與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記SV3的製作方法
2023-07-08 06:17:51
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種分子標記，特別是涉及一種與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記。本發明還涉及擴增該分子標記的引物、該分子標記和引物在水稻抗白葉枯病基因定位或水稻遺傳育種中的用途。
背景技術：
：水稻(Oryzasativa)是我國最重要的糧食作物之一，稻穀是我國60％以上人口的主食。因此，水稻生產水平的提高一直是關係我國農業發展和民生安定的重大問題。水稻白葉枯病是一種世界性的重要病害。它是一種維管束病害，在自然條件下，病菌通常由水孔或傷口侵入，沿葉脈產生白色病斑。白葉枯病發生時可導致水稻減產20％～30％，嚴重時甚至絕收。為保證水稻高產、穩產，人們主要採用兩種防治技術，一是用化學防治方法，二是培育和種植抗病品種。由於化學防治成本高且汙染環境，因此培育和種植抗病品種成為水稻育種的主要目標。傳統抗病育種是根據分離群體的表現和育種者的經驗進行選擇，通常受環境條件、顯隱性關係、基因上位等因素的影響，費時、費力、不準確，從鑑定一個植物抗病種到培育出抗病良種需花費十多年時間，而病原菌一旦侵襲，其擴散速度要比育種速度快得多。近年來生物技術的發展，尤其是分子標記技術的應用給水稻遺傳育種帶來了巨大變化。分子標記輔助選擇為育種者提供了對目標性狀進行選擇的有效手段，它大大加速了育種進程，提高了育種選擇效率，同時減少了盲目選擇和人力、物力的大量浪費，展示出極其廣闊的應用前景。目前已鑑定的抗白葉枯病基因達30多個，來自長藥野生稻(Oryzalongistaminata)的廣譜抗白葉枯病Xa21基因和普通野生稻O.rufipogon的全生育期抗白葉枯病Xa23基因備受關注。目前，雖然已經定位了一些與水稻抗白葉枯病相關的基因和QTLs，但由於水稻抗白葉枯病的遺傳機制較複雜，仍然缺乏足夠數量的與抗白葉枯病相關的QTLs及分子標記。隨著基因組學和生物信息的發展，通過基因組測序，開發與抗白葉枯病緊密連鎖的SV標記，將為水稻的遺傳研究及育種開闢新的思路和方法。技術實現要素：本發明的目的是提供一種與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記。本發明的另一目的是提供一種可用於擴增與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記的引物對。本發明的另一目的是提供一種篩選水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記的方法，其特徵在於：1)獲得純合型父本、母本基因組；2)分別測序獲得父本、母本基因組序列；3)比較父本、母本基因組序列，獲得差異位點；4)構建遺傳群體並收集表型數據；5)對群體中的個體進行基因型分析；6)結合基因型和表型數據，將目標基因定位在基因組上；7)在靠近目標基因的區段選擇候選的分子標記。對篩選的水稻抗白葉枯病分子標記進一步做多態性及穩定性鑑定：在篩選的分子標記的上下遊設計引物，進行PCR擴增，通過條帶的不同進行多態性判斷；利用重組自交系進行穩定性驗證。本發明的目的還包括一種水稻抗白葉枯病緊密連鎖的分子標記的檢測方法，包括步驟：在分子標記的核苷酸序列的上下遊設計引物；以被檢測水稻基因組DNA為模板進行擴增；判斷擴增產物中是否存在該分子標記。本發明的目的還包括提供一種包括上述分子標記的重組載體，以及含有該重組載體的重組細胞。本發明的目的目的還包括提供上述分子標記在水稻抗白葉枯病基因定位、檢測以及水稻輔助育種中的用途以及上述分子標記的檢測方法。為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案：本發明公開了一種與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記， 所述分子標記包含SeqIDNo.1所示序列；優選的所述分子標記具有SeqIDNo.1所示序列。本發明還公開了一種用於擴增與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記的引物對，所述引物對擴增的目標序列SeqIDNo.1所示序列。具體地，所述引物對的引物1包含SeqIDNo.2所示序列，引物2包含SeqIDNo.3所示序列；更具體地，所述引物1具有SeqIDNo.2所示序列，引物2具有SeqIDNo.3所示序列；本發明公開了一種篩選權利要求水稻抗白葉枯病分子標記的方法，其特徵在於：1)獲得純合型父本、母本基因組；2)分別測序獲得父本、母本基因組序列；3)比較父本、母本基因組系列，獲得差異位點；4)構建遺傳群體並收集表型數據；5)對群體中的個體進行基因型分析；6)結合基因型和表型數據，將目標基因定位在基因組上；7)在靠近目標基因的區段選擇候選的分子標記。