外泌體在皮膚美白製劑中的應用的製作方法

2023-07-08 03:01:31

本發明涉及幹細胞領域，具體涉及幹細胞產生高活性的外泌體在皮膚美白製劑中的應用。

背景技術：

外泌體(exosome)是細胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑約為30-150納米之間，具有典型的脂質雙分子層膜結構，可存在於細胞培養上清液、血漿、血清、唾液、尿液、羊水和惡性腹水以及其它生物體液中；其攜帶有母細胞的多種蛋白質、脂類、dna和rna等重要信息，在細胞-細胞間的物質和信息傳遞中起重要作用。

各種不同細胞來源的外泌體參與了重要的生理和病理過程，如抗原呈遞、遺傳物質交換、免疫反應、血管生成、炎症、腫瘤轉移和處理，病原菌或癌基因傳播。這些功能都依賴於外泌體的內容物，尤其是蛋白質和rna。

現有研究已證明間充質幹細胞分泌的外泌體在促進皮膚損傷修復、減輕炎症反應、促進血管再生等方面有重要作用。

相關研究認為人臍帶間充質幹細胞的外泌體介導wnt4信號通路，參與皮膚創傷修復。在小鼠體內，人臍帶間充質幹細胞介導的wnt/b-連環蛋白活性在上皮形成和細胞增殖中發揮重要作用。當人臍帶間充質幹細胞的外泌體wnt4敲除後，b-連環蛋白活性消失，在體內的皮膚修復療效明顯下降。說明幹細胞對皮膚修復是通過外泌體發揮作用的。

解放軍總醫院的韓衛東等用內毒素預處理間充質幹細胞增強其旁分泌作用，增加了幹細胞的營養支持和再生修復性能。研究發現，間充質幹細胞通過釋放大量的外泌體，來構建一個穩態的組織修復的微環境，從而消除炎症反應，促進傷口癒合。

血液學研究所等人研究，人骨髓間充質幹細胞的外泌體具有免疫調節功能與支持血管形成的作用。正常人骨髓間充質幹細胞分泌的外泌體可抑制人外周血單個核細胞分泌ifn-γ，內含有免疫相關microrna如mir301、mir22和mir-let-7a等，能促進人臍靜脈內皮細胞網狀結構形成和血管形成。血管新生是內皮細胞發生增殖和遊走形成小血管的過程，k562細胞來源的外泌體mir-92可促進人臍靜脈血管內皮細胞細胞的遊走和管狀結構形成，從而促進血管新生。如果外泌體能作用於人的肌膚促進血管生成，就會對皮膚輸送營養，運輸代謝廢物，使得皮膚年輕化。

韓國科學家研究，脂肪幹細胞及其分泌因子對紫外線誘導的皺紋具有除皺效果，並且除皺效果主要是通過減少中波紫外線b誘導的細胞凋亡和促進人成纖維細胞合成膠原蛋白達到的。

近年隨著對皮膚美白的追求，越來越多的人使用美白護膚產品。皮膚中的黑色素由黑色素細胞合成，黑素通過滲透作用向相鄰細胞擴散，在皮膚上形成顏色。顏色的深淺主要是由皮膚中黑色素的含量決定。黑素細胞內發生的生化反應過程：脂肪酸酪氨酸在酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，其在酶或非酶的氧化作用下，經紅色素及無色色素轉變為黑色素，此過程即為黑色素的主要成因。因此，阻礙或抑制該反應第一階段中酪氨酸酶的作用，即可抑制黑素生成，探求能夠阻礙或抑制酪氨酸酶作用的藥物，對阻止或抑制因酪氨酸酶作用而生成的黑素而言極為重要。

