一種泛素連接酶及其應用的製作方法
2023-08-06 06:20:06
專利名稱：一種泛素連接酶及其應用的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種新的泛素連接酶及其應用，本發明還涉及該泛素連接酶的製備方法，還涉及該泛素連接酶的編碼基因及含有該基因的載體、宿主細胞，該泛素連接酶的抗體，以及它們的應用。
背景技術：
內質網相關的蛋白降解過程(ER associated degradation, ERAD)是細胞內重要的質量控制過程，對細胞內穩態的維持非常重要。在此過程中，內質網中的一些分子伴侶首先識別錯誤摺疊的蛋白或者其它需要降解的蛋白，然後在泛素-蛋白酶體的參與下完成這種蛋白的降解。泛素-蛋白酶體是真核細胞靶向性降解正常、錯誤摺疊胞漿或膜蛋白的主要途徑。泛素-蛋白酶體系統包括泛素⑴b)、泛素活化酶(El)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶 (E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUB)。蛋白酶體具有精確降解細胞內各種目的靶蛋白的功能，進而參與基因轉錄和細胞周期調節，以及受體胞吞、抗原提呈、細胞防禦和信號轉導等各種細胞生理過程。因此泛素-蛋白酶體也在治療疾病特別是癌症和神經系統退行性疾病中發揮重要作用。例如，一種泛素-蛋白酶體抑制劑萬珂(硼替佐米)已被用於多發性骨髓瘤的治療。2004年諾貝爾化學獎授予了三位科學家，以表彰他們發現了蛋白質泛素化引起的細胞蛋白質降解。蛋白質的泛素化過程是一個依賴ATP的酶促反應首先在El的催化下，泛素C末端甘氨酸殘基與El的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性；El-泛素結合的中間體再將泛素轉移給E2，形成E2-泛素中間體；最後靶蛋白的泛素化還需要另一個特異的泛素蛋白連接酶E3。E3可以直接或間接與底物結合，促使泛素從與E2形成的硫酯中間產物轉移到靶蛋白賴氨酸殘基的ε氨基基團上，形成異肽鍵。當第一個泛素分子連接到靶蛋白上後，另外一些泛素分子在Ε3的催化下相繼與底物相連的泛素分子的第48位賴氨酸殘基相連，形成一條多聚泛素鏈，作為底物被蛋白酶體識別和降解的靶向性信號。完成泛素化的蛋白質結構被展平進入26S蛋白酶體，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs從底物上水解下來而被重複利用。因為泛素-蛋白酶體對蛋白質的選擇性降解是通過泛素連接酶來實現的，所以泛素連接酶就在這個過程中起到最為關鍵性的作用。泛素連接酶從結構域上主要分為三類，其中一種類型是含RING finger (指環) 結構域的蛋白質。RING finger結構域是由40到60個胺基酸組成的一種鋅指結構，能夠結合兩個鋅原子，這個結構域可能參與蛋白與蛋白之間的相互作用，其基本組成是 CX2CX(9-39) C(1-3)HX(2-3) C/HX2C(4-48) CX2C，其中 C 是半胱氨酸，H是組氨酸，X代表任意胺基酸，括號中的數字代表任意胺基酸的個數。RING finger結構域最基本的組成是其中的幾個最為保守的半胱氨酸和組氨酸，根據這些保守的胺基酸，這個結構域可以分為兩種 C3HC4和C3H2C3，後面的這種通常被命名為RING-H2型。含有RING finger結構域的分子參與到各種生命活動中。RING finger結構域的發現為了解泛素-蛋白酶體這個降解途徑提供了更廣泛的思路，且部分RING蛋白質還是潛在的靶點，有可能為治療疾病提供幫助。然而，是不是所有的RING蛋白質均同泛素-蛋白酶體相關，並沒有得到驗證或證實，對於這方面的驗證還需要進行更進一步的大量實驗研究。另外，凋亡是所有多細胞生物的一個最基本的生理過程，是細胞的一種主動死亡行為，以維持機體細胞增殖和細胞死亡的平衡。它對於植物和動物的發育、昆蟲和兩棲類動物的變形、胚胎生長及器官的形態發生、組織的自穩、老化及感染和壞死細胞的清除等方面具有非常重要的意義。根據凋亡信號的來源可以將細胞凋亡信號轉導通路分成兩條外源性通路(死亡受體通路)和內源性通路(線粒體通路)。兩條信號通路匯集於下遊的效應 Caspase0效應Caspase在細胞凋亡的執行階段能夠直接引起重要蛋白質的降解和染色體 DNA的斷裂並最終導致細胞凋亡。
發明內容
本發明的一個目的在於提供一種新的泛素連接酶。本發明的另一目的在於提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發明所述的泛素連接酶蛋白的胺基酸序列。本發明的另一目的在於提供一種基因工程載體，其包含本發明所述的多核苷酸。本發明的另一目的在於提供一種經所述的基因工程載體轉化、轉染或轉導得到的宿主細胞。本發明的另一目的在於提供一種與本發明所述泛素連接酶特應性結合的抗體。本發明的另一目的在於提供一種製備所述泛素連接酶的方法。本發明的另一目的在於提供所述泛素連接酶、所述多核苷酸、所述載體、所述抗體的應用。本發明的另一目的在於提供一種用於診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細胞增殖和/ 或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物。