對篩選的水稻抗白葉枯病分子標記進一步做多態性及穩定性鑑定：在篩選的分子標記的上下遊設計引物，進行PCR擴增，通過條帶的不同進行多態性判斷；利用重組自交系進行穩定性驗證。為了進一步驗證抗白葉枯病這種表型與分子標記間的對應關係，公開了水稻白葉枯病菌接種實驗結果。本發明還公開了一種與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記，所述分子標記是由上述的引物對以抗白葉枯病的水稻基因組DNA為模板經PCR擴增得到的。本發明還公開了一種與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記檢測方法，包括步驟：在分子標記SeqIDNo.1的核苷酸序列上下遊設計引物，以被檢測水稻基因組DNA為模板進行擴增，利用相同的引物對擴增的結果中抗白葉枯病的水稻比不抗白葉枯病的擴增分子大382bp，此分子大小為分子標記的大小。利用優選的引物SeqIDNo.2，SeqIDNo.3擴增抗白葉枯病的水稻與不抗白葉枯病的水稻基因組，擴增產物的大小分別為985bp、603bp。在本發明的一個實施方案中，公開了用3730測序儀對各擴增產物進行測序驗證的方法，所以本領域技術人員可理解，為了檢測SeqIDNo.1分子標記，在進行PCR擴增後可用電泳檢測也可利用測序的方法進行檢測。本領域的技術人員可以理解，檢測分子標記序列是否 存在的方法不局限於PCR凝膠電泳、測序，螢光定量PCR等方法亦可進行目標序列檢測。本領域的技術人員也可以理解，檢測目標序列的引物設計不局限與給出的引物序列，在目標序列的上下遊設計引物進行PCR擴增，能達到凝膠電泳檢測、或者測序或者螢光定量PCR檢測的目的即可。本發明還公開了一種載體，其含有本發明的分子標記。所述載體可以是插入有本發明的分子標記的表達重組載體或者克隆重組載體。獲得上述重組載體後，本領域技術人員可以理解，含有分子標記的片段的大小隨著引物設計位置的不同而不同，同時本領域技術人員可以理解，根據不同的需要，將重組載體轉化到合適的細胞中，得到含有該重組載體的重組細胞。因此，本發明還公開了一種含有所述重組載體的重組細胞。在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的SeqIDNo.1的5』端和/或3』端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術語「可操作地」在本發明中定義為一種如下構象，在該構象中，控制序列例如啟動子被適當地置於SeqIDNo.1的一個位置上，以致該控制序列指導SeqIDNo.1編碼的多肽的產生。在本發明的一個實施方案中，所述分子標記包含SeqIDNo.1所示序列以及SeqIDNo.1的5』端和/或3』端的上下遊序列。本領域技術人員可以理解，只要擴增或者檢測抗白葉枯病的水稻基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增得到含有SeqIDNo.1所示的序列。SeqIDNo.1的5』端和/或3』端的上下遊序列的長度為適當長度，並不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小於10,000bp、小於5,000bp、小於2,000bp、小於1,500bp、小於1,200bp、小於1,000bp、或者小於800bp。本發明還公開了所述分子標記的製備方法，包括下述步驟：使用抗白葉枯病的水稻的基因組DNA作為模板，以SeqIDNo.2和SeqIDNo.3引物對進行PCR擴增，得到的985bp擴增產物即含有所述分子標記；優選地，還包括將PCR擴增產物進行純化的步驟。本領域的技 術人員可理解含有分子的標記的PCR產物大小隨引物設計位置的改變而改變。對本領域技術人員而言，可以理解，也可以DNA化學合成的方法得到本發明的分子標記。本發明還公開了所述的分子標記在水稻抗白葉枯病基因定位或檢測中的用途。本發明還公開了一種水稻抗白葉枯病基因定位的方法，所述方法包括使用本發明的分子標記的步驟。本發明還公開了所述的分子標記在水稻輔助育種中的用途。本發明還公開了一種水稻輔助育種方法，所述方法包括檢測本發明的分子標記或分子標記引物對的步驟。本發明的分子標記可用於今後的分子標記輔助育種中，本領域技術人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發明的分子標記來篩選水稻是否含有抗白葉枯病基因。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發明的分子標記的引物對。所述檢測還可以通過測序方法進行。該水稻輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優點。在本發明中，具體地，所述水稻為801，抗白葉枯病；R15，不抗白葉枯病。801和R15的雜交後代為F1。