本發明的目的在於提供一種幹細胞產生高活性的外泌體在皮膚美白製劑中的應用。

技術實現要素：

本發明的第一技術方案為一種間充質幹細胞來源的外泌體在皮膚美白製劑中的應用。

第二技術方案基於第一技術方案，其特徵在於，所述間充質幹細胞為人胎盤間充質幹細胞。

第三技術方案基於第二技術方案，其特徵在於，所述間充質幹細胞為圍產期人臍帶或胎盤來源的間充質幹細胞。

第四技術方案基於第三技術方案，其特徵在於，所述外泌體濃度為800μg/ml以上。

第五技術方案基於第四技術方案，其特徵在於，所述皮膚美白製劑為外敷的製劑或局部注射、水光微針注射的製劑。

第六技術方案基於第五技術方案，其特徵在於，所述間充質幹細胞用以下方法製備：

取足月剖腹產胎兒的胎盤，在無菌條件下從胎盤中將絨毛膜機械分離，用pbs衝洗去除紅細胞，組織剪將絨毛膜剪成10-20mm3小的組織塊，加入膠原酶消化液，37℃附近的溫度磁力攪拌消化若干時間，取消化後的組織懸塊100目濾網過濾後，加入裝有少許1×pbs的離心管中，其剩餘組織用胰蛋白酶再次37℃附近溫度磁力攪拌消化若干時間，將消化懸浮物100目濾網過濾，收集濾液到離心管中加入血清終止消化，組織塊幾乎全被消化後離心分離，小心地棄去上清，收集離心獲得的細胞，取少許細胞樣品進行計數，以2×106/cm2接種至含10％fbs的dmem－lg培養基，在37℃附近的溫度、飽和溼度、5％co2培養箱中培養若干天后首次換液，去除未貼壁細胞，以後隔一段時間換液一次，在顯微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，達到80％～90％融合時，消化細胞進行傳代培養。

所述間充質幹細胞外泌體用以下方法製備：

取人胎盤間充質幹細胞培養的3-6代，用添加了10％胎牛血清的dmem培養基培養，待細胞融合率達到70-80％時，添加生物聚合材料，繼續培養待細胞融合率達到90％，收集上清2000g離心20min除去細胞以及碎片等，再經0.22μm無菌濾膜過濾到離心管中，加入10％終濃度的聚乙二醇8000溶液，渦旋混勻後，4℃孵育過夜，4000g離心20min，傾倒上清，用原上清1/100-1/50體積的pbs液重懸沉澱，8％終濃度的聚乙二醇再次孵育1h，pbs液重懸沉澱。分裝-80℃保存。

作為皮膚美白製劑，所獲外泌體可以用於局部注射，或添加玻尿酸等成分後用微針注射，也可以外用塗抹於皮膚。

附圖說明

圖1為cs-no組人胎盤絨毛膜間充質幹細胞的流式鑑定圖；

圖2為外泌體經10％聚丙烯醯胺凝膠電泳後的蛋白分布圖；

圖3外泌體經cd63+磁珠富集後的cd81表型鑑定圖；

圖4為外泌體包含細胞因子hgf和bfgf濃度圖；

圖5表示外泌體對細胞內黑色素含量的影響。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發明的實施方式做出詳細說明。

胎盤間充質幹細胞來源的外泌體的製備：

(1)人圍產期間充質幹細胞的分離培養與擴增：

取足月剖腹產胎兒的胎盤，在無菌條件下從胎盤中將絨毛膜機械分離。分離時注意防止有底蛻膜母體來源細胞汙染。用pbs(磷酸緩衝鹽溶液)衝洗去除紅細胞。將絨毛膜組織剪成10-20mm3小的組織塊，加入膠原酶消化液，37℃磁力攪拌消化30min。取消化後的組織懸塊用100目濾網過濾後，加入裝有少許1×pbs的離心管中。

過濾後的剩餘組織用胰蛋白酶再次37℃磁力攪拌消化30min，將消化懸浮物100目濾網過濾，收集濾液到50ml離心管中加入血清終止消化，此時組織塊幾乎全被消化。3000rpm離心15min，小心地棄去上清，收集離心獲得的細胞。取少許細胞樣品進行計數，以2×106/cm2接種至含10％fbs的dmem－lg培養基，在37℃、飽和溼度、5％co2培養箱中培養，3天後首次換液，去除未貼壁細胞，以後每3～4天換液一次，在顯微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，達到80％～90％融合時，消化細胞進行傳代培養。