一方面，本發明提供了一種泛素連接酶，該泛素連接酶為如下a)或b)所述的蛋白a)由SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列組成的蛋白；或b)在a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且與 a)限定的胺基酸序列具有相同泛素連接酶活性的由a)衍生的蛋白。另一方面，本發明還提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如上述a)或b) 所述的蛋白；所述的多核苷酸優選為具有以下核苷酸序列a) SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或b)在嚴格條件下與a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或c)與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90 %同源性、且編碼與由SEQ IDNO 2所示的胺基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的蛋白的核苷酸序列。另一方面，本發明還提供了一種基因工程載體，其包含如上所述的多核苷酸；所述的載體優選選自細菌質粒、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。另一方面，本發明還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞經所述的基因工程載體轉化、轉染或轉導得到；所述的宿主細胞優選選自大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。另一方面，本發明還提供了一種抗體，其與由SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列組成的蛋白或其保守變異多肽或片段特異性結合；所述抗體優選為單克隆抗體或多克隆抗體。另一方面，本發明還提供了一種製備所述泛素連接酶的方法，該方法包括在適於表達的條件下，培養含有所述多核苷酸的宿主細胞；所述的宿主細胞優選為上述的宿主細胞；從所述細胞培養物中獲得多核苷酸編碼的蛋白，製備得到泛素連接酶。另一方面，本發明還提供了如下a)或b)所述的蛋白作為泛素連接酶的應用a)由SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列組成的蛋白；或b)在a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且與 a)限定的胺基酸序列具有相同泛素連接酶活性的由a)衍生的蛋白。另一方面，本發明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、或所述的宿主細胞在製備用於抑制ERK磷酸化的製劑中的應用。另一方面，本發明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、所述的宿主細胞、或所述的抗體在製備用於腫瘤的診斷、基因治療和/或療效評價的藥物組合物中的應用；優選所述的藥物組合物為用於治療腫瘤和/或抑制腫瘤細胞增殖和 /或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物；優選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、 食道癌或肺癌腫瘤。另一方面，本發明還提供了一種用於診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細胞增殖和/ 或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有所述的泛素連接酶，或所述的多核苷酸， 或所述的載體，或所述的宿主細胞，或所述的抗體；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。優選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。
圖1為本發明中人類RNF122基因的核苷酸序列，其中，方框標記的為起始密碼子和終止密碼子。圖2為本發明中人類RNF122基因編碼的胺基酸序列，其中，方框標記的為 RINGfinger結構域的保守胺基酸。圖3為pEGFP-Nl-RNF122的構建流程示意圖。圖4為pEGFP-Nl-RNF122- Δ TM的構建流程示意圖。圖5為真核表達質粒RNF122C92A-myc的構建流程示意圖。圖6為pGEX4T-l-RNF122 Δ TM的構建流程示意圖。圖7顯示RNF122 Δ TM和mut_RNF122 Δ TM原核表達結果。其中，左圖片為 GST-RNF122ATM和突變型GST-RNF122ATM原核表達蛋白SDS-PAGE圖，右圖片為Western blot驗證實驗結果，利用GST抗體證實所表達蛋白。圖8顯示RNF122經泛素-蛋白酶體途徑降解實施例中檢測RNF122的表達結果。 其中，從左向右數第1、2、3道為HEK293T細胞，第4、5道為HeLa細胞。圖9顯示RNF122降解經RING finger結構域實現的實施例中的檢測結果。圖10顯示體內RNF122的泛素化實驗中的檢測結果。