F1代通過單粒傳法得到的重組自交係為RIL群體，即F7代。有益效果本發明提供了與水稻抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記將基因組DNA序列與水稻抗白葉枯病基因聯繫起來，有利於水稻分子標記輔助育種體系的建立；所述分子標記與水稻抗白葉枯病基因的遺傳緊密連鎖距離為0.5cM。本發明的分子標記及分子標記擴增引物可以簡便、快速、高通量地應用於水稻育種實踐和資源及品種鑑定。附圖說明圖1：利用分子標記引物(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)對父 母本和RIL群體188個水稻單株進行PCR擴增的擴增產物的部分電泳結果圖。其中：泳道1－5為RIL群體中5株抗白葉枯病的水稻單株的PCR擴增產物；泳道7－11為RIL群體中5株不抗白葉枯病的水稻單株的PCR擴增產物。泳道6為marker，其為2000bpDNALadder；其分子量包括：、2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp以及100bp。術語如本文所用，分子標記(MolecularMarkers)是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段，是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。具體實施方式下面通過具體實施例並結合附圖對本發明作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例中未註明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，例如可以採購自Illumina公司。實施例1：水稻RIL群體的構建水稻種子購自：深圳華大農業與循環經濟科技有限公司。父本：801，抗白葉枯病；母本：R15，不抗白葉枯病；父本和母本雜交得到F1代；F1代通過單粒傳代法得到188個重組自交系RIL群體(F7代)。實施例2：水稻白葉枯病菌接種鑑定選用湖南省水稻白葉枯病菌優勢致病型IV型菌的代表菌株(由湖南雜交水稻研究中心贈送)。將菌株用脅本哲氏馬鈴薯半合成培養基28℃恆溫下培養72小時，用無菌水洗下菌苔，用麥式比濁法將細菌懸液稀釋至108～109細胞/亳升菌液。培養基配方：馬鈴薯300克，蔗糖15克，蛋白腖5克，Ca(NO3)2.4H2O0.5克，Na2HPO4.12H2O2.0克，瓊脂粉16克，蒸餾水調至1000亳升。針對實施例1中獲得的RIL群體，在植株苗期採用人工剪葉接種法進行接種，接種後14～20d，待感病品種病情趨於穩定時調查，用病斑面積佔葉片面積的百分率作為抗感反應參數。本試驗以15％為抗感界限，>15％為感病，10％～15％為抗病，<10％為高抗。接種結果：雙親與RIL群體的抗病性表現白葉枯病菌菌液接種20d後，父本801的平均病斑長度為4.3cm，對白葉枯病表現為抗性反應。母本R15的平均病斑長度達到22.4cm，是典型的感病反應。188個重組自交系接種後，其葉片的病斑長度從最短2.8cm至最長23.6cm，在群體內呈連續的正態分布，其平均值為6.13cm，雙向的超親分離極其明顯，並且分布區間廣泛，表現出數量性狀的遺傳特點。根據接種結果將RIL群體分為抗白葉枯病和不抗白葉枯病單株。實施例3：基因組DNA的提取用CTAB法分別提取父本、母本、F1代及RIL群體單株的基因組DNA，具體方法如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨後加入3mL1.5×CTAB，研磨成勻漿轉入15mL的離心管中，然後往研缽中加入1mL1.5×CTAB衝洗再轉入離心管中。混勻後於65℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB15g1mol/L的Tris.Cl(pH為75mL8.0)0.5mol/L的EDTA30mLNaCl61.4g加去離子水定容至1L，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕混勻，至下層液變為深綠色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15mL離心管，加2倍體積預冷的無水乙醇，混合靜止5min。於-20℃放置30min沉澱DNA。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1mL75％乙醇洗滌沉澱1次，倒置離心管幹燥DNA，加入200μLTE溶解DNA。(5)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA。(6)將得到的父本、母本、F1代及RIL群體單株的基因組DNA存於-20℃備用。