(2)無外泌體血清培養基的製備

將胎牛血清於4℃，12000×g離心12小時後棄去沉澱，加入l-dmem培養基而獲得無外泌體血清培養基。

(3)製備外泌體所需的間充質幹細胞上清液

選擇處於對數生長期的增殖能力強、狀態好的第2-5代人胎盤間充質幹細胞，以較高的起始細胞濃度接種至無外泌體血清培養基(dmem培養基)培養，待培養待細胞融合率達到90％。圖1為cs-no組人胎盤絨毛膜間充質幹細胞的流式鑑定圖，細胞表型鑑定結果如圖1所示，間充質幹細胞cd73、cd90、cd105陽性，cd11b、cd19、hla-dr陰性。

收集上清2000g離心20min除去細胞以及碎片等，再經0.22μm無菌濾膜過濾到離心管中，加入10％終濃度的聚乙二醇8000溶液，渦旋混勻後，4℃12h，4000g離心20min，小心傾倒上清，1/100培養基體積的dpbs重懸沉澱，吸入1.5mlep管，再加入8％終濃度的聚乙二醇8000溶液4℃孵育1h，10000g離心10min，dpbs清洗沉澱表面，200ul重懸沉澱，分裝-80℃保存。

作為對比，以下用傳統超速離心法進行分離外泌體

傳統超速離心法：4℃，2000×g，10min除去死細胞碎片雜質，0.22um無菌濾膜過濾上清液進一步除雜質。4℃，100000×g，120min超速離心，棄上清液，加入50μlpbs洗滌一遍，再次4℃，100000×g，120min超速離心。加入50μlpbs重懸，分裝-80℃保存。

bca蛋白質試劑盒檢測以上兩種方法提取的外泌體的蛋白含量。聚乙二醇沉澱為peg，超速離心為uc。圖2為外泌體經10％聚丙烯醯胺凝膠電泳後的蛋白分布圖，如圖所示，peg沉澱法所獲得外泌體蛋白含量明顯高於超速離心組。

以下對外泌體進行分析，分析所用的外泌體均為peg沉澱法所獲得外泌體。

流式指標檢測成功分離的胎盤間充質幹細胞外泌體

採用一種包被cd63抗體的磁珠，該磁珠能與外泌體的膜表面的cd63抗原結合。cd63+磁珠200μl0.1％bsa溶液衝洗後置於磁極上1min，並丟棄上清液。除去磁極加入100μl分離純化後的外泌體4℃冰箱攪拌過夜。加入300μl0.1％bsa清洗，移液槍吹打混勻。置於磁極上1min，丟棄上清。300ul分離緩衝液懸浮。將分裝ep管中100ul0.1％bsa的pbs重懸的磁珠，分別加入2ul的cd81-pe，同時用同型igg1-pe作陰性對照。在室溫下避光孵育45-60min，不時輕輕搖勻。經流式細胞儀檢測cd81陽性表達率。

圖3外泌體經cd63+磁珠富集後的cd81表型鑑定圖，如圖所示，cd81陽性表達率為85.3％。

elisa試劑盒檢測外泌體包含細胞因子含量。

圖4為外泌體包含細胞因子hgf和bfgf濃度圖。如圖所示，用本實施方式中的方法分離得到的外泌體包含較高的肝細胞生長因子(hgf)和鹼性成纖維細胞生長因子(bfgf)。

通過流式指標檢測成功分離的圍產期間充質幹細胞，結果顯示本實施方式中的分離方法可以得到相對純的間充質幹細胞，參考國際細胞治療協會提出的間充質幹細胞表型方面的標準，cd73、cd90和cd105陽性率不低於95％；cd19、cd34、cd45、cd11b、hla-dr陽性率不高於2％；利用生物材料刺激人胎盤間充質幹細胞，能有效提高一倍以上的外泌體的產量。本實施方式中的化學沉澱法提取製備的外泌體，採用bca蛋白定量法測得其蛋白濃度高達8000-12000μg/ml，遠遠高於文獻報導的超速離心法。

通過磁珠富集後流式檢測，製備的外泌體77.3％能被cd63+磁珠富集捕獲，證明其純度很高，流式檢測對照組(exo)外泌體cd81陽性表達率為85.3％、cs-no環境下的獲得外泌體(no-exo)cd81陽性表達率89.8％。

