一種camv35s基因檢測用引物、相應的試劑盒及檢測方法
2023-05-01 20:47:06 2
專利名稱：一種camv35s基因檢測用引物、相應的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢驗檢測領域，具體涉及一種CAMV35S基因檢測用引物、相應的試劑 盒及檢測方法。
背景技術：
CAMV35S基因為花椰菜花葉病毒的35S啟動子，廣泛應用於轉基因大豆、玉米、油 菜、馬鈴薯及番茄等轉基因農作物。為了加強對轉基因產品的監督和管理，目前發展了多種轉基因成分檢測方法，從 基於蛋白質的ELISA檢測技術到基於核酸的聚合酶鏈式反應(PCR)技術以及快速發展的 基因晶片技術。其中PCR檢測技術以其靈敏性、特異性、高效性而最為通用，這種技術通過 檢測轉基因產品中含有的外源核酸片段來鑑定，隨著螢光實時定量聚合酶鏈式反應(real time PCR)的出現，不僅能夠進行轉基因產品的定性鑑定，而且可以對轉基因成分進行定 量。以PCR技術為代表的轉基因產品檢測技術在實際應用中也存在一些問題，如普 通PCR技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉汙染和操作過程煩瑣的缺點。而Real time PCR技術雖然較好地解決了交叉汙染的問題，並簡化了操作過程，但卻需要更複雜的 定量測定儀器，因此不適用於現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒 光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。基因晶片技術能夠實現快速和高通量的檢 測，然而價格昂貴，檢測成本高。所以及時運用生物技術發展的最新成果對滿足轉基因產 品檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫擴增(Isothermal Amplification)核酸 快速檢測技術是轉基因產品檢測技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術 (loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡稱 LAMP)具有很多的優越性，且目 前也未見有用環介導等溫擴增技術檢測轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒。
發明內容
本發明的目的在於根據現有診斷CAMV35S基因中存在的成本高。設備複雜、不利 於快速檢測等問題，提供一種快速、簡單、成本低、設備簡單的CAMV35S基因檢測用引物。本發明另一目的在於提供包含上述CAMV35S基因檢測用引物的試劑盒。本發明還有一個目的在於提供一種快速檢測CAMV35S基因的方法。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
本發明的轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因檢測用引物組，是基於環介導等 溫擴增技術，根據已公開的轉基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因序列，選取轉基因 農作物及其加工產品中CAMV35S基因的特異性序列，然後分析設計出的，能專一性鑑別轉 基因農作物及其加工產品中CAMV35S基因的特異性引物組，通過PCR來鑑定轉基因農作物 及其加工產品中CAMV35S基因，該引物組由如下四條引物組成 外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或6所示; 內引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或7所示; 內引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4或8所示。本發明的轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒，是由兩對引物、fei DNA聚 合酶、反應液、穩定液、顯色液和陽性對照液組成，上述每IL反應液中含有1.6 2mmol dNTP、2(T25mmol Tris-HCl、10 12. 5mmol 氯化鉀、10 12. 5mmol 硫酸銨、8 IOmmol 硫酸鎂、 Γ . 25ml TritonX-100、0. 8 Imol 甜菜鹼、內引物 FIP/BIP 各 1. 6 2 μ mol 和外引物 F3/ B3各0. 2 0. 25 μ mol ；優選的比例是每IL反應液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、 12. 5mmol 氯化鉀、12. 5mmol 硫酸銨、IOmmol 硫酸鎂、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜鹼、內 引物 FIP/BIP 各 2 μ mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25 μ mol。上述顯色液優選為螢光染料STOR Green I或EvaGreen。
上述穩定液優選為石蠟油。上述陽性對照為CAMV;35S基因DNA片段。本發明基因快速診斷試劑盒的生產工藝
1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化後，定量配製，濃度檢測，抽樣質檢；
2、將反應液無菌分裝，並按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；
3、將穩定液無菌分裝，抽樣質檢；
4、將陽性對照標本製備，分裝，抽樣質檢；
5、組裝試劑盒。本發明基因快速診斷試劑盒的檢測方法 1、樣品處理
待測樣品中DNA的提取和含量測定按國標按照GB/T 19495. 3-2004中的規定執行。對 樣品進行DNA提取時要保證DNA的質量和濃度的穩定，以保證PCR反應的可重複性。要確 保提取的DNA片段大於擴增片段。2、環介導等溫擴增技術反應過程
在反應管中加入反應液38 40體積％，Bst DNA聚合酶大片段0. 9 1. 8體積％，穩定 液52 54. 5體積％，樣品模板DNA 4. 5、體積％，63 65°C恆溫反應45 90min。所述體積百分 比是指佔四個組分總體積的體積百分比。3、反應後處理