實施例4：遺傳圖譜構建、基因定位和分子標記開發(1)遺傳圖譜構建針對實施例3中獲得的RIL個體的基因組DNA，利用RAD-seq(http://www.bioon.com.cn/server/show_product.asp？id＝12291)的基因分型技術對RIL群體的個體進行基因分型，獲得RIL群體的基因型數據。用MapMaker3.0軟體(ConstructinggeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0，SLincoln,MDaly,ELander-Cambridge,MA:WhiteheadInstitute,1992)進行遺傳連鎖圖譜繪製，得到遺傳連鎖圖。(2)基因定位針對實施例2中RIL群體，將個體表型與父本型性狀相似的記為a，與母本型性狀相似的記為b，性狀居於父本和母本之間的記為h。得到全部個體的表型數據，將個體的表型數據與之前得到的基因型數據進行比較，從而將水稻抗白葉枯病基因定位在遺傳連鎖圖譜上。結 果顯示，水稻抗白葉枯病基因定位在11號染色體20802924bp至20806518bp區間內，長度約為3594bp。(3)分子標記開發將父本和母本分別進行全基因組重測序(10X)，然後根據RAD-seq的測序結果，利用SOAP軟體(http://soap.genomics.org.cn/，也可以使用其它的序列比對軟體)比對測序reads，然後用SOAPsv(http://soap.genomics.org.cn/)尋找父母本基因組片段序列差異較大的作為分子標記，便於用凝膠電泳區分鑑別。選擇靠近水稻抗白葉枯病基因所在區段的382bp差異序列作為候選分子標記SV3，核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。SeqIDNo.1：AGAGATGAGAGTGATCAGCTATGTACTGACTGCTTAAGAGTATATAGATGCAAGAGATGAAGGGCCTGTTCACTTTGATGCCATTTTCAACCTTACCAAATTTTAGTAAAGTTGCTAAAAAAATGGCTATATTTAGTTTGCTGTCAAATTTTGGTAACTATATAAGAAATCCTGCCAAAATTTTGATAACTATGCCAAAATTTGGTAAGGTTTTTTTTTGGCATCAAAGTGAACAGGCCCGAAAACTATATGATTGTATAAATTGCTACATTGCTTGCCTACCGGCAAGATTGGAGTGATCAAGGTTTATAACCACAGAACAGTAGTGAACAGTCAGGGTTGCACAATTGCACTTGTCTTTCACAACAAATGCAGATAAAAA(382bp)實施例5：候選分子標記驗證對實施例4中確定的水稻抗白葉枯病候選分子標記SV3(SEQIDNO：1所示的核酸序列)進行驗證，具體如下：針對上述候選分子標記設計引物，引物序列如下所示：正向引物:5』-GCTTGTGCACAGCCACTTTG-3』(SEQIDNO:2)；反向引物:5』-GCATGCGGGTTGTTTTGATT-3』(SEQIDNO:3)。利用上述引物，通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗證該候選分子標記的多態性和擴增穩定性。具體地，以實施例3中提取的父本、母本、RIL群體單株的基因 組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，其中，PCR反應體系如下：PCR反應程序如下：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環；最後72℃延伸3分鐘。PCR擴增產物經純化後於4℃下保存。接著，取部分PCR擴增產物，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。如圖1所示，抗白葉枯病的單株均擴增出985bp的條帶，不抗白葉枯病的單株均擴增出603bp的條帶。然後，利用3730測序儀對各擴增產物進行測序，結果，父本及RIL群體中抗白葉枯病的單株擴增條帶，與母本及RIL群體中不抗白葉枯病的單株擴增條帶相比增加了382bp的序列(核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)，即為候選分子標記SV3。由此，證明該候選分子標記SV3在父母本之間具有多態性，該候選分子標記與水稻抗白葉枯病性狀緊密相關，且具有與抗白葉枯病基因連鎖遺傳的穩定性。候選分子標記具有多態性、與抗白葉枯病基因連鎖遺傳的穩定性，所以該候選分子標記可作為抗白葉枯病基因的分子標記使用。多態性指的是：分子標記在抗白葉枯和不抗白葉枯病水稻基因組中的序列不同，可以區分。實施例6：分子標記的製備以實施例3中提取的父本基因組或RIL群體中抗水稻白葉枯病的單株的基因組DNA為模板，利用實施例5中的引物對進行PCR擴增。