用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法
2023-07-07 17:28:11
專利名稱：用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法。
背景技術：
果糖二磷酸鈉含量測定方法主要有高效液相(HPLC)法、紫外(UV)吸收法、氣相色譜(GC)法、多種化學比色法及酶法測定。其中酶法測定專屬性強、準確迅速。但是涉及酶法測定的醛縮酶(ALD)、磷酸丙糖異構酶(TIM)和甘油磷酸脫氫酶(GDH)價格昂貴，造成測定成本很高。為解決此問題，現階段已有專利200910091934.X，從動物肌肉中提取固體酶複合物替代以上三種酶，取得一定成果。但是此專利中提及的用水提取肌肉中酶的方法，必然造成細胞裂解不完全，提取效率低下，最終導致產量不足。紗布過濾方法很難最大程度濾過肉糜中的酶提取液，也會降低最終產量；且肉糜極粘稠，人工擠壓紗布效率難於標準化，影響後續提取工序。硫酸銨 沉澱法中未給出具體數據，不利於批量生產的穩定性；且沉澱條件不能有效提高單位酶活，硫酸銨飽和度達到70%以上後沉澱物多為雜蛋白。故原有技術方案生產效率低且成本高。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種改進的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法。為解決以上技術問題，本發明採用如下技術方案:
一種用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，以兔肉為原料，通過裂解、離心的方法從所述的原料中提取醛縮酶(ALD)、磷酸丙糖異構酶(TIM)和甘油磷酸脫氫酶(GDH)複合物，所述的裂解為鹼裂解，每lmL/g所述的原料中加入0.01-0.1M的鹼性溶液。優選地，所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，包括依次進行的如下步驟:
步驟1、將所述的原料打成肉泥；
步驟2、將所述的肉泥置於容器中，每lmL/g所述的原料中加入0.01-0.1M的所述的鹼性溶液，攪拌10-20分鐘；
步驟3、冷凍離心10-20分鐘，將上清液轉移至新的容器中；
步驟4、將離心後的沉澱物再用0.01-0.1M的所述的鹼性溶液進行多次鹼裂解、冷凍離心，將多次離心的上清液轉移至所述的新的容器中；
步驟5、向所述的新的容器中緩慢加入質量含量在90-97%的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌至最終的硫酸銨溶液的飽和度為30-40%，調節pH至5.0±0.5，放置20-40分鐘；
步驟6、將步驟5所得的溶液冷凍離心10-20分鐘，取上清液再加入質量含量在90-97%的飽和硫酸銨溶液至最終的硫酸銨溶液的飽和度為50-60%，調節pH至3.5±0.5，放置20-40分鐘；
步驟7、將步驟6所得的溶液冷凍離心10-20分鐘，將沉澱物於-20°C預凍，然後凍幹得所述的固體酶複合物。優選地，所述的步驟3中的離心時的轉速為5500_7000rpm。優選地，所述的步驟4中的離心時的轉速為5500_7000rpm。優選地，所述的步驟6中的離心時的轉速為8000-10000rpm。優選地，所述的步驟7中的離心時的轉速為8000_10000rpm。優選地，所述的鹼性溶液為KOH溶液或NaOH溶液。優選地，所述的固體酶複合物的製備過程在0_4°C下進行。優選地，所述的原料為兔的背部肌肉或大腿部肌肉或兩者的混合物。本發明的有益效果在於:
通過採用本技術方案，能夠 有效提高固體酶複合物的最終產量、單位酶活力和批量生產的穩定性。
附圖1為不同飽和度梯度硫酸銨溶液對沉澱中單位酶活力的影響；
附圖2為不同pH值對沉澱中單位酶活力的影響；
附圖3為實施例1與對比例I的產量、單位酶活力的比較。
具體實施例方式下面對本發明作進一步闡述。實施例1
取家免一隻，固定，猝死後剝皮割取背部及大腿部肌肉，置於碎冰上，同時用剪刀剪碎。用在-20°C冰箱預冷的絞肉機將碎肉打成肉泥，稱重。置於燒杯中，按照lmL/g碎肉的量加入0.05M的KOH溶液，均勻攪拌15分鐘後於4°C冷凍離心機7000rpm離心10分鐘。將上清轉移至新的燒杯中，肉糜沉澱再用半量的0.05M KOH同樣方法抽提並離心後，合併兩次離心上清液，以上操作均於碎冰上或4°C環境下進行。緩慢加入飽和硫酸銨溶液(706g/L，4°C)，邊加邊攪拌至最終40%的飽和度，調節pH至5.0，於碎冰上放置30分鐘。之後4°C，8000rpm冷凍離心15分鐘，取上清液再加入飽和硫酸銨溶液至最終60%的飽和度，調節pH至3.5，於碎冰上放置30分鐘。最後，4°C，IOOOOrpm冷凍離心20分鐘，獲得沉澱於_20°C預凍，冷凍乾燥機過夜凍幹。凍乾粉末研細後分裝，按照藥典方法測定其單位酶活，以每Ig固體酶複合物每分鐘催化果糖二磷酸鈉的量大於4(^g為合格產品，_20°C保存，用於果糖二磷酸鈉含量的測定。實驗結果見附圖1和附圖2，附圖1為家兔肌肉在0.05M的KOH裂解後離心所得上清，用不同飽和度的硫酸銨溶液依次對其進行沉澱，沉澱凍幹後測複合物中的單位酶活力。圖中40-50%和50-60%飽和度梯度的硫酸銨溶液有利於沉澱中單位酶活力的提高；
附圖2為家兔肌肉在0.05M的KOH裂解後離心所得上清，在40%飽和度的硫酸銨溶液條件下，調節不同PH值對其進行沉澱，沉澱凍幹後測複合物中的單位酶活力。圖中pH4條件下沉澱中單位酶活力大幅提高。對比例I