圖11顯示RNF122重組蛋白自身泛素化實驗結果。其中，左圖片為RNF122泛素化， 右圖片中是使用突變型RNF122重組蛋白。圖12為RNF122-ATM的亞細胞定位。圖13顯示RNF122跨膜區和RING finger結構域對細胞凋亡的影響。圖14顯示RNF122抑制ERK通路的活化實驗結果。圖15顯示RNF122對EGF刺激產生信號的影響實驗結果。圖16顯示RNF122與內質網應激的關係的實驗結果。圖17為Wfestern blot鑑定RNF122多克隆抗體的實驗結果。
具體實施例方式根據本發明的一個方面，本發明提供了一種泛素連接酶，來源於人，其具有如 SEQID NO :2所示的胺基酸序列；或者，該泛素連接酶為在SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列中經過取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且與SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列具有相同泛素連接酶活性的蛋白。如SEQ ID NO :2所述的胺基酸序列為本發明的泛素連接酶的蛋白序列，稱為 RNF122蛋白，其由155個胺基酸殘基組成，蛋白分子量為17. 5kD，等電點為8. 21，其具有泛素連接酶活性。根據本發明，可以對如SEQ ID NO :2所述的胺基酸序列進行取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸，而獲得與如SEQ ID NO :2所述的胺基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的衍生序列。所述取代、缺失或添加一個或幾個(一般不超過10個)胺基酸而獲得具有相同功能的衍生物的技術是本領域技術人員所已知的，例如可以是進行非極性胺基酸間或是極性胺基酸間(特別是不帶電荷的極性胺基酸間或帶相同電荷(帶正電荷或負電荷)的極性胺基酸間)的取代。本發明還提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼本發明的泛素連接酶。所述的多核苷酸優選為具有以下核苷酸序列a) SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或b)在嚴格條件下與a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；所述的嚴格條件例如為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交並洗膜；c)與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90 %同源性、且編碼與由SEQ IDNO 2所示的胺基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的蛋白的核苷酸序列。RNF122基因為編碼本發明的SEQ ID NO :2的多核苷酸，其核苷酸序列可以為 SEQID NO 2所示胺基酸的編碼序列，除了上述胺基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸可以是DNA或 RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及人工合成的DNA，可以是單鏈的或雙鏈的，可以是編碼鏈或非編碼鏈。其中優選的基因為具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，該序列全長 1868個核苷酸，其包含編碼RNF122蛋白的序列(例如編碼序列(⑶S 核苷酸第403 870 位)和5'的非編碼區(核苷酸第1 402位)和3'的非編碼區(核苷酸第871 1868 位))。或者，更優選一種分離的核苷酸序列，其只包含RNF122蛋白的編碼序列。RNF122的基因組基因染色體定位8pl2，由5個外顯子和4個內含子組成。本領域普通技術人員已知，本發明RNF122的核苷酸序列可以完全相同於如SEQ
