金環蛇抗菌肽cathelicidin－BF的應用的製作方法

2023-08-06 17:10:31 2

專利名稱：金環蛇抗菌肽cathelicidin－BF的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學技術領域，具體涉及金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF在製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用。
背景技術：
Cathelicidin是一個具有多功能的抗菌肽家族，目前僅在哺乳類、鳥類和魚類中有發現。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性，而且對許多臨床耐藥細菌同樣具有作用。除此之外， cathelicidin還具有許多其他生物學活性，如對多種免疫細胞具有趨化作用、誘導肥大細胞脫粒和組織胺釋放、調節巨噬細胞轉錄、促進傷口癒合、誘導血管發生、誘導變異細胞系細胞凋亡和淋巴細胞活化等。由於具有如此眾多的活性，cathelicidin —直是國際上研究的熱點。針對cathelicidin的藥用開發則蘊含著巨大的臨床治療藥物製備價值。隨著青黴素等傳統抗生素的大規模和不恰當使用，微生物對傳統抗生素產生了越來越強的耐受性，在臨床上已經出現了大量能夠完全耐受青黴素等傳統抗生素的微生物， 已有的抗生素對這些病原微生物無能為力。抗菌肽是一種新型的抗微生物多肽，大多數抗菌肽分子量小於lOOOODa，帶正電，富含疏水鹼基，能夠形成兩親性的結構。抗菌肽的殺菌機制主要是通過靜電相互作用吸引並結合到帶負電的細菌細胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內容物的外洩，從而導致細菌細胞的死亡。而傳統抗生素主要是作用於細菌細胞內的一些酶類。正是由於作用方式的不同，抗菌肽介導的殺菌作用遠遠快於傳統抗生素，並且不易使細菌產生耐受性。除此之外，越來越多的文獻報導表明抗菌肽還具有其他的殺菌機制，如抑制細菌細胞壁合成、改變細菌細胞質膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細胞內酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質的合成等。目前，國外有許多公司正在進行抗菌肽的研究開發，已有多種抗菌肽進入臨床試驗階段。如來源於人Iactoferrin的hLF_l_l用於治療骨髓幹細胞移植相關的感染，已進入臨床II期。來源於非洲爪蟾magainin的MSI-78對糖尿病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進入臨床III期試驗階段。來源於豬protegrin的IB-367用於治療腫瘤患者口腔潰蕩，已進入臨床I期試驗。除此之外，一些用於傷口癒合，內毒素感染，腫瘤，病毒感染的抗菌肽也已進入臨床試驗階段。在中國的傳統中藥和民族醫藥中，許多蛇類被作為藥材而得到廣泛的應用，如烏稍蛇，蟒蛇，蝮蛇，金環蛇，銀環蛇，眼鏡蛇，五步蛇等。蛇全身均可入藥，蛇肉具有強壯神經、 延年益壽功效，可治療病後體弱、風痺麻木、關節疼痛等症。蛇膽具有祛風、清熱、化痰、明目的功效，主治小兒疳積、痔瘡腫痛。蛇膽汁乙醇溶液能有效治療角膜炎、角膜潰瘍、角膜斑醫。以蛇膽汁、川貝母、杏仁為主要原料製成的「蛇膽川貝液」，是目前臨床使用方便、療效顯著的止咳祛痰良藥，蛇蛻具有祛風定驚、殺蟲、退翳消腫、清熱解毒的功能，可治目翳、瘡癤、 痔漏、痄腮、瘧疾、小兒驚癇、疥癬、瘰癧等症。蛇毒是目前國際藥材市場上十分昂貴的珍奇藥材，利用蝮蛇毒製成的注射液，具有明顯的抗癌、抗血凝作用。
與此同時，傳統中藥藥物成分的複雜性及其炮製方法的局限性造成藥物活性成分不能更好的發揮作用，因而從這些傳統藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現代化的重要內容之一。迄今為止，國內外學者已經從蛇毒中分離出大量生物活性蛋白及多肽，其中的許多活性多肽具有很好的藥物開發前景。金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF是由發明者從金環蛇毒液發現的由30個胺基酸組成的的抗微生物肽，含有三十個胺基酸殘基，分子量為3637. 54Da，等電點11. 79。