取家免一隻，固定，猝死後剝皮割取背部及大腿部肌肉，低溫下用絞肉機絞成肉泥(500毫升)，盛於1000毫升燒杯中，加入等體積水攪拌15分鐘後用醫用3-4層紗布擠壓進行粗過濾，濾渣再用半量水二次抽提，合併兩次濾液，加入標準試劑(含量在98%以上)固體硫酸銨到飽和(固體硫酸銨不溶解)，邊加邊拌，加完後放冰箱冷藏(5°C左右)存放30分鐘，存液冷凍離心30分鐘，轉速為4000轉/分鐘(轉速過大時，大分子將被分離)，取離心上清液再精細過濾《通過石棉濾板布氏漏鬥》去除尚存的沉澱懸浮物。清液中再加入標準試劑(含量在98%以上)固體硫酸銨到80%的飽和度。然後將此液以7000轉/分鐘(此轉速可將有效大分子分離)冷凍離心30分鐘，沉澱為粉紅色糊狀物將其分裝在培養皿中，冷凍乾燥得粉紅色固體。研細後分裝，按照藥典方法測定其單位酶活，以每Ig固體酶複合物每分鐘催化果糖二磷酸鈉的量大於40呢為合格產品，_20°C保存，用於果糖二磷酸鈉含量的測定。實施例2
專用固體複合酶的活力測定方法:
國藥典化發〔2009〕12號文件(果糖二磷酸鈉及其製劑質量標準徵求意見稿)中:果糖二磷酸鈉(FDP)檢測方法中的固體複合酶試劑。實驗結果見附圖3，分別採用兩種方法提取家兔運動肌肉中的固體酶複合物，凍幹後對其稱重並測定單位酶活力。圖中固體酶複合物採用實施例1製備後產量顯著提高約2.0倍，單位酶活力也顯著提高約1.9倍，* P〈0.001。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或 修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，以兔肉為原料，通過裂解、離心的方法從所述的原料中提取醛縮酶(ALD)、磷酸丙糖異構酶(TIM)和甘油磷酸脫氫酶(GDH)複合物，其特徵在於:所述的裂解為鹼裂解，每lmL/g所述的原料中加入0.01-0.1M濃度範圍的鹼性溶液。
2.根據權利要求1所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:包括依次進行的如下步驟: 步驟1、將所述的原料打成肉泥； 步驟2、將所述的肉泥置於容器中，每lmL/g所述的原料中加入0.01-0.1M濃度範圍的所述的鹼性溶液，攪拌10-20分鐘； 步驟3、冷凍離心10-20分鐘，將上清液轉移至新的容器中； 步驟4、將離心後的沉澱物再用0.01-0.1M濃度範圍的所述的鹼性溶液進行多次鹼裂解、冷凍離心，將多次離心的上清液轉移至所述的新的容器中； 步驟5、向所述的新的容器中緩慢加入質量含量在90-97%的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌至最終的硫酸銨溶液的飽和度為30-40%，調節pH至5.0±0.5，放置20-40分鐘； 步驟6、將步驟5所得的溶液冷凍離心10-20分鐘，取上清液再加入質量含量在90-97%的飽和硫酸銨溶液至最終的硫酸銨溶液的飽 和度為50-60%，調節pH至3.5±0.5，放置20-40分鐘； 步驟7、將步驟6所得的溶液冷凍離心10-20分鐘，將沉澱物於-20°C預凍，然後凍幹得所述的固體酶複合物。
3.根據權利要求2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的步驟3中的離心時的轉速為5500-7000rpm。
4.根據權利要求2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的步驟4中的離心時的轉速為5500-7000rpm。
5.根據權利要求2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的步驟6中的離心時的轉速為8000-10000rpm。
6.根據權利要求2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的步驟7中的離心時的轉速為8000-10000rpm。
7.根據權利要求1或2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的鹼性溶液為KOH溶液或NaOH溶液。
8.根據權利要求1或2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的固體酶複合物的製備過程在0-4°C下進行。
9.根據權利要求1或2所述的用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，其特徵在於:所述的原料為兔的背部肌肉或大腿部肌肉或兩者的混合物。
全文摘要
用於測定果糖二磷酸鈉含量的固體酶複合物的製備方法，以兔肉為原料，通過裂解、離心的方法從所述的原料中提取醛縮酶(ALD)、磷酸丙糖異構酶(TIM)和甘油磷酸脫氫酶(GDH)複合物，所述的裂解為鹼裂解，每1mL/g所述的原料中加入0.01-0.1M濃度範圍的鹼性溶液。通過採用本技術方案，能夠有效提高固體酶複合物的最終產量、單位酶活力和批量生產的穩定性。
文檔編號C12N9/00GK103173421SQ20131008976
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月20日 優先權日2013年3月20日
發明者吳海春 申請人:吳海春, 趙軍