6IDNO :1所示的編碼序列，也可以由於遺傳密碼的簡併性，不完全等同於上述核苷酸的編碼序列。例如，根據每個具體的原核宿主或者真核宿主所使用的密碼子的頻率不同，可以選擇相應的密碼子，從而提高所述的多核苷酸在相應的宿主中表達效率。也可以為了獲得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更長的半衰期)而轉換密碼子。本發明的多核苷酸能用本領域已有的方法獲得。這些技術包括但不局限於(1) 通過雜交技術分離DNA序列；( 人工化學合成DNA序列；C3)通過構建cDNA文庫大規模獲得所需的多核苷酸；G)PCR擴增技術。例如，本發明的RNF122的核苷酸序列或其免疫性片段可以依據標準的PCR擴增技術將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，並選取合適的寡核苷酸引物擴增得到。這樣得到核苷酸可以克隆進合適的載體中，然後利用在所述載體中的複製得到。也可以通過標準DNA合成技術得到，例如使用可以按本領域熟知的固相亞磷酸醯胺三酯法在DNA合成儀上合成。本發明的基因，或者各種DNA片段等核苷酸序列的測定可用常規方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al. PNAS, 1977, 74 =5463-5467)；也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需要反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。本發明的RNF122蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白、半合成蛋白，優選重組蛋白。本發明的蛋白可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主中產生。本發明的RNF122蛋白可以通過常規方法獲得，例如可按照Meward和 Young (Steward, J. Μ.禾口 Young, J. D. , Solid PhasePeptide Synthesis,2nd Ed., Pierce ChemicalCompany, Rockford, 111. , (1984))描述的方法用 Applied Biosystem 合成儀或 PioneerTM合成儀按固相化學技術合成，或者可使用衍生於本發明的DNA構建體的mRNA，在無細胞翻譯系統中產生所需的蛋白或多肽。也可按常規的生物工程方法由宿主細胞中的重組DNA序列編碼產生蛋白或多肽產物(Science, 1984 ；224 :1431)，例如包括以下步驟(1) 用本發明的多核苷酸(或其變異體)，或用含有此多核苷酸的表達載體轉化、轉染或轉導合適的宿主細胞；( 在合適的培養基中培養步驟(1)得到的宿主細胞；C3)從培養基或細胞中分離、純化所需的蛋白或多肽。根據本發明的另一方面，本發明提供一種含有本發明的多核苷酸的載體。本發明中的多核苷酸可以插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒，如腺病毒、逆轉錄病毒，或者其它載體。在本發明中適宜的載體可以是選自細菌質粒、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、慢病毒等。本發明還涉及用上述載體或者本發明的多核苷酸經基因工程產生的適於表達本發明泛素連接酶的宿主細胞。本發明的載體和多核苷酸可以用於轉化適當的宿主細胞，如大腸桿菌，酵母菌，昆蟲細胞，哺乳動物細胞等，以使其能夠表達RNF122蛋白。本發明還提供一種生產所述泛素連接酶的方法在適於表達的條件下，培養含有編碼本發明的多核苷酸或其片段的宿主細胞；從所述細胞培養物中獲得多核苷酸編碼的蛋白，即製備得到本發明的泛素連接酶。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組蛋白。具體地說，在轉化宿主細胞並在被轉化的宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用適當的方法(如溫度變動或化學特質誘導)誘導啟動子，然後繼續培養。培養完成後，可用離心法收集細胞，並用任何已知的方法，這些方法是本領域技術人員所熟知的，如凍融法、超聲處理法、滲透破菌、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細胞。可以用各種已知的方法從宿主細胞培養物中回收和純化本發明的蛋白或融合蛋白，這些方法包括硫酸鐵或乙醇沉澱法、酸萃取法、超離心、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、 疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法、高效液相層析和其它各種液相層析技術或這些方法的結合。本發明還提供針對所述的RNF122蛋白的抗體。所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體，優選中和性抗體。所述的抗體優選為與SEQ ID NO :2的胺基酸序列組成的蛋白或其保守變異多肽或片段特異性結合的多克隆抗體或單克隆抗體。所述「特異性結合」是指多克隆抗體或單克隆抗體特異性識別靶抗原並與靶抗原的不同抗原表位或抗原決定簇結合的特性。上述抗體不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab片段和Fab表達文庫產生的抗體；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發明的多肽蛋白或其免疫性片段的抗體可用本領域公知的抗體製備方法來生產。