PCR反應體系如下：無菌水20.2μl10*Buffer(含Mg2+)2.5μldNTPs(25mM)0.15μlTaq酶(5U/μl)0.15μl正向引物0.5μl反向引物0.5μl模板1.0μl總體積25μlPCR反應程序如下：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環；最後72℃延伸3分鐘。PCR擴增產物經純化後於4℃下保存。將擴增產物純化，得到985bp的含有分子標記的核苷酸序列。純化後進行測序，結果如SEQIDNO：4所示。所述擴增產物(如SEQIDNO：4所示序列)包含SeqIDNo.1所示序列以及SeqIDNo.1的5』端和/或3』端的上下遊序列。本領域技術人員可以理解，只要擴增或者檢測抗白葉枯病的水稻基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增得到含有SeqIDNo.1所示的序列。SeqIDNo.1的5』端和/或3』端的上下遊序列的長度為適當長度，並不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小於10,000bp、小於5,000bp、小於2,000bp、小於1,500bp、小於1,200bp、小於1,000bp、或者小於800bp。所述分子標記(含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的DNA片段)所包含的SeqIDNo.1的5』端和/或3』端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序 列等等。其中，術語「可操作地」在本發明中定義為一種如下構象，在該構象中，控制序列例如啟動子被適當地置於SeqIDNo.1的一個位置上，以致該控制序列指導SeqIDNo.1編碼的多肽的產生。對本領域技術人員而言，可以理解，也可以通過DNA化學合成的方法得到該分子標記。SEQIDNO：4GCTTGTGCACAGCCACTTTGTCAGGTAGACATCATCAGCAGATAGCTCATATGGCAAGTTTTGTGATGAGTACCAATTGACCTGAAATTCAACTTGAATTGTAAGATGTTAATCTAGTCATGGTAAGGTAACTCTGTACCAGGATTGTTAACAGAAAACATGTATGGTGAACTTTGTGAAGTTCATACCATGAGCTTAACTTTGTCAGACTCTTTTAACTTGCTGCCCAAACACAGACAGGTCATGATTGAGGACAGTTTGTTAAGAGTACAAATTCAGCCACTTTGAGTGATCAGCTATGTACTGACTGCTTAAGAGTATATAGATGCAAGAGATGAGAGTGATCAGCTATGTACTGACTGCTTAAGAGTATATAGATGCAAGAGATGAAGGGCCTGTTCACTTTGATGCCATTTTCAACCTTACCAAATTTTAGTAAAGTTGCTAAAAAAATGGCTATATTTAGTTTGCTGTCAAATTTTGGTAACTATATAAGAAATCCTGCCAAAATTTTGATAACTATGCCAAAATTTGGTAAGGTTTTTTTTTGGCATCAAAGTGAACAGGCCCGAAAACTATATGATTGTATAAATTGCTACATTGCTTGCCTACCGGCAAGATTGGAGTGATCAAGGTTTATAACCACAGAACAGTAGTGAACAGTCAGGGTTGCACAATTGCACTTGTCTTTCACAACAAATGCAGATAAAAACGCAGGCCAACACAACGAGAACTTCAGGTCCAGAAAGGCCAACTCCATTATATGCTTCAAAACCTAAACAAGTCAATATCTGTACTACGCAGTAAGCACCTGCATCAGCACTCAGCAGCGCTTCAAGTAGTTCACACTTGCAGACGACCTTATACCCATCAGAACCAAATAGAGTATATACTTAGTCAGCATATCTTAGGATTCTAACTAGGCATCAGCAGATAGCATAGAACAACACCAACACTAAATTGTCAATCAAAACAACCCGCATGC其中兩端加粗斜體部分(各20bp)為引物設計區段，中間加粗斜體部分(382bp)為分子標記SV3序列(即SEQIDNO：1)。實施例7：分子標記克隆將實施例6中擴增獲得的985bp的片段克隆到pMD18-T載體中，獲得重組載體。將該重組載體轉化到大腸桿菌JM109中，挑單克隆，培養獲得重組細胞。從重組細胞中提取質粒，所述質粒即重組載體，採用M13通用引物(序列信息參考TaKaRa商品目錄)對克隆片段進行測序，結果顯示，重組載體中含有本發明的分子標記(SeqIDNo.1)。上述克隆、轉化、培養、質粒提取等步驟參考《分子克隆實驗指南第三版》，黃培堂等譯，科學出版社2002年9月出版。以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3