在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為 陽性，否則為陰性。本發明的原理是利用fei DNA聚合酶和根據靶基因序列設計的兩對特殊的內、外 引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環 鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很 多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子 與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白色沉澱，即可通過肉眼觀察判定 結果。LAMP反應是在恆溫(63飛5°C)條件下45 90分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條 件以及沒有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易汙染及 檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設備，有利於建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種 簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。將恆溫基因擴增技術與PCR技術(包括螢光實時定 量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異性和檢測範圍等方法學指標上相當 於或優於PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢 測成本遠低於螢光定量PCR技術。國內目前尚未有這方面的試劑盒出售。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
1.本發明的基因快速診斷試劑盒只需一個恆定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑 與設備，檢測成本低；
2.本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶 標物質的存在與否，因此具有高特異性；
3.本發明的基因快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到1小時即可完成擴增，且產
率尚；
4.本發明的基因快速診斷試劑盒靈敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；
5.本發明的基因快速診斷試劑盒鑑定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液 中的Mg2+結合，產生副產物一焦磷酸鎂沉澱，可通過肉眼觀察鑑定，並且加入顯色液後，陰 陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。
圖1為實施例4中試劑盒特異性檢測結果圖；其中，1為ddH20，2為TE緩衝液，3 為大米非轉基因樣品W818 DNA，4為大豆非轉基因樣品W794 DNA，5為25ng大豆轉基因樣 品W562 DNA，6為50ng大豆轉基因樣品W562 DNA，7為IOOng大豆轉基因樣品W562 DNA, 8為250ng大豆轉基因樣品W562 DNA。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步地闡述，但具體實施例並不對本發明做任 何限定。實施例1轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒的製備 (1)按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物
外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或5所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2或6所示; 內引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或7所示; 內引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4或8所示。(2)購置DNA聚合酶-.Bst DNA polymerase (大片段)，置於容器。(3)配製反應液反應液的配方按每IL溶液含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl, 12. 5mmol 氯化鉀、12. 5mmol 硫酸銨、IOmmol 硫酸鎂、1.25ml TritonX-100、Imol 甜菜鹼、內 引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0. 25mol配製，置於容器。(4)購置穩定液石蠟油，置於容器。(5)購置顯色液STOR Green I，置於容器。(6)提取陽性對照製備CAMV35S基因DNA片段分別置於容器。
(8)將上述5個容器裝成試劑盒，封裝。製備工藝簡述如下
1、將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化後，定量配製，濃度檢測，抽樣質檢；
2、將反應液無菌分裝，並按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；
3、將穩定液分裝，抽樣質檢；
4、將陽性對照標本製備，分裝，抽樣質檢；
5、組裝試劑盒。實施例2轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒的應用
本實施例採用實施例1製備的轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒進行待測樣品 中CAMV35S基因的快速診斷。1、樣品處理(模板DNA提取)
1)將IOOmg經預處理的試樣，在液氮中充分研磨成粉末後加人700μ L CTAB提取緩
衝液I中(不需研磨的試樣直接加