例子有單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein. Nature, 1975, 256 :495-497)。多克隆抗體的生產可用本發明的蛋白或其免疫性片段免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。在本發明的一個實施例中(參見實施例14)，以本發明製備的純化的RNF122N蛋白為例，製備了多克隆抗體，經Western blot鑑定抗體特異性， 證實得到特異性好的抗體，該抗體可以用於檢測本發明RNF122的存在或水平，或用於檢測 RNF122基因，可將該抗體進一步用於RNF122的表達譜分析和功能研究。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術產生(Morrison et al. PNAS，1985，81 :6851)。單鏈抗體也可用已有的技術生產(U.S.Pat No. 4946778)。本發明的各類抗體可以利用本發明的蛋白或其免疫性片段、衍生物、類似物或表達它們的細胞作為抗原，通過常規免疫技術獲得，這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。根據本發明的一個方面，本發明證實了所述的RNF122蛋白為一種泛素連接酶(參見實施例5、6、7、8)。根據本發明的另一方面，本發明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、或所述的宿主細胞在製備用於抑制ERK磷酸化的製劑中的應用(參見實施例11)。根據本發明的另一方面，本發明還提供了所述的泛素連接酶、所述的多核苷酸、所述的基因工程載體、所述的宿主細胞、或所述的抗體在製備用於腫瘤的診斷、基因治療和/ 或療效評價的藥物組合物中的應用；優選所述的藥物組合物為用於治療腫瘤和/或抑制腫瘤細胞增殖和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物；優選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、 胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。本發明的RNF122的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在用於治療相關疾病的藥物組合物中利用其瞬時表達產物進行治療，也可以以包含在表達載體中的形式包含在用於治療相關疾病的藥物組合物中利用瞬時和穩定的表達產物進行治療。本發明還提供了一種用於診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細胞增殖和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有所述的泛素連接酶，或所述的多核苷酸，或所述的載體，或所述的宿主細胞，或所述的抗體；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。藥用賦形劑或藥用載體指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料。
本發明的實驗研究表明，本發明的泛素連接酶相關蛋白RNF122為一個新的泛素連接酶，定位於內質網，在大多數細胞中廣譜表達，但在多數腫瘤組織中低表達或表達缺失。其過表達能夠誘導細胞凋亡，N端跨膜區和RING finger結構域對於其發揮凋亡發揮重要作用。RNF122通過抑制ERK磷酸化參與調控ERK MAPK通路，並調節EGFR介導的信號通路，及在內質網應激相關通路發揮功能。本發明為進一步研究RNF122與細胞凋亡之間的調控關係，以及開發治療腫瘤新藥物，開創新的臨床診斷、療效評價及預後指標提供了一個新的基礎。
實施例下面結合具體實施例進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等著，科學出版社)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中未標明來源的試劑和材料均可商購獲得。實施例1、RNF122基因的cDNA的克隆通過生物信息學分析，利用兩步法RT-PCR技術擴增目的基因。(1)對NCBI的refseq資料庫進行人功能未知預測基因檢索，獲得人未知功能基因序列，並利用Humaruest資料庫通過BLASTn方法進行序列校正，最終得到的序列=SEQID N0:1(RNF122基因，請參見圖1所示，其所編碼的胺基酸序列請參見SEQ ID NO :2及圖2所示)。根據此類序列設計基因RNF122的特異引物上遊引物(5'-3' ) :CATTGATGCACCCATTCCAGTG(SEQ ID NO 3)；下遊引物(5'-3' ) :TCTCCAGGTCTCGGTGTAGCG(SEQ ID NO :4)。(2)用上述引物，按目的基因的表達譜在現有的cDNA文庫和腫瘤文庫中選擇模板，進行初擴。現有的文庫包括12種人體正常組織(心、胰、睪丸、卵巢、前列腺、結腸、小腸、 骨骼肌、胸腺、淋巴結、扁桃體、白細胞)；6種人腫瘤組織(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 結腸癌、乳腺癌)；和8種胎兒組積(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎腎、胎腦、胎骨骼肌、胎胸腺) 的cDNA文庫(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初擴反應條件如下50 μ 1 PCR 反應
