄因子及其編碼基因與其在培育抗逆性提高的植物中的應用。該轉錄因子是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的胺基酸殘基序列經過一至十個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉錄激活功能的調控植物抗逆性的蛋白質。通過轉基因技術，將本發明的基因導入植物宿主，可得到抗乾旱、高鹽等逆境脅迫能力增強的轉基因植物(作物)，對於培育抗逆性提高的作物新品種具有重要的理論及實際意義，可應用於農牧業和生態環境治理所需的抗性植物品種的培育與鑑定，具有較高的實際應用價值。
文檔編號C07K14/415GK1807627SQ200610000100
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月10日 優先權日2006年1月10日
發明者唐明娟, 沈世華, 劉傑 申請人:中國科學院植物研究所