經過凝膠蛋白電泳檢測發現，本實施方式中的化學沉澱法所獲得外泌體並沒有出現過多的雜蛋白，且exo和no-exo組蛋白分布結構並沒有發生很大變化。

胎盤間充質幹細胞分泌的外泌體美白功效評價

(1)外泌體對黑色素細胞增殖的影響

1)實驗選4-5代的黑色素細胞。取對數生長期的細胞，0.25％胰酶消化，用黑色素細胞培養基調節細胞密度為1×104/ml，100μl加入96孔培養板中，每組均重複5孔。

2)12小時後培養基稀釋外泌體成100、200、400、800、1600μg/ml的濃度，吸取原培養液棄掉，加入含不同濃度外泌體的100ul培養基加入每孔。

3)於37℃、5％co2恆溫培養箱中培養24h。

4)加入10ulcck-8溶液。

5)在細胞培養箱內繼續孵育2小時後酶聯免疫檢測儀在450nm測定吸光度。細胞存活率＝(a實驗組-a空白組)/(a對照組-a空白組)×100％。(2)外泌體對黑色素細胞內黑色素含量的影響

1)取對數期的黑色素細胞，棄去培養液，用pbs液清洗2次，24孔板培養。

2)培養12h，細胞貼壁。

3)將原來培養基移走，加入含有不同濃度外泌體的培養基。並設置對照組和空白對照組，每個濃度組設置3個復孔。於37攝氏度5％co2恆溫培養箱中培養。

4)繼續培養72h。

5)吸去培養液，pbs清洗細胞，用胰酶-edta消化細胞，將不同實驗組的細胞收集到ep管中，以1000r/min離心5min棄上清液。

6)取100μl每個處理因素下的細胞加入200ul含10％二甲基亞碸(dmso)的naoh(1mol/l)溶液裂解細胞。

7)於65攝氏度水浴20min完全溶解黑色素顆粒。

8)酶標儀檢側490nm處吸光度。黑色素形成率＝(b實驗組-b空白組)/(b對照組-b空白組)×100％。結果除以細胞數，作為評價黑色素含量高低的指標。

圖5表示外泌體對細胞內黑色素含量的影響；結果顯示：800μg/ml的人圍產期間充質幹細胞外泌體能夠抑制黑色素的合成，黑色素生成率是對照組的60％。

(3)外泌體對黑色素細胞內酪氨酸酶活性的影響

1)同步驟(2)中1)-5)。

6)各加入1％tritonx-100溶液200μl。

7)4℃下超聲波破碎細胞。

8)吸取100μl轉移至96孔板，每孔再加20μl質量分數為0.1％的左旋多巴溶液。

9)振搖5min後放入37℃培養箱孵育1h。

10)於分光光度計上測a490值。

酪氨酸活性率＝(b實驗組-b空白組)/(b對照組-b空白組)×100％。結果除以細胞數，作為評價酪氨酸酶活性高低的指標。400ug/ml的外秘體能較好抑制酪氨酸活性。

本實施方式中採用cck-8法測定人圍產期間充質幹細胞外泌體對人黑色素細胞生長的影響，結果顯示人圍產期間充質幹細胞外泌體在≤800μg/ml時對人黑色素細胞無明顯的抑制作用，鏡下觀察也無明顯的死亡症狀。實驗組的細胞存活率與對照組相比，都沒有出現顯著的細胞死亡，但是在外泌體濃度為800μg/ml時，能夠抑制黑色素的合成，抑制細胞內酪氨酸酶的活性，具有極佳的美白護膚潛力。

所獲外泌體可以用於局部注射，或添加玻尿酸等成分後用微針注射，也可以外用塗抹於皮膚。

本實施方式提供的方法與現有技術方法相比的積極效果如下：

(1)人臍帶、胎盤幹細胞分泌的大量的外泌體。

(2)外泌體所包含的肝細胞生長因子(hgf)和鹼性成纖維細胞生長因子(bfgf)含量增加，外泌體的活性提高。

(3)先後用10％、8％終濃度的聚乙二醇兩次沉澱提取外泌體，與傳統超速離心法相比較，提高了外泌體的產量，簡化了提取工藝。

(4)應用廣泛，既可以通過水凝膠組合物形式外敷，又可以生理鹽水局部注射。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，這種變形均應包含在本發明的保護範圍之內。