入)，振蕩後混勻，65°C保溫30 min，其間不時輕緩顛倒混勻2_3次。2)加人700μ L三氯甲烷-異戊醇，輕緩顛倒混勻溶液2_3次。12000g離心5 min
至分相。3)將上清液轉移至乾淨的離心管中，加人0.6倍體積的4°C預冷的異丙醇， 於-20°C靜置 5min，12 000 g 離心 5 min。4)棄上清液，加入IOOOPL 70%乙醇，輕輕轉動離心管，4°C下8000g離心1 min， 棄上清液後，再加入20μ L Rnase A酶(10μ g /μ L)，37°C溫浴30min。5)加入600μ 氯化鈉溶液，65°C溫浴lOmin。加入600μ 三氯甲烷-Tris飽和酚， 顛倒混勻後，12000g離心5 min，轉移上清液至1. 5mL離心管中。6)加人0. 6倍體積的4°C預冷的異丙醇，於4°C靜置30min，12 000 g離心10 min,
棄去上清液。7)加入1000 μ 4°C預冷70%乙醇，輕輕轉動離心管，4°C下12 000 g離心10 min,
棄上清液。重複一次操作。室溫下揮發液體。8)沉澱乾燥後，加入50μ TE緩衝液充分溶解DNA，_20°C保存備用。2、環介導等溫擴增技術的反應過程
1)在200μ1反應管配製反應體系反應液22μ1，^ DNA聚合酶0. 5μ1 (4U)，模板 DNA 2. 5 μ 1。2)將配製好的反應管於64°C恆溫反應lh。3、反應後處理
向上述PCR反應產物中加入2μ 1 SYBR Green I，混勻，同時也向陽性對照管中加入 SYBR Green I混勻，若反應管與對照管一樣顯現綠色則為陽性，若反應管顯現橙色則為陰性。實施例3轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒的特異性驗證
本實施例採用實施例1製備的轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒進行試劑盒的 特異性檢測。
採用實施例1製備的轉基因作物CAMV35S基因快速診斷試劑盒，分別對大豆轉基 因樣品W562、大豆非轉基因樣品W794、大米非轉基因樣品W818、ddH20和TE緩衝液進行擴 增，非轉基因樣品DNA分別加入250ng，大豆轉基因樣品DNA分別加入250ng、100ng、50ng和 25ng,每個樣品設置2個重複。反應體系為反應液22Pl、fei DNA聚合酶0. 5μ1、穩定液30μ1和DNA模板 2. 5μ1。反應程序金屬浴中65°C，1小時。反應完畢後加入顯色液2. Ομ ，觀察結果，如表1和圖1所示。
權利要求
1.一種CAMV35S基因檢測用引物，其特徵在於由外引物F3、外引物B3、內引物FIP和內 引物BIP組成，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:廣4所示。
2.—種CAMV35S基因檢測用引物，其特徵在於由外引物F3、外引物B3、內引物FIP和內 引物BIP組成，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0:5 8所示。
3.一種試劑盒，其特徵在於包括權利要求1或2所述CAMV35S基因檢測用引物。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒由權利要求1所述CAMV35S 基因檢測用引物、fei DNA聚合酶、反應液、穩定液、顯色液和陽性對照液組成；其中，所述 反應液的配方為每IL反應液中含有1. 6 2mmol dNTP、2(T25mmol Tris-HCl,10^12. 5mmol 氯化鉀、10 12. 5mmol硫酸銨、8 IOmmol硫酸鎂、廣1. 25ml TritonX-100,0. 8 Imol甜菜鹼、 內引物FIP/BIP各1. 6^2mol和外引物F3/B3各0. 2^0. 25mol ；所述陽性對照為CAMV35S基 因DNA片段。
5.根據曲安咯要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述顯色液為STORGreen I或 EvaGreen0
6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述每IL反應液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl,12. 5mmol 氯化鉀、12. 5mmol 硫酸銨、IOmmol 硫酸鎂、1. 25ml TritonX-IOOUmol 甜菜鹼、內引物 FIP/BIP 各 2mol 和外引物 F3/B3 各 0. 25mol。
7.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述穩定液位石蠟油。
8.利用權利要求3所述試劑盒檢測CAMV35S基因的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)待測樣品DNA的製備；(2)在反應管中加入反應液38 40體積％，BstDNA聚合酶0. 9 1. 8體積％，穩定液 52 54. 5體積％，樣品模板DNA 4. 5、體積％，恆溫反應；(3)在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則 為陽性，否則為陰性。
9.根據權利要求8所述的檢測CAMV35S基因的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述恆溫 反應的溫度為63 65°C，反應時間為45 90min。
全文摘要
本發明公開了一種CAMV35S基因檢測用引物、相應的試劑盒及檢測方法。本發明CAMV35S基因檢測用引物由外引物F3、外引物B3、內引物FIP和內引物BIP組成，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1~4所示。本發明所述引物根據是否擴增就能判斷靶標物質存在與否，具有高度特異性；本發明試劑盒可以快速診斷CAMV35S基因，只需一個恆定溫度就能擴增，不需要特殊試劑或設備，檢測成本低，適合推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102140516SQ20111000379
公開日2011年8月3日 申請日期2011年4月2日 優先權日2011年4月2日
發明者曹以誠, 李志勇, 杜正平, 譚慧媚, 陳洵, 高東微 申請人:廣州華峰生物科技有限公司