金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF全序列為賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-丙氨酸-賴氨酸-穀氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸，具有顯著的抗菌活性，並且溶血活性和細胞毒性都很低(見文獻Wang Y, Hong J，Liu X，Yang H, Liu R,ffu J, Wang A, Lin D，Lai R.Snake cathel icidin from Bungarus fasciatusis a potent peptide antibiotics. PLoS One. 2008 ；3 (9) :e3217)。發明人將金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF作為製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用，未發現有任何相同應用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF在製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用。為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案考察兩種常見細菌性陰道炎病原菌(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)對 cathelicidin -BF 的敏感性採用瓊脂平板稀釋法測定cathelicidin-BF對細菌的最小抑制濃度(MIC)。取無菌試管(IOml) 12支，排成一排。每管加入無菌水lml，在第1管加入藥物原液(1280 μ g/ ml) Iml混勻，然後吸取Iml至第2管，混勻後再吸取Iml至第3管，如此連續倍比稀釋至第 12管，每稀釋前充分混勻。此時各管藥物濃度依次為640、320、160、80、40、20、10、5、2. 5、 1.25,0. 625,0. 313μ g/mL·然後將各濃度的溶液加至平皿中，lml/皿，再加入9ml的MH瓊脂培養基，邊加邊搖，使之充分混勻。此時各平皿藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0. 5、 0. 25,0. 125,0. 0625,0. 0313yg/mlo同時，設空白對照和陰性對照。將製備好的接種物， 加入96孔板，250 μ 1/孔，用點樣器接種。將接種好的平皿倒置，37°C普通空氣孵箱中孵育 16h。檢查空白對照的細菌生長情況是否良好，以肉眼觀察，藥物最低濃度組無細菌生長者， 即為受試菌的MIC。考察體外殺菌速度採用4倍於MIC的藥物濃度，將製備好的1 2 X 106CFU/ml的菌懸液與藥物混合， 使其濃度為105CFU/ml左右。在0、1、2、4、6、8、10、12和Mh時，吸取培養物，進行系列稀釋， 活菌計數，每個稀釋度做三個平行實驗，求平均值。最後以細菌濃度對數為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪製殺菌曲線。考察對大鼠細菌性陰道炎的治療作用細菌性陰道炎模型的建立
首先用無菌較硬的棉拭子反覆塗擦大鼠陰道內壁15次，使陰道黏膜機械性損傷， 致使棉拭子粘有少許血性粘液為度，然後向大鼠陰道注入大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的菌液(約109CFU/ml)，注射菌液量為50μ l/200g，注入部位距陰道口 5mm，每日接種一次，共接種7次，每日觀察大鼠陰道黏膜，在接種首日後的第9天取陰道分泌物進行鏡檢和細菌培養，並作菌株鑑定。病原體檢查為陽性，且肉眼觀察陰道黏膜均發生充血、水腫、出血或浸潤者為感染成功。將感染成功的大鼠隨機分組治療。動物的分組與給藥將成功感染的SD大鼠隨機分成5組，10隻/組。治療細菌性陰道炎模型的組別分別為高(0.8mg/kg)、中(O.^ig/kg)、低(0. 2mg/kg)劑量組、陽性對照(環丙沙星0. 5mg/ kg)和模型組(給予同樣體積的生理鹽水)。各組大鼠每日陰道給藥一次，將BF-30用生理鹽水配成不同濃度的溶液，用200 μ 1的注射器由外陰道內5mm處注入50 μ 1不同濃度的 cathe 1 i c i din-BF、陽性對照組和模型組分別給予同等體積的環丙沙星和生理鹽水。組織菌落計數和組織切片連續給藥7天，停藥後取大鼠陰道分泌物進行檢查，觀察陰道黏膜病變情況及病原體存活情況。用2支無菌棉籤棒伸入大鼠陰道0. 5cm轉動，放置3ml無菌生理鹽水中浸泡，混勻後，進行菌落數計算。於給藥7天後處死大鼠，解剖，取陰道約1cm，放置10%的甲醛中固定。常規固定，HE染色，然後進行光鏡組織學觀察。本發明的有益效果在於化學合成金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF，在體外對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有強殺菌作用、殺菌迅速的有益特點。cathelicidin-BF對大腸桿菌感染的陰道炎的作用與其對金黃色葡萄球菌感染的陰道炎的結果基本相同，其對陰道內的金黃色葡萄球菌或者大腸桿菌明顯抑制，cathelicidin-BF具有明顯的減輕炎症的作用，能夠作為製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用。