權利要求
1.一種泛素連接酶，該泛素連接酶為如下a)或b)所述的蛋白a)由SEQID NO :2所示的胺基酸序列組成的蛋白；或b)在a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且與a)限定的胺基酸序列具有相同泛素連接酶活性的由a)衍生的蛋白。
2.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼如權利要求1中a)或b)所述的蛋白；所述的多核苷酸優選為具有以下核苷酸序列a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；b)在嚴格條件下與a)限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或c)與SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性、且編碼與由SEQID NO 2 所示的胺基酸序列組成的蛋白具有相同泛素連接酶活性的蛋白的核苷酸序列。
3.一種基因工程載體，其包含如權利要求2所述的多核苷酸；所述的載體優選選自細菌質粒、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。
4.一種宿主細胞，該宿主細胞經權利要求3所述的基因工程載體轉化、轉染或轉導得到；所述的宿主細胞優選選自大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
5.一種抗體，其與由SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列組成的蛋白或其保守變異多肽或片段特異性結合；所述的抗體優選為單克隆抗體或多克隆抗體。
6.一種製備權利要求1所述泛素連接酶的方法，該方法包括在適於表達的條件下，培養含有權利要求2所述多核苷酸的宿主細胞；所述的宿主細胞優選為權利要求4所述的宿主細胞；從所述細胞培養物中獲得多核苷酸編碼的蛋白，製備得到泛素連接酶。
7.如權利要求1中a)或b)所述的蛋白作為泛素連接酶的應用。
8.權利要求1所述的泛素連接酶、或權利要求2所述的多核苷酸、或權利要求3所述的基因工程載體、或權利要求4所述的宿主細胞在製備用於抑制ERK磷酸化的製劑中的應用。
9.權利要求1所述的泛素連接酶、或權利要求2所述的多核苷酸、或權利要求3所述的基因工程載體、或權利要求4所述的宿主細胞、或權利要求5所述的抗體在製備用於腫瘤的診斷、基因治療和/或療效評價的藥物組合物中的應用；優選所述的藥物組合物為用於治療腫瘤和/或抑制腫瘤細胞增殖和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物；優選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。
10.一種用於診斷腫瘤、治療腫瘤、抑制腫瘤細胞增殖和/或誘導腫瘤細胞凋亡的藥物組合物，該組合物含有權利要求1所述的泛素連接酶，或權利要求2所述的多核苷酸，或權利要求3所述的載體，或權利要求4所述的宿主細胞，或權利要求5所述的抗體；以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體；優選所述的腫瘤為未分化甲狀腺癌、胃癌、直腸癌、食道癌或肺癌腫瘤。
全文摘要
本發明提供了一種泛素連接酶及其應用，所述泛素連接酶為如下所述的蛋白由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的蛋白；或在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中經過取代、缺失和/或添加一個或幾個胺基酸且與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有相同泛素連接酶活性的蛋白。本發明還提供了製備所述泛素連接酶的方法，還提供了編碼所述的泛素連接酶蛋白的胺基酸序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的基因工程載體、宿主細胞，還提供了與所述泛素連接酶特應性結合的抗體，還提供了所述泛素連接酶、所述多核苷酸、所述載體以及所述抗體的應用。
文檔編號C12N15/52GK102168076SQ20101011462
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月25日 優先權日2010年2月25日
發明者彭智, 李娜, 石太平, 鄧唯唯, 郭帥, 馬大龍 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司