圖1為cathelicidin-BF對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的殺菌曲線(MIC = 16 μ g/ml)ο圖 2 為 cathelicidin-BF對大腸桿菌(ATCC25922)的殺菌曲線(MIC = 2 μ g/ml)。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容並不局限於此。—、考察兩種常見細菌性陰道炎病原菌(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)對 cathelicidin-BF 的敏感性1.材料1. 1菌株臨床分離的細菌性陰道炎感染者的金黃色葡萄球菌(11株)和大腸桿菌(10株)。1. 2培養基營養瓊脂、肉湯、Mueller-Hint0n(MH)瓊脂培養基(細菌)、沙堡瓊脂
培養基。
1. 3藥物化學合成金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF、桿菌肽、環丙沙星、氨苄青黴
素和阿奇黴素等。2考察耐藥菌對cathelicidin-BF的敏感性2. 1採用瓊脂平板稀釋法測定cathelicidin-BF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的 MIC0取無菌試管(IOml) 12支，排成一排。每管加入無菌水lml，在第1管加入藥物原液 (1280 μ g/ml) Iml混勻，然後吸取Iml至第2管，混勻後再吸取Iml至第3管，如此連續倍比稀釋至第12管，每稀釋前充分混勻。此時各管藥物濃度依次為640、320、160、80、40、20、10、 5、2. 5,1. 25,0. 625,0. 313 μ g/ml。然後將各濃度的溶液加至平皿中，lml/皿，再加入9ml的 MH瓊脂培養基，邊加邊搖，使之充分混勻。此時各平皿藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、 0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0. 0313 μ g/ml。同時，設空白對照和陰性對照。將製備好的接種物，加入96孔板，250μ 1/孔，用點樣器接種。將接種好的平皿倒置，37°C普通空氣孵箱中孵育16h。檢查空白對照的細菌生長情況是否良好，以肉眼觀察，藥物最低濃度組無細菌生長者，即為受試菌的MIC。結果如表1所示。表1 cathelicidin-BF對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性
權利要求
1.金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF的應用，其特徵在於金環蛇抗菌肽 cathelicidin-BF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯抑制、快速殺菌以及明顯減輕炎症的作用，能作為製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物醫學技術領域，具體涉及金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF在製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用。本發明的金環蛇抗菌肽cathelicidin-BF，在體外對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有強殺菌作用、殺菌迅速的有益特點；cathelicidin-BF對大腸桿菌感染的陰道炎的作用與其對金黃色葡萄球菌感染的陰道炎的結果基本相同，其對陰道內的金黃色葡萄球菌或者大腸桿菌明顯抑制，cathelicidin-BF具有明顯的減輕炎症的作用；能夠作為製備治療細菌性陰道炎藥物中的應用。
文檔編號A61K38/17GK102294019SQ20111026501
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月7日 優先權日2011年9月7日
發明者劉蕊, 張治業, 李東升, 賴仞 申請人:中國科學院昆明動物研究所